Спосіб одержання ферментного препарату супероксиддисмутази штаму fistulina hepatica fh-08

Реферат: UA 91410 U UA 91410 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до мікології та біотехнології і може бути використана на підприємствах мікробіологічної, фармацевтичної та інших галузях промисловості, де отримується та використовується фермент супероксиддисмутаза. Способи отримання цільових метаболітів є однією з найважливіших задач сучасної біотехнології [9]. Традиційно об'єктами в біотехнології слугували культури бактерій чи нижчих грибів, рослинних чи тваринних клітин. Вищі гриби тривалий час розглядались лише як продуценти плодових тіл та кормових добавок. Наприкінці XX сторіччя вищі гриби, а саме базидіоміцети, як результат численних досліджень, визнані перспективними об'єктами біотехнології в якості продуцентів біологічно активних речовин в т.ч. і ензимів [10, 11]. Fistulina hepatica (Schaeff.) Sibth. - маловідомий їстівний гриб, лігнотроф. Встановлено його антибактеріальну, противірусну, протипухлинну, імуномодулюючу активності [1, 12]. Скринінгові дослідження супероксиддисмутазної активності (SOD-activity) базидіальних грибів дозволили виявити культури - активні продуценти цього ферменту. Так максимальне значення SOD-activity серед досліджених 14 штамів 10 видів базидіоміцетів зафіксовано для шт. F. hepatica Fh-08 у культуральному фільтраті на 12 добу ферментації [4]. Супероксиддисмутаза (СОД, КФ 1.15.1.1) - фермент класу оксидоредуктаз, що має високу каталітичну активність, направлену на диспропорціювання (дисмутацію) супероксидного аніонрадикалу в кисень і пероксид водню. Інтенсивні дослідження цього ферменту, дозволили встановити широкі перспективи його застосування в медицині - як високоефективний лікарський засіб при лікуванні онкологічних захворювань, в косметології - для зменшення шкіряних дефектів, в харчовій промисловості - як консервант, та в наукових дослідженнях - з метою встановлення механізму дії прооксидантно-антиоксидантної системи захисту живих організмів [2]. Відомий спосіб отримання супероксиддисмутази з клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae, який включає руйнування клітин продуценту та виділення і очищення ферменту шляхом багатостадійної хроматографії [5]. У способі, як продуцент, використовується представник аскоміцетів, його SOD-activity не порівнюється з такою базидіальних грибів. Відомий спосіб отримання супероксиддисмутази з культури Kluyveromycls marxianus var. bulgaricus, яку вирощують на відходах молокопереробної промисловості - фільтраті молочної сироватки, збагаченої нікотиновою кислотою. Вирощування продуцента здійснюють при 35 °C [6]. У способі, як продуцент, використовується представник аскоміцетів, його SOD-activity не порівнюється з такою базидіальних грибів. Найбільш близький за технічною суттю і результатом, що досягається, є спосіб отримання ферментних препаратів пероксидази базидіоміцету Flammulina velutipes, який передбачає культивування продуценту на глюкозо-пептонному середовищі, вилучення міцелію фільтруванням, осадження ферменту сульфатом амонію при 40-60 % насиченні культурального фільтрату і 40-70 % насиченні гомогенату міцелію та очистку фракцій білків діалізом проти дистильованої води [7]. В основу корисної моделі поставлена задача розробки способу одержання ферментного препарату супероксиддисмутази штаму Fistulina hepatica Fh-08, який відрізняється від прототипу продуцентом, складом модифікованого глюкозо-пептонного середовища, визначенням рівня супероксиддисмутазної активності культурального фільтрату та міцелію, ступенем насиченості (NH4)2SO4 та додатковими етапами очищення ферментного препарату методом гель-фільтрації на гранулах молселекту G-50 та G-75. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання ферментного препарату супероксиддисмутази штаму Fistulina hepatica Fh-08 передбачає культивування продуценту на глюкозо-пептонному середовищі, відділення біомаси шляхом фільтрування, осадження ферменту з культурального фільтрату та водного екстракту попередньо зруйнованих клітин міцелію сульфатом амонію, первинне очищення фракцій білків діалізом проти дистильованої води, згідно з корисною моделлю, культивування проводять на модифікованому глюкозопептонному середовищі, осадження ферменту проводять при 80 % насиченні сульфатом амонію та очищення ферментного препарату шляхом гель-фільтрації на гранулах молселекту G-50 та G-75, після чого ензимний препарат висушують на ліофільній сушці. Запропонований спосіб є новим тому, що він не відомий з рівня техніки, ферментного препарату та об'єкта продуценту. Приклад конкретного виконання 1. Спосіб отримання ферментного препарату супероксиддисмутази штаму Fistulina hepatica Fh-08, відповідно до заявленого рішення, здійснюють наступним чином. Вирощування штаму Fistulina hepatica Fh-08 здійснюють 1 UA 91410 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 поверхневим методом в колбах об'ємом 1 або 2 літри. Колби містять 350 чи 700 мл, відповідно, стерильного модифікованого глюкозо-пептонного середовища (ГПСм) наступного складу, г/л: глюкоза 10,0 пептон 3,0 KН2РО4 0,6 K2НРО4 0,4 MgSO4 × 7H2O 0,5 СаСl2 0,05 ZnSO4 × 7H2O 0,001 казеїн 0,5 дистильована вода до 1 л. [3] Культивування проводять до набуття культурою максимальних значень SOD-activity зазвичай протягом 12 діб в термостаті при 27,5±0,5 °C. Після цього відділяють біомасу від культуральної рідини шляхом фільтрування, отримуючи культуральний фільтрат (КФ) та міцелій. Клітини міцелію піддають механічній деградації та екстрагують дистильованою водою 1:10. Фракціонування ферментів в екстракті міцелію (ЕМ) та КФ проводять шляхом розчинення сульфату амонію до 80 % насичення. Використовують цей метод завдяки великій розчинності у воді та стабілізуючій дії на білкову молекулу (NH 4)2SO4. Фракцію білка, яка утворила осад, відділюють центрифугуванням на рефрижераторній центрифузі при 5±1 °C, відцентровому прискоренні 2000 g протягом 15 хвилин. Наступним етапом проводять первинне очищення отриманої білкової фракції за допомогою діалізу проти охолодженої до 5±1 °C дистильованої води протягом 24 годин. Як напівпроникну мембрану використовують целофанову плівку з порами, які пропускають речовини молекулярною масою до М = 7000-10000. Таким чином, сульфат амонію та низькомолекулярні сполуки переходять в розчинник - дистильовану воду, а білки - в водорозчинну фазу. Для прискорення дифузії, розчинник декілька раз замінюють до повного очищення розчину білків від сульфату амонію. Завдяки осмосу, молекули розчинника частково потрапляють до дослідного розчину білків. Отримані фракції білків піддають подальшому очищенню шляхом гель-фільтрації на гранулах молселекту G-50 та G-75. Завершальним етапом, білкові розчини піддають ліофільній сушці, отримуючи таким чином ферментні препарати екстра- та інтрацелюлярного походження (ФПЕ та ФПI або ЕРE and EPI), які мають вид порошку від світло-сірого до світло-кремового забарвлення. Вихід ферментних препаратів супероксиддисмутаз становив 0,12±0,02 г/ кг сирої маси міцелію та 0,18±0,03 г/ л КФ. Визначають SOD-activity культурального фільтрату і вегетативного міцелію штаму Fistulina hepatica Fh-08 за здатністю цього ферменту інгібувати реакцію аутоокислення адреналіну в лужному середовищі, та виражали в ум. од., що відповідає 1 % пригнічення швидкості аутоокислення адреналіну під дією СОД [8]. Супероксиддисмутазна активність ферментних препаратів дорівнює: ЕРI=26,6±0,7 од/мг, ЕРE=101,6±3,5 од/мг. Таким чином, отримані результати показали, що спосіб одержання ферментного препарату супероксиддисмутази як із культурального фільтрату так і з вегетативного міцелію штаму Fistulina hepatica Fh-08 є новим та придатним для застосування в лабораторних дослідженнях та промисловому виробництві. Джерела інформації, які використані при укладанні заявки: 1. Бадалян С.Н. Антибактериальная активность культуральной жидкости некоторых базидиомицетов // С.Н. Бадалян, Н.Г. Гарибян / Современная микология России. Тез. докл. I Конгр. Микологов России. М: Национальная Академия Микологии. - 2002. - С. 249. 2. Бараненко В.В. Супероксиддисмутаза в клетках растений / В.В. Бараненко // Цитология. 2006. - Т.48, № 6. - С. 465-474. 3. Волошко Т.Є. Вплив джерел азотного живлення на активність оксидоредуктаз деяких штамів базидіоміцетів / Т.Є. Волошко, О.В. Федотов // Актуальні проблеми ботаніки та екології / Матер. міжнародної конф. молодих учених (Ужгород 19-23 вересня 2012) - Ужгород, 2012. - С. 197-198. 4. Волошко Т.Є. Скринінг штамів базидіоміцетів за активністю антиоксидантних оксидоредуктаз / Т.Є. Волошко, О.В. Федотов // Мікробіологія і біотехнологія. - Одеса, ОНУ, 2011. - № 4 (16). - С. 69-81. 5. Патент 2186848 Российской Федерации. Способ выделения супероксиддисмутазы / Соловьева Л.Я., Чурилова И.В., Княжев В.А., Калошин В.Г., Антипова Т.О., Федорова Н.М. Заявка № 2001112992/13 от 16.05.2001, кл. C12N 9/02, от 10.08.2002. 2 UA 91410 U 5 10 15 20 6. Патент 2113478 Российской Федерации. Способ получения супероксиддисмутазы / Куюмджиева-Савова А.В., Савов В.А., Давидов Е.Р., Недева Т.С., Морфова М.В., Соколов Ю.И. Заявка № 92009231/13 от 01.12.1992, кл. C12N 9/02, C12N 1/16, C12N 9/02, C12R 1/645, от 20.06.1998. 7. Патент 8739 України. Спосіб одержання ферментного препарату пероксидази Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing./ Федотов О.В. Заявка № u200501510, від 18.02.2005, кл. А01Н 15/00, C12N 9/00, C12N 1/14 (2006.01), C12R 1/645 (2006.01), Бюл. № 8/2005, від 15.08.2005 (прототип). 8. Патент 2144674 Российской Федерации. Способ определения антиоксидантной активности супероксиддисмутазы и химических соединений / Сирота Т.В. Заявка № 99103192/14, от 24.02.1999, кл. G01N 33/52, G01N 33/68, Бюл. № 1, от 20.01.2000. 9. Пирог Т.П. Загальна біотехнологія: Підручник / Т.П Пирог, О.А Ігнатова. - К.: НУХТ, 2009. 336 с. 10. Соломко Э.Ф. Перспективы использования лечебно-профилактических свойств культивируемых грибов в 21 веке / Э.Ф. Соломко, М.Л. Ломберг// Мат. наук.-практ. конф. "Нові технології при вирішенні медико-екологічних проблем". - К., 2000. - С. 84-87. 11. Jordan K. Zjawiony. Biologically Active Compounds from Aphyllophorales (Polypore) Fungi // Journal of Natural Products. - 2004. - Vol. 67. - P. 300-310. 12. Wasser S.P. Medicinal mushroom Science: History, Current Status, Future Trends, and Unsolved problems / S.P. Wasser // Int. J. Med. Mush., 2010. - 12(1). - P. 1-16. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб одержання ферментного препарату супероксиддисмутази штаму Fistulina hepatica Fh-08, що включає культивування продуценту на глюкозо-пептонному середовищі, відділення біомаси шляхом фільтрування, осадження ферменту з культурального фільтрату та водного екстракту попередньо зруйнованих клітин міцелію сульфатом амонію, первинне очищення фракцій білків діалізом проти дистильованої води, який відрізняється тим, що культивування проводять на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі, осадження ферменту проводять при 80 % насиченні сульфатом амонію та очищення ферментного препарату шляхом гель-фільтрації на гранулах молселекту G-50 та G-75, після чого ензимний препарат висушують на ліофільній сушці. Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3