Спосіб виявлення антибіотиків тіострептонового ряду

Спосіб виявлення антибіотиків тіострептонового ряду, що базується на індукції експресії гена канаміциностійкості nео у Streptomyces lividans, який відрізняється тим, що як векторну молекулу ДНК використовують інтегративну плазміду рIJ6902. Винахід стосується генетики бактерій та біотехнології і може бути використаний для виявлення продуцентів тіопептидних сполук тіострептонової родини та їхніх похідних, що містять у своїй структурі бісдегідроаланіновий ланцюг. Тіопептидні антибіотики - природні, сірковмісні, високомодифіковані, макроциклічні пептиди, переважна більшість яких пригнічує білковий синтез у грампозитивних бактерій [Bagley М.С., Dale J.W., Merritt E.A., Xiong X. Thiopeptide antibiotics // Chem Rev. - 2005. - vol. 105. - P. 685-714; Lentzen G., Klinck R., Matassova N., Aboul-ela F., Murchie AI. Structural basis for contrasting activities of ribosome binding thiazole antibiotics // Chem Biol. - 2003. - vol. 10. - P. 769-778]. Протималярійні, протипухлинні та іммуносупресивні властивості також характерні представникам тіострептонової родини [Sullivan Μ., Li J., Kumar S., Rogers M.J., McCutchan T.F. Effects of interruption of apicoplast function on malaria infection, development, and transmission // Mol Biochem Parasitol. - 2000. - vol. 109. - P. 17-23; Radhakrishnan S.K., Bhat U.G., Hughes D.E., Wang I.C., Costa R.H., Gartel A.L. Identification of a chemical inhibitor of the oncogenic transcription factor forkhead box M1 // Cancer Res. - 2006. - vol. 66. - P. 9731-9735; Ueno M., Furukawa S., Abe F., Ushioda M., Fujine K., Johki S., Hatori H., Ueda H. Suppressive effect of antibiotic siomycin on antibody production // J Antibiot. - 2004. - vol. 57. - P. 590596]. Виявлення продуцентів нових тіопептидів тіострептонової родини дозволило б отримати нові сполуки з покращеними біологічними чи фармакологічними властивостями. Виявлення нових мікроорганізмів, що продукуватимуть вже відомі тіопептиди, також становить практичний інтерес, оскільки вони можуть бути більш зручними ніж наявні штами. Відомий спосіб виявлення антибіотиків тіострептонового ряду, що включає ферментацію продуцентів тіопептидів, їхнє очищення з клітин і хімічний аналіз кінцевого продукту [Nishimura Η., Okamoto S., Mayama Μ., Ohtsuka Η., Nakajima K., Tawara K., Shimohira Μ., Shimaoka N. Siomycin, a new thiostrepton-like antibiotic // J Antibiot. - Ser. A14. - P. 255-263]. (19) UA (11) 91725 (13) (21) a200806265 (22) 12.05.2008 (24) 25.08.2010 (46) 25.08.2010, Бюл.№ 16, 2010 р. (72) МИРОНОВСЬКИЙ МАКСИМ ЛЕОНІДОВИЧ, ОСТАШ БОГДАН ОМЕЛЯНОВИЧ, ОСТАШ ІРИНА СТЕПАНІВНА, ФЕДОРЕНКО ВІКТОР ОЛЕКСАНДРОВИЧ (73) ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА (56) UA U 26679, 10.10.2007. UA C1 6967, 31.03.1995. UA C1 6965, 31.03.1995. Nancy L. McKenzie and Justin R. Nodwell “Phosphorylated AbsA2 negatively regulates antibiotic production in Streptomyces coelicolor through interactions with pathway-specific regulatory gene promoters”, Journal of Bacteriology, July 2007, Vol. 189, No. 14, p. 5284-5292. C2 1 3 91725 4 Однак цей спосіб передбачає використання культур мікроорганізмів для експрес-виявлення складних мікробіологічних та хімічних процедур, є антибіотиків тіострептонової групи. Спосіб базутривалим і трудомістким. ється на використанні векторної молекули ДНК Найбільш близьким за технічною сутністю pIJ6902 [Huang J., Shi J., Molle V., Sohlberg В., прототипом - є спосіб виявлення тіострептонWeaver D., Bibb M.J., Karoonuthaisiri N., Lih C.J., подібних тіопептидних антибіотиків за допомогою Kao С.М., Buttner M.J., Cohen S.N. Cross-regulation репортерного штаму Streptomyces lividans, що місamong disparate antibiotic biosynthetic pathways of тить у своїй хромосомі ген tipA та рекомбінантну Streptomyces coelicolor // Mol Microbiol. - 2005. - vol. плазміду, в якій безпромоторний ген канаміцин58. - P. 1276-1287], що містить промотор гена tipA, стійкості neo злитий з промотором гена tip A [Yun та pIJ486 [Kieser Т., Bibb M.J., Buttner M.J., Chater B.S., Hidaka Т., Furihata K., Seto Η. Microbial K.F., Hopwood D.A. Practical Streptomyces genetics metabolites with tipA promoter inducing activity. II. // John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom. Geninthiocin, a novel thiopeptide produced by 2000. - 613 pages]. Ген tipА кодує MerR-подібний Streptomyces sp. DD84 // J. Antibiot. - 1994. - vol. 47. транскрипційний регуляторний білок TipAL, який, - N 9. - P. 969-975]. Промотор гена tipA клонували у за індукції клітин Streptomyces lividans тіострептовектор pIJ486 так, що транскрипція гена neo підпаном, незворотно зв'язується з ним [Chiu MX., дає під його контроль [Kieser Т., Bibb M.J., Buttner Folcher Μ., Griffin P., Holt Т., Klatt Т., Thompson C.J. M.J., Chater K.F., Hopwood D.A. Practical Characterization of the covalent binding of Streptomyces genetics // John Innes Foundation, thiostrepton to a thiostrepton-induced protein from Norwich, United Kingdom. - 2000. - 613 pages]. СкоStreptomyces lividans // Biochemistry. - 1996. - vol. нструйовану плазміду вводили у S. lividans шля35. - P. 2332-2341]. Білок TipAL, зв'язаний з тіостхом трансформації протопластів. Відбір трансфорептоном, здатний активувати транскрипцію генів рмантів проводили на регенераційному з tipА промотора. Окрім тіострептону, білок TipА середовищі R2YE за стійкістю до тіострептону, яка здатний зв'язуватись з іншими представниками визначалась маркерним геном вектора. Рекомбітіострептонової родини і активувати експресію нантний штам S. lividans вирощували на середогенів [Chiu M.L., Folcher M., Katoh Т., Puglia A.M., вищі R2YE з тіострептоном 5 днів для отримання Vohradsky J., Yun B.S., Seto H., Thompson C.J. спорової суспензії. Одночасно розливали чашки з Broad spectrum thiopeptide recognition specificity of середовищем Беннета, що містить 50 мкг/мл каthe Streptomyces lividans TipAL protein and its role in наміцину, на яке засівали спорову суспензію рекоregulating gene expression // J Biol Chem. - 1999. мбінантного штаму S. lividans. Екстракти з клітин vol. 274. - P. 20578-20586]. Промотор гена tipA морізних мікроорганізмів наносили на паперові диски, же бути використаний для конструювання репорпідсушували, та ставили на попередньо засіяний терного штаму на основі S. lividans ТK24, де наявгазон репортерного штаму. Суміш сполук дифунність чи відсутність антибіотиків тіострептонової дувала з дисків у клітини репортерного штаму. родини у його клітинах може бути спряжена з росЯкщо у суміші були тіострептон-подібні тіопептиди, том чи відсутністю росту S. lividans ТK24, відповідто вони зв'язувались з білком ТірА, і той, у свою но, на селективних середовищах. чергу, набував здатності зв'язуватися з промотоФіг.1 Структурні формули представників родиром tipA та запускати транскрипцію гена neo. Ті ни тіострептону, де 1 - тіострептон А; В, 2 - сіоміекстракти, що містили тіопептидні антибіотики тіоцин А; В, 3 - тіопептин, 4 - Sch 18640. стрептонового ряду, індукували ріст рекомбінантФіг. 2 Схема рекомбінантної плазміди рМО16, ного штаму S. lividans навколо відповідних дисків де 1 - ген канаміцин-стійкості neo, 2 - промотор на середовищі Беннета з канаміцином. гена tipA, 3 - ділянка ініціації реплікації плазміди Проте, цей спосіб вимагає селективного тиску pUC18, 4 - ген апраміцин-стійкості aac(3)IV, 5 - ген - постійного додавання тіострептону до середовитіострептон-стійкості tsr, 6 - ділянка ініціації кон'юща, в якому росте репортерний штам, для підтригаційного переносу плазміди RK2, 7 - сайт інтеграмання реплікативної плазміди, що має ряд недоліції фага С31, 8 - ген інтегрази фага С31. ків. Зокрема, тіострептон є дорогим антибіотиком, і Фіг.3 Схема функціонування репортерної сисвін індукує експресію сторонніх генів у S. lividans., теми, що базується на плазміді рМО16, та штамі що може спотворити результати дослідів. S. lividans TK24, де А - блокування експресії гена В основу винаходу покладено завдання удоneo за відсутності тіопептидів в середовищі, Б сконалити спосіб експрес-виявлення антибіотиків індукція експресії гена neo за наявності тіопептитіострептонової родини шляхом конструювання дів. Умовні позначення: Г - ген канаміцин-стійкості покращеної тіострептон-специфічної репортерної neo, Π - промотор гена tipА, Р - білок-регулятор системи, що дасть змогу оптимізувати виявлення TipА, Л - ліганд, представник тіострептонової ропродуцентів цієї групи тіопептидів. дини антибіотиків. Поставлене завдання вирішується так, що у Фіг.4 Індукція росту S. Iividans ТK24 (pMO16) способі виявлення антибіотиків тіострептонового агаровими блоками, де 1 - агаровий блок, що був ряду, який базується на індукції експресії гена кавирізаний з газону продуцента сіоміцинів наміцин-стійкості neo у Streptomyces lividans, як Streptomyces sioyaensis на середовищі ОМ, 2 векторну молекулу ДНК використовують інтегратиагаровий блок, що був вирізаний з газону продувну плазміду pIJ6902. цента сіоміцинів Streptomyces sioyaensis на сереАвторами вперше запропоновано використати довищі МС, 3 - агаровий блок, що був вирізаний з інтегративну плазміду, у якій експресія гена neo газону продуцента сіоміцинів Streptomyces підпадає під транскрипційний контроль з боку PtipA, sioyaensis на середовищі R2YE, 4 - агаровий блок, штам Streptomyces lividans TK24 та агарові блоки 5 91725 6 що був вирізаний з газону контрольного штаму Суспензію спор штаму S. lividans TK24 висіваStreptomyces coelicolor на середовищі R2YE. ють на середовище ОМ та вирощують 5 діб при Спосіб можна проілюструвати прикладами: 28°С для отримання спорової суспензії для кон'юПриклад 1. Конструюють плазміду pMO16. З гаційних схрещувань. Штам Е. coli ET12567 плазміди pIJ486 [Kieser Т., Bibb M.J., Buttner M.J., (pUZ8002) з плазмідою pMO16 висівають на чашку Chater K.F., Hopwood D.A. Practical Streptomyces з середовищем LA з 25 мкг/мл апраміцину та 50 genetics // John Innes Foundation, Norwich, United мкг/мл канаміцину та вирощують 18 год при 37°С. Kingdom. - 2000. - 613 pages] за допомогою прайГотують суспензію клітин у 4 мл середовища LB. мерів neoNdel-up (5'Одночасно готують суспензію спор штаму S. AAACATATGATTGAACAAGATGGATTGCACG) та lividans TK24 у 4 мл стерильної води. Спори підneoEcoRI-rp (5'дають тепловому шоку протягом 10 хв. при 50°С. AAAGAATTCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC) Суспензію клітин та спор стрептоміцетів осаджуампліфікують фрагмент ДНК, що містить безпроють центрифугуванням 2 хв при 10000 об/хв., злимоторний ген канаміцин-стійкості neo. Цей амплівають надосадову рідину, розчиняють у 100 мкл кон обробляють ендонуклеазами рестрикції Ndel середовища LB, змішують між собою та висівають та EcoRl. Вектор pIJ6902 [Huang J., Shi J., Molle V., на чашки з середовищем ОМ. Чашки інкубують 8Sohlberg В., Weaver D., Bibb M.J., Karoonuthaisiri 12 год при 28°С та заливають 1 млводного розчиN., Lih C.J., Kao С.М., Buttner M.J., Cohen S.N. ну 25 мкг апраміцину та 50 мкг налідиксової кислоCross-regulation among disparate antibiotic ти. biosynthetic pathways of Streptomyces coelicolor // Приклад 4. Отриманий штам S. lividans TK24 Mol Microbiol. - 2005. - vol. 58. - P. 1276-1287] об(pMO16) перевіряють на наявність плазміди. Виробляють ендонуклеазами рестрикції Ndel та рощують у 50 мл рідкого середовища YEME та EcoRl, та лігують з вищеописаним ампліконом. виділяють сумарну ДНК. Зразки сумарної ДНК аналізують шляхом ПЛР з рSЕТ152-специфічними Лігазною сумішшю трансформують Е. coli DH5 та праймерами [Stinchi S., Azimonti S., Donadio S., відбирають клони, що несуть рекомбінантні плазSosio M. A gene transfer system for the glycopeptide міди на середовищі LA з 25 мкг/мл апраміцину. producer Nonomuraea sp. ATCC39727 // FEMS Плазмідну ДНК із трансформантів аналізують ресMicrobiol Lett. - 2003. - vol. 225. - P. 53-57]. Амплітрикційним картуванням ферментами Ndel та фіковані фрагменти аналізують електрофоретичEcoRl [Гловер Д. Молекулярное клонирование но. ДНК. Методы. М., Мир - 1989 - т. 1 - 374с]. Як реПеревіряють здатність репортерної системи S. зультат отримують плазміду pMO16, що містить lividans TK24 (pMO16) виявляти тіострептон. Штам вставку ДНК з геном канаміцин-стійкості neo. S. lividans TK24 (pMO16) висівають на середовище Приклад 2. Плазмідою pMO16 трансформують ОМ з 25 мкг/мл апраміцину. Вирощують 5 діб при штам Е. coli ET12567 (pUZ8002), який за рахунок 30°С. Готують суспензію спор з 5-денної культури tra-генів плазміди pUZ8002 забезпечує кон'югативS. lividans TK24 (pMO16) у 1 мл води, яку висіване перенесення корезидентних плазмід [Flett F., ють на середовище ММС з складом: L-аспарагін Mersinias V., Smith C.P. High efficiency intergeneric 0.5 г, K2НРО4 - 0.5 г, MgSO4 7H2O - 0.2 г, conjugal transfer of plasmid DNA from Escherichia coli to methyl-DNA-restricting Streptomycetes // FeSO4 7H2O - 0.01 г, казамінові кислота - 3 г, агар FEMS Microbiol. Lett. - 1997. - vol. 155. - P. 223- 15 г, дистильована вода - до 1000 мл. Після ав229]. Одну колонію нічної культури Escherichia coli токлавування у середовище додають 10 г/л глюкозасівають у 5 мл середовища LB з 50 мкг/мл канази та 50 мкг/мл канаміцину. Одночасно, на папеміцину. Культуру вирощують до оптичної густини рові диски Whatman діаметром 5 мм наносять OD600=0,1, переносять у мікропробірки з об'ємом розчини тіострептону у диметилсульфоксиді. Фор1.5 мл та осаджують центрифугуванням при 10 мула тіострептону та окремих представників тіосттис. об./хв протягом 1 хв. Зливають супернантант рептонової родини - див. Фіг.1. Диски підсушують та клітини ресуспендують у 50 мкл середовища при 37°С у темряві протягом 1 години, а потім наLB. Отриману суспензію клітин охолоджують у кладають на попередньо засіяний газон репортерльоді 5 хв, додають 1 мл 0.1Μ розчину СаСl2 та ного штаму. Чашки з дисками інкубують при 28інкубують у льоді 1 год. Клітини осаджують 30°С протягом 4 діб. Навколо дисків з тіострептоцентрифугуванням при 10 тис. об./хв протягом 1 ном помітні чіткі зони росту S. lividans TK24 хв, зливають надосадову рідину та ресуспендують (pMO16). Це свідчить, що тіострептон по відноу 100 мкл 0.1М розчину СаСl2. Інкубують 1 год. у шенню до TipAL є лігандом, що умовно відображельоді та додають розчин плазмідної ДНК. Інкубуний чорним квадратом позначеним літерою L на ють 1 год. у льоді, після чого клітини піддають тепФіг.3, і він був успішно виявлений репортерною ловому шоку протягом 1 хв. при 40°С, охолоджусистемою. ють та додають 1 мл середовища LB. Інкубують 2 За допомогою репортерної системи S. lividans год. при 37°С для індукції експресії генів стійкості TK24 (pMO16) виявляють сіоміцин у агарових блота висівають на чашки з середовищем LA з 25 ках Streptomyces sioyaensis NRRL-B5408. На серемкг/мл апраміцину та 50 мкг/мл канаміцину. Чашки довище ОМ [Gromyko О, Rebets Y, Ostash В, інкубують при 37°С 16 год після чого трансформаLuzhetskyy A, Fukuhara M, Bechthold A, Nakamura нти пересівають на свіже середовище LA з 25 Τ, Fedorenko V.Generation of Streptomyces мкг/мл апраміцину та 50 мкг/мл канаміцину. globisporus SMY622 strain with increased Приклад 3. Плазміду pMO16 в S. lividans TK24 landomycin Ε production and it's initial переносили шляхом міжродової кон'югації з відпоcharacterization // J. Antibiot. - 2004. - vol. 57. - N 6. відним штамом Е. coli ΕΤΙ2567 (pUZ8002). 383-389] висівають суспензію спор штаму 7 91725 8 Streptomyces sioyaensis NRRL-B5408 - продуцента В іншому варіанті виконання цього експеримекомплексу сіоміцинів А, В, С, D. Штам вирощують нту можна засівати штами, що досліджуються, не 6 діб при 28°С. Суспензію спор репортерного штана чашки, а у лунки 96-гніздового імунологічного му S. lividans TK24 (pMO16) висівають на чашки планшета з об'ємом лунки 200 мкл, в які попередММС з 50 мкг/мл канаміцину, і на попередньо засіньо залили по 150 мкл середовища ОМ. Після вияний газон ставлять агарові блоки діаметром 5 мм, рощуваня штамів у планшеті, агарові блоки вийякі вирізали з газону культури S. sioyaensis NRRLмають з лунок та використовують, як описано B5408. Інкубують чашки з блоками 4 доби. Штам S. вище. Цим досягається економія середовища та sioyaensis NRRL-B5408 індукує ріст S. lividans часу на проведення скринінгу. TK24 (pMO16), як показано на Фіг.4. Як результат, Використання запропонованого способу ексрепортерна система дає змогу виявити ті агарові прес-виявлення антибіотиків тіострептонової групи блоки, і, відповідно, продуценти, в яких накопичудає змогу отримати передбачуваний технічний ються сполуки тіострептонової родини. результат, який підтверджено Фіг.4. 9 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 91725 Підписне 10 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601