Спосіб одержання ферментного препарату каталази штаму pleurotus ostreatus p-208

Реферат: UA 91411 U UA 91411 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до мікології та біотехнології і може бути використана на підприємствах мікробіологічної, фармацевтичної та інших галузях промисловості, де отримується та використовується фермент каталаза. Останнім часом в біотехнології сформувався новий напрямок - фармацевтична мікологія наука, що вивчає шляхи практичного використання грибів, в т.ч. і базидіальних [1]. Можливість синтезу позаклітинних ферментів базидіоміцетами, дає змогу використовувати їх для отримання цільових недорогих метаболітів. Крім цього, ці гриби можна культивувати на легкодоступних та відносно дешевих живильних середовищах і промислових відходах рециклічних технологій. Вищий базидіальний гриб Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm. активно використовується як сировина для виготовлення профілактичних та лікувальних медичних препаратів з широким спектром дії [2]. Скринінгові дослідження каталазної активності (CAT-activity) базидіальних грибів дозволили виявити культури - активні продуценти цього ферменту. Так, максимальне значення CAT-activity серед досліджених 14 штамів 10 видів базидіоміцетів зафіксовано для шт. Pleurotus ostreatus P-208 у культуральному фільтраті та міцелії на 12 добу ферментації [4]. Каталаза (КФ 1.11.1.6) є незамінним компонентом комплексного ферментативного захисту організму за умов окислювального стресу. Головна її функція - розщеплення пероксиду водню на воду та молекулярний кисень, а також участь у ряді окислювально-відновлювальних реакцій за участі різноманітних субстратів [7]. У зв'язку з високою каталітичною активністю ферменту та його мультифункціональністю, каталаза знайшла широке застосування в різних галузях промисловості, сільського господарства та медицині. Зокрема вона використовується в процесах деградації залишкових кількостей пероксиду водню в технологіях легкої, хімічної та харчової промисловості [11]. Фермент використовується як компонент біосенсорів для кількісного визначення вмісту пероксиду водню й етанолу [6]. Каталаза застосовується для створення поліферментних антиоксидантних препаратів, а також в клінічній діагностиці в складі диференційно-діагностичних поживних середовищ для виявлення та обліку патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів [5]. Відомий спосіб отримання каталази з еритроцитів крові людини, що включає відмивку еритроцитів донорської крові фізіологічним розчином і центрифугуванням, одночасно проводять і осадження гемоглобіну, і стабілізацію каталізу сумішшю хлороформу і пропанолу у співвідношенні 5:3, до отриманого після центрифугування супернатанту додають рівний об'єм води і розчиняють сірчанокислий амоній з розрахунку 535-540 г на 1 л екстракту до повного розчинення солі. Після формування осаду проводять центрифугування [8]. В наведеному способі використовується дефіцитний матеріал - донорська кров людини. Найбільш близьким за технічною суттю і результатом, що досягається, є спосіб отримання ферментних препаратів пероксидази базидіоміцету Flammulina velutipes, який передбачає культивування продуценту на глюкозо-пептонному середовищі, вилучення міцелію фільтруванням, осадження ферменту сульфатом амонію при 40-60 % насиченні культурального фільтрату і 40-70 % насиченні гомогенату міцелію та очистку фракцій білків діалізом проти дистильованої води [10]. В основу корисної моделі поставлена задача способу одержання ферментного препарату каталази штаму Pleurotus ostreatus P-208, який відрізняється від прототипу продуцентом, складом модифікованого глюкозо-пептонного середовища та додатковими етапами очищення ферментного препарату методом гель-фільтрації на гранулах молселекту G-50 та G-75 в результаті чого отриманий ферментний препарат має більш високий ступінь очищення. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання ферментного препарату каталази штаму Pleurotus ostreatus P-208 передбачає культивування продуценту на глюкозопептонному середовищі, відділення біомаси шляхом фільтрування, осадження ферменту з культурального фільтрату та водного екстракту попередньо зруйнованих клітин міцелію сульфатом амонію, первинне очищення фракцій білків діалізом проти дистильованої води, згідно з корисною моделлю, культивування проводять на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі, осадження ферменту проводять при 80 % насиченні сульфатом амонію та очищення ферментного препарату шляхом гель-фільтрації на гранулах молселекту G-50 та G75, після чого ензимний препарат висушують на ліофільній сушці. Запропонований спосіб є новим тому, що він не відомий з рівня техніки, ферментного препарату та об'єкта продуценту. Приклад конкретного виконання 1. Спосіб отримання ферментного препарату пероксидази штаму Pleurotus ostreatus P-208 відповідно до заявленого рішення здійснюють наступним чином. Вирощування штаму Pleurotus ostreatus P-208 здійснюють поверхневим методом в 1 UA 91411 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 колбах об'ємом 1 або 2 літри. Колби містять 350 чи 700 мл відповідно стерильного модифікованого глюкозо-пептонного середовища (ГПСм) наступного складу, г/л: глюкоза 10,0 пептон 3,0 KН2РО4 0,6 K2НРО4 0,4 MgSO4 × 7H2O 0,5 СаСl2 0,05 ZnSO4 × 7H2O 0,001 валін 0,3 дистильована вода до 1 л. [3] Культивування проводять до набуття культурою максимальних значень CAT-activity зазвичай протягом 12 діб в термостаті при 27,5±0,5 °C. Після чого, відділяють біомасу від культуральної рідини шляхом фільтрування, отримуючи культуральний фільтрат (КФ) та міцелій. Клітини міцелію піддають механічній деградації та екстрагують дистильованою водою 1:10. Фракціонування ферментів в екстракті міцелію (ЕМ) та КФ проводять шляхом розчинення сульфату амонію до 80 % насичення. Використовують цей метод завдяки великій розчинності у воді та стабілізуючій дії на білкову молекулу (NH 4)2SO4. Фракцію білка, яка утворила осад, відділяють центрифугуванням на рефрижераторній центрифузі при 5±1 °C, відцентровому прискоренні 2000 g протягом 15 хвилин. Наступним етапом проводять первинне очищення отриманої білкової фракції за допомогою діалізу проти охолодженої до 5±1 °C дистильованої води протягом 24 годин. Як напівпроникна мембрана використовують целофанову плівку з порами, які пропускають речовини молекулярною масою до М=7000-10000. Таким чином, сульфат амонію та низькомолекулярні сполуки переходять в розчинник - дистильовану воду, а білки - в водорозчинну фазу. Для прискорення дифузії, розчинник декілька раз замінюють до повного очищення розчину білків від сульфату амонію. Завдяки осмосу, молекули розчинника частково потрапляють до дослідного розчину білків. Отримані фракції білків піддають подальшому очищенню шляхом гель-фільтрації на гранулах молселекту G-50 та G-75. Завершальним етапом, білкові розчини піддають ліофільній сушці, отримуючи таким чином ферментні препарати екстра- та інтрацелюлярного походження (ФПЕ та ФПI або ЕРЕ and EPI), які мають вид порошку від світло-сірого до світло-кремового забарвлення. Вихід ферментних препаратів каталаз становив 0,18±0,02 г/кг сирої маси міцелію та 0,19±0,03 г/л КФ. Визначають CAT-activity культурального фільтрату і вегетативного міцелію штаму Pleurotus ostreatus P-208 спектрофотометричним методом, який заснований на здатності пероксиду водню утворювати з солями молібдену стійкий забарвлений комплекс [9]. Каталазна активність ферментних препаратів дорівнює: ЕРI=1010,3±10,3 мкат/мг, ЕРЕ=9181,5±293,4 мкат/мг. Таким чином, отримані результати показали, що спосіб одержання ферментного препарату каталази як з культуральної рідини так і з вегетативного міцелію штаму Pleurotus ostreatus P-208 є новим та придатним для застосування в лабораторних дослідженнях та промисловому виробництві. Джерела інформації:, які використані при укладанні заявки 1. Буценко Л.М. Технології мікробного синтезу лікарських засобів: Навч. посіб. / Л.М. Буценко, Ю.М. Пенчук, Т.П Пирог. - К.: НУХТ, 2010. - 323 с. 2. Вассер С.П. Биологические особенности лекарственных макромицетов в культуре: Сборник научных трудов в двух томах / А.С. Бухало, В.Г. Бабицкая, Н.А. Бисько, С.П. Вассер, И.А. Дудка, Н.Ю. Митропольская, О.Б. Михайлова, A.M. Негрейко, Н.Л. Поединок, Э.Ф. Соломко. - К.: Альтерпрес, 2011. - 212 с. 3. Волошко Т.Є. Вплив джерел азотного живлення на активність оксидоредуктаз деяких штамів базидіоміцетів / Т.Є. Волошко, О.В. Федотов // Актуальні проблеми ботаніки та екології / Матер. міжнародної конф. молодих учених (Ужгород 19-23 вересня 2012) - Ужгород, 2012. - С. 197-198. 4. Волошко Т.Є. Скринінг штамів базидіоміцетів за активністю антиоксидантних оксидоредуктаз / Т.Є. Волошко, О.В. Федотов // Мікробіологія і біотехнологія. - Одеса: ОНУ, 2011. - № 4 (16). - С. 69-81. 5. Гесслер Н.Н. Активность супероксиддисмутазы и каталазы у каратиноидсинтезирующих грибов Blakeslea trispora и Neurospora crassa в условиях окислительного стресса / Н.Н. Гесслер, А.В. Соколов, В.Я. Быховский, Т.А. Белозерская // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. - Т. 38, № 3. - С. 237-242. 2 UA 91411 U 5 10 15 20 25 30 6. Еремин А.Н. Кинетическая характеристика внеклеточных каталаз грибов Penicillium piceum F-648 и их вариантов, адаптированных к пероксиду водорода / А.Н. Еремин // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - Т. 38, № 4. - С. 374-380. 7. Мирошниченко О.С. Биогенез, физиологическая роль и свойства каталазы / О.С. Мирошниченко // Биополимеры и клетка. - 1992. - Т. 8, № 6. - С. 3-25. 8. Патент 2033170 Российской Федерации. Способ получения каталазы из эритроцитов крови человека / Благородов С.Г.; Свечникова Л.В.; Шепелев А.П.; Сазыкина О.В. Заявка № 4696379/14 от 07.06.1989, кл. А61К 35/18, C12N 9/00, от 20.04.1995. 9. Патент 39243 А України. Спосіб визначення каталазної активності базидіоміцетів / Федотов О.В., Гавриленко Г.В. Заявка № 2000116560, від 21.11.2000, кл. 7 C12N 9/58, Бюл. № 5, від 15.06.2001. 10. Патент 8739 України. Спосіб одержання ферментного препарату пероксидази Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Sing. / Федотов О.В. Заявка № u200501510, від 18.02.2005, кл. А01Н 15/00, C12N 9/00, C12N 1/14 (2006.01), C12R 1/645 (2006.01), Бюл. № 8/2005, від 15.08.2005 (прототип). 11. Amorim A.M. The application of catalase for the elimination of hydrogen peroxide residues after bleaching of cotton fabrics / A.M. Amorim // Annals of the Brasilian Academy of Sciens. - 2002. Vol. 74, № 3. - P. 433-436. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб одержання ферментного препарату каталази штаму Pleurotus ostreatus P-208, що включає культивування продуценту на глюкозо-пептонному середовищі, відділення біомаси шляхом фільтрування, осадження ферменту з культурального фільтрату та водного екстракту попередньо зруйнованих клітин міцелію сульфатом амонію, первинне очищення фракцій білків діалізом проти дистильованої води, який відрізняється тим, що культивування проводять на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі, осадження ферменту проводять при 80 % насиченні сульфатом амонію та очищення ферментного препарату шляхом гель-фільтрації на гранулах молселекту G-50 та G-75, після чого ензимний препарат висушують на ліофільній сушці. Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3