Живильне середовище для вирощування штаму p-6v pleurotus ostreatus (jacq.: fr.) kumm. – продуцента каталази

Живильне середовище для вирощування штаму P-6 v Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. продуцента каталази, що містить глюкозу, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокис 3 39760 лази, в якому шляхом оптимізації концентрації компонентів та введення додаткової хімічної сполуки досягають значного підвищення активності ферменту каталази, яка може бути використана у харчовій, текстильній, шкіряній, електронній промисловості, у медицині в якості діагностичного засобу. Поставлене завдання вирішується тим, що живильне середовище для вирощування штаму P6v Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. - продуцента каталази, яке включає глюкозу, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, цинк сірчанокислий і воду, відповідно корисної моделі додатково містить лігносульфонат у такому співвідношенні компонентів, г/л: глюкоза - 12; пептон - 1; КН2РО4 - 0,8; К2НРО4 0,2; MgSO 4 x7Н2О -0,5; СаС12 - 0,05; ZnSO4 x7Н2О 0,001; лігносульфонат - 8-10; дистильована вода до 1 літра. Приклад конкретного виконання 1. Динаміка росту і каталазної активності штаму P-6 v Pleurotus ostreatus. Готують вихідне живильне середовище наступного складу, г/л: глюкоза 10 пептон 3 КН2РО4 0,6 К2НРО4 0,4 MgSO4 x7H2 O 0,5 СаСl2 0,05 ZnSO4 x7H2O 0,001 дистильована вода до 1 літра [4] Живильне середовище розливають по 50 мл в конічні колби Ерленмейєра на 250 мл, стерилізують в автоклаві при 121±2 °С протягом 40 хвилин. 4 Кислотність середовища після стерилізації становить 6,0-6,5 рН. Середовище, після охолодження, інокулюють шматочком міцелію розміром 5Х5 мм. Інокулюмом є чиста культура штаму P-6v, яка росла 7-10 діб на агаризованому суслі (4° за Баллінгом) або на картопляно-глюкозному агарі (КГА) [1]. Штам P-6v культивують протягом 20 днів при температурі 27,5°С. Каталазну активність (КА) міцеліального гомогенату (МГ) та ростові показники: рН культурального фільтрату (КФ) і накопичення біомаси фіксують на 5, 10, 15 і 20-ту добу культивування. Для визначення активності каталази в міцелії штаму P-6 v використовують спектрофотометричний метод, принцип якого заснований на здатності перекису водню утворювати із солями молібдену стійкий забарвленій комплекс. Інтенсивність забарвлення розчинів вимірюють на спектрофотометрі, наприклад СФ-26, при довжині хвилі 410 нм проти нульової проби з дистильованою водою. Активність каталази визначають за формулою [5]: Е = (Ак -Ад)·V·t·k·p, де Ак та Ад - екстинкція контрольної та дослідної проб, V - об’єм проби (0,1 мл), t - час інкубації (600 секунд), k - коефіцієнт мілімолярної екстинкції перекису водню (22,2·103 мМ-1·см -1), р - коефіцієнт розведення. рН розчинів вимірюють потенціометричним методом на рН-метрі. Накопичення біомаси встановлюють зважуванням повітряносухого міцелію (звільненого від культурального фільтрату і висушеного при 105 °С) та перерахунком його ваги на один літр живильного середовища. Результати динаміки росту і каталазної активності представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Динаміка росту і каталазної активності штаму P-6v Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm. Вік культури, доба Біомаса,г/л рН КФ 5 10 15 20 0,152±0,149 2,068±0,207 2,977±0,208 3,206±0,280 6,10 6,35 6,09 6,19 Дані досліду (табл. 1) свідчать про наступне. Протягом терміну культивування спостерігається постійний ріст штаму P-6v. Значення рН КФ має два максимуми на 10 та 20-ту добу росту. Каталазна активність міцелію має вірогідний максимум на 15-ту добу культивування. Приклад конкретного виконання 2. Оптимізація складу живильного середовища для росту штаму P-6v Pleurotus ostreatus. Каталазна активність МГ, мкат/л 103 429,983±3,875 416,240±5,451 446,220±8,026 269,797±4,039 Удосконалення вихідного середовища, згідно поставленої задачі, проводять за методом повного факторного експерименту (ПФЕ-24) [2]. Варіювання (X) вмісту у живильних середовищах глюкози і пептону - факторів х1, х2 складає 2 г/л, а сірчанокислого магнію і хлористого кальцію - факторів х3 і х4 - 0,2 г/л, інші компоненти мають постійну концентрацію (таблиця 2). 5 39760 6 Таблиця 2 Склад живильних середовищ для оптимізації росту і біосинтезу каталази штаму P-6v Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm Фактори № живильного середовища x1 (глюкоза) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 10 х2 (пептон) х3 (КН2РО) х4 (К2НРО 4) Взаємодія факторів Вміст у живильному середовищі, г/л 1 0,4 0,2 1 0,4 0,2 5 0,4 0,2 5 0,4 0,2 1 0,8 0,2 1 0,8 0,2 5 0,8 0,2 5 0,8 0,2 1 0,4 0,6 1 0,4 0,6 5 0,4 0,6 5 0,4 0,6 1 0,8 0,6 1 0,8 0,6 5 0,8 0,6 5 0,8 0,6 3 0,6 0,4 Всі операції по приготуванню живильних середовищ; к ультивуванню штаму P-6v проводять за прикладом конкретного виконання 1. Штам P-6v культивують упродовж 15 діб при температурі 27,5 1 х1 х2 х1 х2 х3 х1 х3 Х2 х3 х1 х2 х3 х4 х1 х4 х2 х4 х1 х2 х4 х3 х4 х1 х3 х4 х2 х3 х4 х1х2 х3 х4 0 °С. Визначення накопичення біомаси штамом P-6v проводять за прикладом конкретного виконання 1. Вплив складу живильного середовища на ріст штаму P-6 v Pleurotus ostreatus представлено в таблиці 3. Таблиця 3 Вплив складу живильного середовища на ріст штаму P-6 v Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm № живильного середовища 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Взаємодія факторів 1 x1 х2 х1 х2 х3 х1 х3 х2 х3 х1 х2 х3 х4 х1 х4 х2 х4 х1 х2 х4 х3 х4 х1 х3 х4 х2 х3 х4 х1 х2 х3 х4 0 Дані досліду (табл. 3.) свідчать про наступне. Найбільше накопичення біомаси спостерігалося при 15-ти добовому культивуванні штаму P-6 v на живильному середовищі № 12, а також на середовища х № 3, 7, 8 в порядку убування. Середовище Біомаса, г/л 2,275±1,246 2,859±0,801 5,358±0,849 4,573±0,381 2,428±0,688 2,767±0,621 5,111±0,675 5,035±1,018 3,184±0,824 3,501±0,599 4,835±0,539 5,773±0,720 2,235±0,862 2,850±0,655 4,582±0,800 3,798±0,953 2,977±0,208 № 12 мало максимальний вміст глюкози, пептону і К2НРО4. Для культур штаму P-6v, що росли на середовищі № 13, де вміст глюкози і пептону були мінімальними, а вміст КН2РО4 і К 2НРО4 - максима 7 39760 льним зареєстровано мінімальне накопичення біомаси. Отже, живильне середовище наступного складу, г/л: глюкоза - 12; пептон - 5; КН2РО4 - 0,4; К2НРО4 - 0,6; MgSO 4 x 7Н2О - 0,5; СаС12 - 0,05; ZnSO4 х 7Н2О - 0,001; дистильована вода до 1 літра є найбільш придатним для росту штаму P-6v. Приклад конкретного виконання 3. Оптимізація складу живильного середовища з метою підвищення каталазної активності штаму P-6v Pleurotus ostreatus. Готують живильні середовища для вивчення впливу х1 , х2, х3 і х4 факторів - компонентів живильного середовища на каталазну активність штаму P-6v відповідно до матриці ПФЕ-24 за прикладом конкретного виконання 2. Штам P-6v культивують упродовж 15 діб при температурі 27,5 °С. 8 Визначення активності каталази в міцелії штаму P-6v проводять за прикладом конкретного виконання 1. Дані досліду (табл. 4.) свідчать про наступне. Найбільша КА зафіксована при культивуванні штаму P-6 v на живильному середовищі № 6, а також на середовищах № 9, 5, 14 в порядку убування. Середовище № 6 мало максимальний вміст глюкози і КН 2РО4. Отже, при культивуванні штаму P-6v на живильному середовищі наступного складу, г/л: глюкоза - 12; пептон - 1; КН2РО 4 - 0,8; К2НРО 4 - 0,2; MgSO4 х 7Н2 О - 0,5; СаС12 - 0,05; ZnSO 4 х 7Н2О 0,001; дистильована вода - до 1 літра, зареєстрована найвища активність міцеліальної каталази. Таблиця 4 Вплив складу живильного середовища на каталазну активність міцелію штаму P-6v Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm № живильного середовища 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Взаємодія факторів 1 х1 х2 х,х2 х3 х1 х3 х2 х3 х1 х2 х3 х4 х1 х4 х2 х4 х1 х2 х4 х3 х4 х1 х3 х4 х2 х3 х4 х1 х2 х3 х4 0 Приклад конкретного виконання 4. Вплив лігносульфоната на ріст та каталазну активність штаму P-6 v Pleurotus ostreatus. Внесення лігносульфонату здійснювали у оптимізоване за прикладом конкретного виконання 3 глюкозо-пептонне живильне середовище у концентраціях 0,1; 0,4; 0,7; 1,0; 1,3 та 1,6 %. Всі операції щодо приготування живильних середовищ, їх інокуляція, визначення ростових Каталазна активність мг, м кат/л 103 326,340±14,652 470,197±33,618 339,660±19,980 481,740±68,028 497,283±15,553 530,580±69,320 270,840±10,766 333,003±13,321 508,380±55,854 468,420±76,614 483,960±12,376 390,720±10,766 472,860±66,600 486,180±64,227 344,100±90,912 222,000±14,611 446,220±8,026 показників та активності каталази в міцелії штаму P-6v виконують за прикладом конкретного виконання 1. Штам P-6v культивують упродовж 15 діб при температурі 27,5 °С. Вплив лігносульфонату на ріст та каталазну активність міцелію штаму P-6v Pleurotus ostreatus представлено в таблиці 5. 9 39760 10 Таблиця 5 Вплив лігносульфонату наріст та каталазну активність міцелію штаму P-6v Pleurotus ostreatus (Jacq.: Fr.) Kumm Концентрація лігносульфонату, % 0,1 0,4 0,7 1,0 1,3 1,6 Біомаса, г/л Каталазна активність мг, м кат/л 103 3,025±0,098 5,601±0,011 8,781±0,052 9,065±0,310 6,705±0,281 6,054±0,118 390,000±12,02 428,675±10,09 850,291±6,83 869,065±7,81 500,340±14,00 387,670±4,92 Таким чином оптимізоване глюкозо-пептонне живильне середовище, яке містить у своєму складі лігносульфонат в концентрації 0,7-1,0 % є оптимальним для синтезу штамом P-6v міцеліальної каталази. Оптимізація живильного середовища для росту і каталазної активності штаму P-6v дозволяє вести його вирощування, направлене на отримання міцеліальної біомаси чи ферменту каталази, що спрощує і здешевлює їх виробництво. Джерела інформації, які використані при складанні заявки: 1. Бухало А.С. Высшие базидиомицеты в чистой культуре. -К.: На ук, думка, - 1988. - 144с. 2. Максимов В.Н., Пименова М.Н., Гречушкина Н.Н. Оптимизация состава питательной среды методом математического планирования эксперимента/ Практикум по микробиологии. Изд-во Москов. ун-та. 1976. - С.153-163. 3. Патент 19340 U України. Середовище для діагностики кератолітичних мікроскопічних грибів// Комп’ютерна в ерстка Д. Шев ерун Іздепський В.Й., Кулинич СМ., Глущенко С.Г. Заявка №u200606280 від 05.06.2006, кл. C12N 1/20, C12Q 1/4, Бюл. № 12, від 15.12.2006. 4. Патент 22915 А України. Живильне середовище для вирощування штаму М-81 Hirschioporus laricinus - продуцента молокозгортаючого ферменту / Бойко М.І., Негр уцький С.Ф., Федотов О.В., Борисенко О.О. Заявка № 96031179 від 27.03.1996, кл. C12N1/38, Бюл. № 3, від 30.06.1998. (прототип). 5. Патент 39243 А України. Спосіб визначення каталазної активності базидіоміцетів / Федотов О.В., Гавриленко Г.В. Заявка № 2000116560, від 21.11.00, кл. 7C12N9/58, Бюл. № 5, від 15.06.2001. 6. Патент 63177 А України. Живильне середовище для виділення і пересівання чистих культур вищи х базидіоміцетів / Федотов О.В., Бугрім Є.Ю., Крюков О.А. Заявка № 2003021394, від 17.02.2003, кл. 7C12N9/54, А23С19/032, Бюл. № 1, від 15.01.2004. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601