Спосіб індивідуального підходу до режиму дозування варфарину при проведенні антикоагулянтної терапії

Реферат: Спосіб індивідуального підходу до режиму дозування варфарину при проведенні антикоагулянтної терапії включає проведення молекулярно-генетичного дослідження. Проводять дослідження алельних варіантів *2 та *3 гена CYP2C9 і при наявності нефункціональних алелів роблять висновок про зниження біотрансформації варфарину та необхідність редукції доз препарату. UA 90521 U (54) СПОСІБ ІНДИВІДУАЛЬНОГО ПІДХОДУ ДО РЕЖИМУ ДОЗУВАННЯ ВАРФАРИНУ ПРИ ПРОВЕДЕННІ АНТИКОАГУЛЯНТНОЇ ТЕРАПІЇ UA 90521 U UA 90521 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до молекулярної генетики і кардіології та може бути використана для індивідуалізованого підбору дози варфарину при проведенні антикоагулянтної терапії. Відмічається різна чутливість пацієнтів до дії варфарину та виникнення геморагічних ускладнень при його передозуванні. Тому дослідження факторів, що визначають індивідуальну чутливість до варфарину є актуальним. Згідно з даними літератури, загальна характеристика пацієнта (вік, раса, стать, площа поверхні тіла) та середовищні фактори (надходження вітаміну К з їжею, одночасний прийом лікарських препаратів інших груп) пояснюють лише 12-20 % варіабельності дії терапевтичної дози варфарину, а 35-45 % припадає на генетичні фактори. Відомі способи індивідуального підходу до режиму дозування варфарину при проведенні антикоагулянтної терапії: спосіб оптимізації проведення антикоагулянтної терапії шляхом визначення рівнів антикоагулянту в крові пацієнта [Пат. №2002/019935 А1, WO, ПМК А6ЇВ 17/00, А61В17/00, Опубл. 14.03.2002], спосіб використання спеціальних програм для визначення дози антикоагулянтів та електронної системи медичної документації при проведенні терапії [Пат. № 2009/0216561А1, US, МПК G06Q50/00, Опубл. 27.08.2009], спосіб вимірювань ступеня коагуляції крові за допомогою спеціального індивідуального датчика для розрахунків наступної дози антикоагулянту [Пат. №202005005895, DE, МПК A6U7/04, A61J7/00, Опубл. 16.06.2005]. Недоліками вищезазначених методів є їх трудоємність, висока вартість досліджень, потреба в спеціалістах, що мають високу кваліфікацію, а також те, що зазначені методи мають проводитись з певною періодичністю при антикоагулянтній терапії. Найбільш близьким до запропонованого, а тому прийнятий нами за найближчий аналог, є спосіб оптимізації проведення антикоагулянтної терапії та попередження ускладнень з урахуванням поліморфізмів генів [Пат. №2009/052160, WO, МПК C12Q1/68, Опубл. 23.04.2009], що включає проведення молекулярно-генетичного дослідження поліморфізму гена CYP4F2. Спільними ознаками запропонованого способу та найближчого аналога є дослідження поліморфних варіантів генів для індивідуалізованого підходу до дозування варфарину. Серед недоліків вибраного найближчого аналога можна назвати необхідність витрачати великі кошти для проведення досліджень поліморфізму гена CYP4F2, а також те, що поліморфізм гена CYP4F2, вносить менший вклад у варіабельність дії дози варфарину, на відміну від поліморфізму гена CYP2C9. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб індивідуального підходу до режиму дозування варфарину при проведенні антикоагулянтної терапії шляхом визначення генотипів за алельними варіантами *2 та *3 гена CYP2C9. Проведення даного дослідження можливе ще до початку антикоагулянтної терапії, що дозволить виявити групу пацієнтів, які потребують меншої добової дози варфарину для досягнення та підтримання терапевтичного рівня міжнародного нормалізованого відношення (МНВ). Поставлена задача вирішується тим, що в способі, який включає проведення молекулярногенетичного дослідження, згідно з даною корисною моделлю, проводять дослідження алельних варіантів *2 та *3 гена CYP2C9 і при наявності нефункціональних алелів роблять висновок про зниження біотрансформації варфарину та необхідність редукції доз препарату. Спосіб здійснюється наступним чином Як матеріал для аналізу використовують периферичну кров або зішкряб зі щоки. Виділення ДНК із біоматеріалу проводиться хлорфенольним методом або із використанням комерційного комплекту реагентів для виділення ДНК (не є предметом данного патенту). Генотипування за алельними варіантами *2 та *3 гена CYP2C9 проводять з використанням методу алель-специфічного 5'-нуклеазного аналізу на приладі Applied Biosystems 2700 (Applied Biosystems, Великобританія). Послідовність праймерів для проведення полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР) наведено в таблиці 1. Таблиця 1 Праймери для проведення ПЛР Ген (поліморфний варіант) CYP2C9*2 (С430Т) CYP2C9*3 (А1075С) Послідовність олігонуклеотидних праймерів(5’ – 3’) wild-type reverse 5-CGGGCTTCCTCTTGAGCACG-3 mutant reverse 5-ACAAGGCAGTTTGCTTCCTCTTGAATACA-3 common forward 5-CAATGGAAAGAAATGGAAGGAGGT-3 wild-type forward 5-TGCACGAGGTCC AGAGTTACA-3 mutant forward 5-ATGCTGTGGAAAACGAGGTCCAGAGAAACC-3 common reverse 5-AATGATACTATGCATTTGGGACTTCGA-3 1 Розмір ампліконів п.н. 105 п.н. + 114 п.н. 159 п.н. + 168 п.н. UA 90521 U 5 10 15 20 Умови проведення ПЛР: денатурація ДНК протягом 1 хв при 95 °C; 35 циклів: плавлення 94 °C - 40 сек., відпал 58 °C - 40 сек., синтез 72 °C - 40 сек.; пролонгований синтез 72 °C - 2 хв. Детекцію продуктів ампліфікації проводять в 2,5 % агарозному гелі, що містить 18 мкл етидію броміду. Візуалізацію результатів здійснюють в ультрафіолетовому світлі за допомогою відеосистеми для документування гелів. Довжини фрагментів аналізують шляхом порівняння з ДНК-маркером (DNA Ladder). При дослідженні CYP2C9*2 при наявності фрагмента ДНК розміром 105 пар нуклеотидів (п.н.) відмічають генотип *1/*1, при наявності двох фрагментів довжиною 105 п.н. та 114 п.н. - генотип * 1/*2, при наявності фрагмента довжиною 114 п.н. генотип *2/*2. При дослідженні CYP2C9*3 при наявності фрагмента ДНК розміром 159 п.н. відмічають генотип *1/*1, при наявності двох фрагментів довжиною 159 п.н. та 168 п.н. - генотип *1/*3, а при наявності фрагмента довжиною 168 п.н. - генотип *3/*3. При наявності нефункціональних алелів *2 та *3 роблять висновок про зниження біотрансформації варфарину у пацієнта та необхідність редукції доз препарату. Запропонованим способом було проведено обстеження 155 пацієнтів, які перенесли операцію протезування серцевих клапанів та отримували антикоагулянтну терапію. Згідно з інструкцією, стартова доза варфарину складала 5 мг/добу. Підбір дози варфарину здійснювався до досягнення рекомендованих цільових значень рівня МНВ від 2,5 до 3,5. Формування бази даних і статистичні розрахунки здійснювались з використанням програмних пакетів Statistica 10.0 та MS Exsel 2003. Для порівняння величин доз у пацієнтів з генотипами *1*1, *1*2, *1*3, *2*2, *2*3, *3*3 за алельними варіантами *2 та *3 гена CYP2C9 використовували критерій Стьюдента. Статистично достовірними вважали відмінності при р0,05). Пацієнти з генотипом *1*2 мали статистично достовірно більшу середню підібрану дозу варфарину, ніж пацієнти з генотипом *1*3 та *2*3. Найнижча підібрана середня доза варфарину була у пацієнтів з генотипом *2*3 та статистично достовірно відрізнялась від величини дози у осіб з генотипом *1*3. Для пацієнта з генотипом *3*3 підібрана доза варфарину була в чотири рази нижче від стандартної. Клінічний приклад. Пацієнтка С, 63 роки. Після проведеної операції протезування серцевого клапана було призначено варфарин в стандартній дозі 5 мг на добу. Вихідний рівень МНВ 1,15. На третю добу прийому препарату був зафіксований рівень МНВ 6,12, надмірна гіпокоагуляція крові утримувалась протягом 3-х днів, що потребувало відміни препарату. За весь період підбору дози значення рівня МНВ виходили за межі терапевтичного діапазону 8 разів. Підібрана доза варфарину при МНВ 3,2 склала 0,625 мг на добу. За результатами молекулярно-генетичного дослідження у пацієнтки встановлено генотип *2*3 гена CYP2C9. Підбір дози варфарину пацієнтці С з генотипом *2*3 гена CYP2C9 представлено на фігурі. Технічним результатом, що досягається запропонованим способом є індивідуальний підхід до режиму дозування варфарину при проведенні антикоагулянтної терапії для носіїв нефункціональних алелів *2 та *3 гена CYP2C9, що дозволяє сформувати групи пацієнтів зі зниженою біотрансформацією варфарину, які потребують менших доз варфарину для проведення ефективної та безпечної профілактики тромбозів. Пацієнтам з генотипом *1*3 можна рекомендувати розпочинати терапію варфарином у дозі 2,5 мг на добу, пацієнтам з генотипом *3*3 - у дозі 1,25 мг на добу, а пацієнтам з генотипом *2*3 - у дозі 0,625 мг на добу. 2 UA 90521 U Запропонований авторами спосіб є інформативним, проводиться один раз за життя пацієнта, та не вимагає великих коштів. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб індивідуального підходу до режиму дозування варфарину при проведенні антикоагулянтної терапії, що включає проведення молекулярно-генетичного дослідження, який відрізняється тим, що проводять дослідження алельних варіантів *2 та *3 гена CYP2C9 і при наявності нефункціональних алелів роблять висновок про зниження біотрансформації варфарину та необхідність редукції доз препарату. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3