Живильне середовище для культивування штаму fomes fomentarius (l.) fr. ff-1201 – продуценту поліфенольних речовин

Реферат: Живильне середовище для культивування штаму Fomes fomentarius (L.) Fr. Ff-1201 продуценту поліфенольних речовин включає вуглецевмісний компонент, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, цинк сірчанокислий і воду. Як вуглевмісний компонент використовують манозу. UA 91412 U (54) ЖИВИЛЬНЕ СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ ШТАМУ FOMES FOMENTARIUS (L.) FR. FF1201 - ПРОДУЦЕНТУ ПОЛІФЕНОЛЬНИХ РЕЧОВИН UA 91412 U UA 91412 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до мікології та біотехнології і може бути використана у науководослідних і промислових лабораторіях для одержання поліфенольних речовин на основі культивування штамів-продуцентів. В останні роки спостерігається підвищений інтерес до пізнання різних аспектів біології та біосинтетичної активності вищих грибів відділу Basidiomycota. Це обумовлено, в першу чергу, розширенням сфери їх практичного використання. Ксилотроф трутовик звичайний Fomes fomentarius (L.) Fr. є збудником білої гнилі деревини. Цей базидіоміцет містить низку біологічно активних речовин (БАР) фізіологічної дії, що виправдовує його подальше вивчення з метою з'ясування шляхів використання [2, 12]. Поліфенольні речовини - органічні сполуки, що характеризуються присутністю у молекулі більш ніж однієї фенольної групи. До цієї гетерогенної групи входять декілька підгруп органічних речовин, в тому числі каротиноїди, поліфеноли, флавоноїди, таніни, меланіни тощо. Нормалізуючи і регулюючи основні життєві функції клітин, вони відіграють істотну роль у формуванні стресостійкості та адаптації організмів [4, 10]. Зростаючий попит на ці речовини обумовлює пошук і розширення потенційних джерел їх отримання, в тому числі, за рахунок грибних організмів [11]. Розробка способів біотехнологічного використання штамів-продуцентів має декілька етапів виділення у чисту культуру, вивчення культурально-морфологічних характеристик продуценту, підбір оптимальних умов культивування тощо. Отже, підбір компонентів живильного середовища з метою отримання певних БАР базидіоміцетів є одним з важливих етапів такої роботи [3, 8]. Відоме живильне середовище для вирощування штаму P-6v Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. - продуценту каталази, яке включає глюкозу, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, цинк сірчанокислий і воду, що додатково містить лігносульфонат при наступному співвідношенні компонентів, г/л: глюкоза - 12; пептон - 1; KН2РО4-0,8; K2НРО4-0,2; MgSO47Н2О 0,5; СаСl2-0,05; ZnSO47Н2О - 0,001; лігносульфонат - 7-10; дистильована вода - до 1 літра. Не надаються дані про можливості використання цього живильного середовища для культивування штамів-продуцентів поліфенольних речовин [5]. Відомий спосіб індукції перекисного окиснення ліпідів штаму 167 Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod., що включає культивування при 27,5 °C на глюкозо-пептонному середовищі та визначення рівня перекисного окиснення ліпідів в міцелії та культуральному фільтраті (КФ). Штам 167 культивують на модифікованому глюкозо-пептонному середовищі (ГПС) з сахарозою, яке містить компоненти у наступних концентраціях, г/л: сахароза - 8; пептон - 5; KН2РО - 0,8; K2НРО - 0,6; MgSO47Н2О - 0,5; СаСl2-0,05; ZnSO47Н2О - 0,001; дистильована вода - до 1 літра. Не надаються дані про можливості використання цього способу з метою підвищення синтезу поліфенольних речовин базидіоміцетами [6]. Найбільш близьким за технічною суттю і досяжності результату є живильне середовище для культивування штаму 167 Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod. - продуцента пероксидази, яке містить сахарозу, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, воду і цинк сірчанокислий, і додатково містить натрій хлористий при наступному співвідношенні компонентів г/л: сахароза - 12; пептон 5; KН2РО4-0,4; K2НРО4-0,2; MgSO4×7Н2О - 0,5; СаСl2-0,05; ZnSO4×7Н2О - 0,001; дистильована вода - до 1 літра. Не надаються дані про можливості використання цього живильного середовища для культивування штамів базидіоміцетів - продуцентів поліфенольних речовин [7]. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення глюкозо-пептонного середовища для вирощування штаму Fomes fomentarius Ff-1201 - продуценту поліфенолів, в якому шляхом оптимізації концентрацій компонентів досягають значного підвищення вмісту поліфенольних речовин у міцелії та культуральній рідині, яке може бути використаний в мікології та біотехнології. Поставлена задача вирішується тим, що живильне середовище для вирощування штаму Ff1201 Fomes fomentarius - продуценту поліфенолів, містить вуглецевмісну речовину, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, цинк сірчанокислий і дистильовану воду, згідно з корисною моделлю, як вуглецевмісний компонент використовують манозу при наступних співвідношеннях, г/л: маноза - 12; пептон - 5; KН2РО4-0,8; K2НРО4-0,6; MgSO47Н2О - 0,5; СаСl2-0,05; ZnSO47Н2О 0,001; дистильована вода - до 1 літра. Запропоноване живильне середовище є новим тому, що воно не відоме з рівня складу живильного середовища та об'єкта дослідження. 1 UA 91412 U 5 10 15 20 25 Приклад конкретного виконання 1. Дослідження впливу джерел вуглецевого живлення на синтез поліфенолів штамом F. fomentarius Ff-1201. При вивченні впливу джерел вуглецевого живлення на синтез поліфенолів штамом F. fomentarius Ff-1201 беруть 12 вуглецевмісних сполук: моносахариди: пентоза - арабіноза, ксилоза; гексози - глюкоза, маноза, фруктоза; олігосахариди - сахароза, лактоза, рафіноза; полісахариди - крохмаль, целюлоза; карбонові кислоти - бурштинова кислота; яблучна кислота, щавлева. Джерела вуглецевого живлення для модифікацій ГПС (ГПСм) беруть в еквіваленті за вмістом вуглецю в глюкозі. Вихідне ГПС має наступний склад, г/л: глюкоза - 10; пептон - 3; KН2РО4-0,6; K2НРО4-0,4; MgSO47Н2О - 0,5; СаСl2-0,05; ZnSO47Н2О - 0,001; дистильована вода до 1 літра [1]. Живильні середовища ГПС та ГПСм розливають по 50 мл в конічні колби Ерленмейєра на 250 мл, стерилізують в автоклаві при 121±2 °C протягом 40 хвилин. Кислотність середовищ після стерилізації становить 6,3±0,2 од. Середовища, після охолодження, інокулюють шматочками міцелію розміром 55 мм. Інокулюмом є чиста культура штаму F. fomentarius Ff-1201, яка росла 7-10 діб на 4° за Баллінгом агаризованому суслі (СА) або на картопляно-глюкозному агарі (КГА) [1]. Штам F. fomentarius Ff-1201 культивують протягом 12 днів при температурі 27,5 °C, після цього визначають його ростові показники: рН КФ і накопичення біомаси та вміст поліфенольних речовин в міцелії і КФ. Міцелій та КФ - матеріали дослідження отримують шляхом фільтрування культуральної рідини при 5±1 °C. Біомасу міцелію перераховують на абсолютно суху біомасу (АСБ) [11]. Визначення загального вмісту поліфенольних (ПФ) речовин проводять у спиртових витяжках міцелію та у КФ за модифікованою методикою Фоліна-Чокальтеу, яка базується на вимірі за допомогою спектрофотометра, наприклад СФ-26, при довжині хвилі 765 нм в кюветі 10 мм екстинкції розчинів [10]. Статистичну обробку експериментальних даних проводять за методом дисперсійного аналізу, порівняння середніх арифметичних - за методом Дункана [9]. Результати накопичення АСБ, зміни рН КФ, вмісту ПФ в міцелії та КФ при культивуванні штаму F. fomentarius Ff-1201 на різних ГПСм наведені в таблиці 1. 30 Таблиця 1 Вплив джерел вуглецевого живлення на ріст та синтез поліфенолів штаму F. fomentarius Ff-1201 Вуглецевмісні сполуки D-(+)-арабіноза D-(+)-ксилоза DL-глюкоза (контроль) D-(+)-маноза D-(+)-фруктоза D-(+)-лактоза DL-сахароза DL-рафіноза Полісахариди Крохмаль Целюлоза Бурштинова к-та Яблучна к-та АСБ, г/л рН КФ Поліфеноли, мг/г (мл) Міцелій КФ Моносахариди (пентози) 3,24±0,01 5,14 87,21±0,31 2,84±0,02* 5,38 81,19±0,07* Моносахариди (гексози) 3,21±0,11 4,98 90,01±3,19 3,89±0,14* 4,53 101,68±2,14* 3,26±0,09 4,90 93,19±0,85 Олігосахариди (дисахариди) 1,58±0,03* 5,29 66,27±0,14* 4,11±0,16* 5,03 97,52±1,12* Олігосахариди (трисахариди) 3,14±0,04 4,85 85,12±0,07* 2,26±0,08* 3,17±0,13 5,82 5,57 Карбонові кислоти 0,81±0,09* 4,48 0,54±0,01* 5,09 Примітка: "*" - достовірно порівняно з контролем 2 5,17±0,04 4,55±0,10* 5,33±0,18 6,94±0,22* 5,01±0,17 4,19±0,03* 6,08±0,33* 5,41±0,05 55,29±0,17* 94,53±2,08 3,48±0,04* 5,22±0,37 43,77±0,03* 31,12±0,02* 1,92±0,05* 1,83±0,12* UA 91412 U 5 10 Результати досліду показали, що джерела вуглецевого живлення у 66 % випадках вірогідно впливають синтез поліфенолів штаму F. fomentarius Ff-1201. Так, максимальний вміст ПФ в міцелії та КФ на рівні 101,68 мг/г та 6,94 мг/мл відповідно зафіксовано в культурах, що росли на живильному середовищі з манозою. Ці показники є в 1,12 та в 1,30 разів відповідно вище контролю. Отже, для подальшої модифікації ГПС, як вуглецевмісний компонент вибрано манозу. Приклад конкретного виконання 2. Оптимізація складу ГПС з манозою для культивування штаму F. fomentarius Ff-1201 з метою індукції синтезу поліфенольних речовин. Оптимізацію ГПС з манозою, згідно з поставленою задачею, проводять за методом повного 4 факторного експерименту (ПФЕ-2 ) [6, 7]. Варіювання (λ) вмісту у живильних середовищах манози і пептону - факторів х1, х2 складає 2 г/л, а KН2РО і K2НРО4 - факторів х3 і х4-0,2 г/л, інші компоненти мають постійну концентрацію (табл. 2.). Таблиця 2 4 Склад живильних середовищ згідно з методом ПФЕ-2 для культивування штаму F.fomentarius Ff-1201 - продуценту поліфенольних речовин Фактори № живильного середовища 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 (контроль) 15 х1 (маноза) 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 10 х2 (пептон) х3 (КН2РО) х4 (К2НРО4) Вміст у живильному середовищі, г/л 1 0,4 0,2 1 0,4 0,2 5 0,4 0,2 5 0,4 0,2 1 0,8 0,2 1 0,8 0,2 5 0,8 0,2 5 0,8 0,2 1 0,4 0,6 1 0,4 0,6 5 0,4 0,6 5 0,4 0,6 1 0,8 0,6 1 0,8 0,6 5 0,8 0,6 5 0,8 0,6 3 0,6 0,4 Взаємодія факторів 1 х1 х2 х1 × 2 х3 х1 × 3 х2 × 3 х 1 × 2х 3 х4 х1 × 4 х2 × 4 х 1 × 2х 4 х3 × 4 х 1 × 3х 4 х 2 × 3х 4 х 1 × 2х 3 × 4 0 Всі операції з приготування живильних середовищ; культивування штаму Ff-1201 та визначення рівня накопичення АСБ і вмісту ПФ проводять за прикладом конкретного виконання 1. Результати впливу складу живильного середовища на ріст та поліфенологенез штаму F. fomentarius Ff-1201 представлено в таблиці 3. 20 3 UA 91412 U Таблиця 3 Вплив складу живильного середовища на ріст та поліфенологенез штаму F. fomentarius Ff-1201 № живильного середовища 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 (контроль) рН КФ 5,79 5,21 5,56 4,23 6,17 4,60 4,72 4,27 6,29 5,83 5,92 4,58 6,39 4,87 5,18 4,03 4,53 Вміст поліфенолів, мг/г (мл) Міцелій КФ 71,68±3,18* 5,01±0,43* 88,14±4,37* 6,33±0,47 93,63±2,96* 5,75±0,14* 104,63±1,52 8,39±0,42* 75,81±3,50* 5,14±0,29* 99,32±4,13 6,62±0,34 97,26±2,85 6,37±0,11* 109,42±2,15* 6,84±0,11 73,42±5,37* 4,28±0,06* 81,12±3,92* 5,15±0,08* 85,44±1,19* 5,43±0,33* 103,83±6,15 7,92±0,28* 77,18±2,52* 5,19±0,42* 97,90±5,14* 5,99±0,12* 96,12±1,12* 5,65±0,36* 121,48±6,72* 7,53±0,19* 101,68±2,14 6,94±0,22 Біомаса, г/л 2,18±0,19* 3,05±0,28* 2,89±0,02* 4,09±0,07 2,04±0,05* 3,94±0,02 3,85±0,24 3,96±0,14 1,96±0,19* 3,01±0,28* 2,95±0,06* 4,32±0,13 2,84±0,08* 3,67±0,08* 3,70±0,01 5,19±0,24* 3,89±0,14 Примітка: "*" - достовірно порівняно з контролем 5 10 15 20 25 30 Дані досліду свідчать про наступне. Найбільше накопичення біомаси на 12-ту добу культивування штаму Ff-1201 спостерігається на живильних середовищах № 16, 12, 4 в порядку убування. Ці три середовища мають максимальний вміст манози та пептону, а середовище № 16 - також KН2РО4 та K2НРО4. Мінімальне накопичення біомаси зафіксовано при рості на середовищі № 9, де був найменший вміст факторів х 1, х2 і х3, а вміст K2НРО4 був на стандартному рівні. Максимальний рівень накопичення поліфенольних речовин у міцелії, відмічено у культурах, що росли на середовищах № 16 і 8. Ці середовища близькі за складом, та характеризуються високим вмістом манози та пептону, вміст калію фосфорнокислого одно- і двозаміщеного варіює. Щодо накопичення поліфенолів в культуральному фільтраті, то тут максимальні значення вмісту цих речовин зафіксовано при культивуванні штаму F. fomentarius Ff-1201 на середовищах № 4 та № 12. Ці ГПСм характеризуються високим складом манози та пептону, однаковим вмістом калію фосфорнокислого однозаміщеного, а вміст калію фосфорнокислого двозаміщеного варіює. Таким чином, живильне середовище № 4, що містить компоненти у кількості, г/л: маноза 12; пептон - 5; KН2РО4-0,4; K2НРО4-0,4; MgSO47Н2О - 0,2; СаСl2-0,05; ZnSO47Н2О - 0,001; дистильована вода - до 1 літра, найбільш придатне для культивування штаму F. fomentarius Ff1201 з метою накопичення поліфенольних речовин у культуральному фільтраті. Живильне середовище № 16, що містить компоненти у кількості, г/л: маноза - 12; пептон - 5; KН2РО4-0,8; K2НРО4-0,6; MgSO47Н2О - 0,5; СаСl2-0,05; ZnSO47Н2О - 0,001; дистильована вода - до 1 літра, є найбільш придатним для накопичення біомаси та поліфенольних речовин у міцелії штаму F. fomentarius Ff-1201. Оптимізація глюкозо-пептонного дозволяє вести культивування штаму Ff1201 Fomes fomentarius, направлене на отримання міцеліальної біомаси чи поліфенолів, що спрощує і здешевлює їх виробництво. Джерела інформації:, які використані при складанні заявки 1. Бухало А.С. Культивирование съедобных и лекарственных грибов. Практические рекомендации / Под общ. ред. А.С. Бухало; Н.А. Бисько, Э.Ф. Соломко, В.Т. Билай, Н.Ю. Митропольская, Н.Л. Поединок, А.А. Гродзинская, О.Б. Михайлова. - К.: ІБ, 2004. - 120 с. 2. Бухало, А.С. Базидіальні макроміцети з лікарськими властивостями / А.С. Бухало, Е.Ф. Соломко, Н.Ю. Митропольская // Укр. ботан. журн. - 1996. - Т. 53,№ 3. - С. 192-201. 4 UA 91412 U 5 10 15 20 25 3. Буценко Л.М. Технології мікробного синтезу лікарських засобів / Л.М. Буценко, Ю.М. Пенчук, Т.П. Пирог. - К.: НУХТ, 2010. - 323 с. 4. Никитина B.C. Антибактериальная активность полифенольных соединений, выделенных из растений семейств Geranieceae и Rosaceae / B.C. Никитина; Л.Ю. Кузьмина, А.И. Мелентьев, Г.В. Шендель // Прикладная биохимия и микробиология. - 2007. - Т. 43, N 6. - С. 705-712: 5. Патент 39760 України. Живильне середовище для вирощування штаму Р-6v Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. - продуцента каталази / Федотов O.B., Брусніцина О.М. Заявка № u200812035, від 10.10.2008, МПК (2009), кл. C12N9/52, А23С19/00 Бюл. № 5, від 10.03.2009. 6. Патент 66659 України. Спосіб індукції перекисного окиснення ліпідів штаму 167 Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod / Федотов О.В. Чайка О.В., Фоменок Д.В., Гербутова А.В. Заявка № u201108067, від 29.06.2011, МПК (2011.01), кл. A01G7/00, А01Н15/00 Бюл. № 1, від 10.01.2012. 7. Патент 67443 України. Живильне середовище для культивування штаму 167 Agrocybe aegerita (Brig.) Fayod - продуцента пероксидази / Федотов О.В., Волошко Т.Є. Заявка № u201107921, від 23.06.2011, МПК (2006.01), кл. C12N9/54,A23C19/032 Бюл. № 4, від 27.02.2012 (прототип) 8. Пирог Т.П. Загальна мікробіологія / Т.П. Пирог. - К.: НУХТ, 2010. - 623 с. 9. Приседський ІО.Г. Статистична обробка результатів біологічних експериментів / Ю.Г. Приседський. - Донецьк: Кассиопея, 1999, - 210 с. 10. Сысоева М.А. Структурная организация и свойства полифенолов чаги / М.А. Сысоева, О.Ю. Кузнецова, B.C. Гамаюрова // Вестник Казанского технологического университета (КГТУ). 2005. - № 1. - С. 244-250. 11. Федотов О.В. Загальний вміст поліфенольних речовин у деяких видів базидіоміцетів / О.В. Федотов, А.К. Велигодська // Мікробіологія і біотехнологія. - Одеса: ОНУ ім… I.I. Мечнікова, 2012. - №. 3(19). - С. 44-55. 12. Wasser S.P. Medicinal mushroom Science: History, Current Status, Future Trends, and Unsolved problems / S.P. Wasser // Int. J. Med. Mush. - 2010. - 12 (1). - P. 1-16. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Живильне середовище для культивування штаму Fomes fomentarius (L.) Fr. Ff-1201 продуценту поліфенольних речовин, яке включає вуглецевмісний компонент, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, цинк сірчанокислий і воду, яке відрізняється тим, що як вуглевмісний компонент використовують манозу при наступному співвідношенні компонентів, г/л: маноза 12 пептон 5 KН2РО4 0,8 K2НРО4 0,6 MgSO4×7H2O 0,5 СаСl2 0,05 ZnSO4×7H2O 0,001 дистильована вода до 1 літра. 35 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5