Застосування 6-аміноетил-6н-індоло-[2,3-b]хіноксалінів як агентів, що інгібують репродукцію вірусу везикулярного стоматиту

Застосування 6-аміноетил-6Н-індоло-[2,3b]хіноксалінів загальної формули: Винахід належить до біоорганічної хімії, зокрема до застосування похідних 6-аміноетил-6Ніндоло-[2,3-b]хіноксалінів як противірусних агентів відносно вірусу везикулярного стоматиту та індукторів інтерферонів і може бути використаний для створення нових противірусних та імунокорегуючих засобів. Різноманітність інфекційних хвороб, порушень імунного статусу та онкологічних захворювань роблять пошук ефективних та безпечних імунокоректорів вкрай актуальним. До найбільш ефективних імунокоректорів належать індуктори інтерферону (ІФН) (див. Ершов Ф.И., Новохатский А.С. Индукторы интерферона. - М.: Медицина, 1982, 180 с.). Незважаючи на наявність деяких клінічних індукторів (аміксин, циклоферон) цю проблему ще не можна вважати вирішеною. Найближчими аналогом винаходу, що заявляється, виходячи із структури є 2,3-диметил-6-[2(диметиламіно)етил]-6Н-індоло-[2,3-b]-хіноксалін, здатний до інгібування реплікації вірусу герпеса у культурі клітин (див. Harmenberg J., Wahren В., Bergman J., Akerfeldt S., Lundblad L. Antiherpes virus activity and mechanism of action of indolo[2,3b]quinoxaline and analogs // Antimicrob. Agents Chemother. - 1988. - Vol. 32. - P. 1720-1724). Відомості щодо індукції інтерферону цією сполукою відсутні. N N N R , де CH3 R=N N O (19) UA (11) 95726 (13) або , як агентів, що інгібують репродукцію вірусу везикулярного стоматиту. C2 CH3 3 95726 4 CH3 N CH3 N N H3C N CH3 2,3-Диметил-6-[2-(диметиламіно)етил]-6H-індоло-[2,3-b]-хіноксалін В основу винаходу поставлено задачу пошуку нових противірусних агентів серед сполук цього класу та розширення спектру противірусних агентів відносно вірусу везикулярного стоматиту та індукторів інтерферонів. Поставлена задача вирішена застосуванням 6-аміноетил-6Н-індоло-[2,3-b]хіноксалінів як агентів, що інгібують репродукцію вірусу везикулярного стоматиту, загальної формули: CH3 R=N де N R N O (2) Сполуки, що заявляються, отримували у три стадії, виходячи з 1Н-індол-2,3-діону (13). Алкілування 1Н-індол-2,3-діону дією надлишку диброметану у диметилформаміді у присутності карбонату калію при кімнатній температурі приводило до 1(2-бромоетил)-1Н-індол-2,3-діону (14), подальшою конденсацією якого із о-фенілендіаміну в киплячій крижаній оцтовій кислоті отримували 6-(2бромоетил)-6Н-індоло[2,3-b]хіноксалін (15). N N CH3 (1) або , NH2 O N H Br O Br N NH2 O K2CO3, ДМФА кімн. т., 2 год. 80 % N Br 13 14 O CH3COOH, кип., 4 год. 80 % N N Br 15 N N N втор. амін бензол, кип., 6-8 год.; ДМФА, кімн.т. 80-90 % R 1, 2 Сполуку 1 отримували амінодегідробромуванням продукту 15 дією надлишку диметиламіну при кімнатній температурі у диметилформаміді, а сполуку 2 - при кип'ятінні продукту 15 у бензолі з надлишком морфоліну. Чистота синтезованих сполук підтверджена тонкошаровою хроматографією, 1 будова - даними спектроскопії Н-ЯМР та масспектрометрії. Вивчення біологічної активності препаратів 1 та 2 проводили за схемою і в умовах, що враховували адекватність тест-моделі можливому механізму інтерфероногенної активності, що передбача вся на підставі аналізу структури хімічної сполуки, яка вивчалась (див. Вильнер Л.М. Актуальные вопросы скрининга и последующего изучения противовирусных препаратов типа интерфероногенов / В сб.: Методические вопросы научной разработки противовирусных средств. – Минск, 1977. – С. 134-136). Цитотоксичність, інтерфероніндукуючу та противірусну активність синтезованих сполук вивчали як описано (див. Доклінічні дослідження лікарських засобів. Методичні рекомендації. / За ред. чл.-кор. АМН України О.В. Стефанова. - К: МОЗ, України. ДФЦ, 2001.-392 с.). 5 Отримання сполук, що заявляються, та їхні біологічні властивості підтверджено наступними прикладами. Приклад 1. 1-(2-бромоетил)-1Н-індол-2,3-діон (14). До розчину 10 г (0,068 моль) 1Н-індол-2,3діону у диметилформаміді додали 33,5 г (0,17 моль) карбонату калію та ретельно перемішали, потім додали 117,2 см (255,5 г, 1,36 моль) дибромоетану. Отриману реакційну суміш перемішували протягом 2 год. при кімнатній температурі. Відфільтрували неорганічний осад, промили на фільтрі 3 диметилформамідом 3х5 см . Фільтрат випарили, кубовий залишок промили водою та відфільтрували. Продукт перекристалізували із етанолу. Вихід: 13,8 г (80 %); С10Н8ВrNО2; M.W. 254,08; Т пл.=132,8-133,4 °С. Мас-спектр - m/z (I, %): 255 + (21), 253 (20) - М ; 146 (100); 132 (55); 90 (7), 77 (10). Спектр ПМР (CDCl3): аліфатичні СН: т. 3,601 м.ч., 6.9 Гц (2Н, BrCH2CH2N); т. 4,136 м.ч., 6,9 Гц (2Н, BrCH2CH2N); ароматичні СН: д. 7,007 м.ч., 8,4 Гц (1Н); т. 7.134 м.ч., 7,5 Гц (1H); м. 7,577 – 7,627 м.ч. (2Н). Rf 0,43 (бензол - триетиламін 10:1); Rf 0,63 (хлороформ - ацетон 10:1). Приклад 2. 6-(2-бромоетил)-6Н-індоло[2,3-b]хіноксалін (15). Суміш 10 г (0,04 моль) 1-(2-бромоетил)-1Ніндол-2,3-діону (14), 4.32 г (0.04 моль) о3 фенілендіаміну та 60 см крижаної оцтової кислоти кип'ятили протягом 4 год. Осад, що утворився після охолодження реакційної суміші, відфільтрували та промили на фільтрі крижаною оцтовою кисло3 тою 3x5 см . Продукт перекристалізували із крижаної оцтової кислоти. Вихід: 10,4 г (80 %). C16H12BrN3; M.W. 326,20. Т пл.=169-170 °С. Мас+ спектр -m/z (І, %): 329 (14); 327 (21) - М ; 232 (4); 220 (5); 219 (96); 102 (8); 90 (15); 69 (6); 60 (32); 45 (100); 43 (58). Спектр ПМР (CDCl3): аліфатичні СН: т. 3,863 м.ч., 7,2 Гц (2Н, BrCH2CH2N); т. 4,843 м.ч., 7,2 Гц (2Н, BrCH2CH2N); ароматичні СН: т. 7,386 м.ч., 7,5 Гц (1H); д. 7,523 м.д., 8,1 Гц (1Н); м. 7,6627,791 м.ч. (3Н); д.д. 8,132 м.ч., 8,4 Гц, .1,5 Гц (1H); д.д. 8,333 м.ч., 8,1 Гц, 1,5Гц (1Н); д. 8,503 м.ч., 7,5 Гц (1H). Rf 0,60 (бензол - триетиламін 10:1); Rf 0,84 (хлороформ - ацетон 10:1). Приклад 3. (2-Індоло[2,3-b]хіноксалін-6-іл-етил)диметиламін (1). Розчинили 0,81 г (0,0025 моль) 6-(2бромоетил)-6Н-індоло[2,3-b]хіноксаліну (15) в 50 3 см ДМФА, додали 1,3 см (0,225 г, 0,005 моль) 33 %-вого водного розчину диметиламіну. Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 6 год., потім випарили. Кубовий залишок 3 розчинили в 25 см бензолу, екстрагували 10 %-ою 3 оцтовою кислотою (3x30 см ). У водний екстракт додали насичений розчин Nа2СО3 до рН=9. Осад, що випав, відфільтрували, промили на фільтрі 3 водою (3x5 см ) та висушили. Вихід: 0,57 г (78 %). C18H18N4. M.W. 290,37. Т пл.=95-95,5 °С. Мас+ спектр - m/z (I, %): 291 (100) - МН ; 246 (16); 232 (8); 219 (12); 72 (20); 57 (55). Спектр ПМР (CDCl 3): аліфатичні СН: с 2,408 м.ч. (6Н, (CH3)2N): т. 2,878 м.ч., 6,9 Гц (2Н, N(aліф)CH2CH2N(apом)); т. 4,613 м.ч., 95726 6 7,2 Гц (2Н, N(aліф)CH2CH2N(apoм)); ароматичні СН: т. 7,355 м.ч., 7,5 Гц (1Н); д. 7,520 м.ч., 7,8 Гц (1Н); м. 7,625-7,752 м.ч. (3Н); д.д. 8,124 м.ч., 8,1 Гц, 1,2 Гц (1Н); д.д. 8,289 м.ч., 8,1 Гц, 1,5 Гц (1Н); д. 8,460 м.ч., 7,5 Гц (1Н). Rf 0,46 (бензол - триетиламін 10:1); Rf 0,08 (хлороформ - ацетон 10:1). Приклад 4. 6-(2-морфолін-1-іл)-етил]-6Н-індоло[2,3b]хіноксалін (2). Розчинили 0,81 г (0,0025 моль) 6-(2бромоетил)-6Н-індоло[2,3-b]хіноксаліну (15) в 50 3 3 см бензолу, додали 0,54 см (0,54 г, 0,00625 моль) морфоліну. Реакційну суміш кип'ятили при перемішуванні протягом 6 год. Потім охолодили, відфільтрували, осад на фільтрі промили бензо3 лом (3x3 см ). Фільтрат випарили, кубовий зали3 шок розчинили в 25 см бензолу, екстрагували 10 3 %-ою оцтовою кислотою (3х30 см ). У водний екстракт додали насичений розчин Nа2СО3 до рН=9. Осад, що випав, відфільтрували, промили на фі3 льтрі водою (3x5 см ) та висушили. Продукт очищували методом колоночної хроматографії (елюент: бензол - триетиламін 20:1). Вихід: 0,78 г (93 %). C20H20N4O. M.W. 332,41. Т пл.=125-126 °С. + Мас-спектр - m/z (I, %): 333 (100) - МН ; 247 (22); 233 (10); 220 (14); 100 (43); 77 (6). Спектр ПМР (CDCl3): аліфатичні СН: т. 2,600 м.ч., 4,5 Гц (4Н, O(CH2CH2)2N(al)); т. 2,864 м.ч., 6,9 Гц (2Н, N(аліф)CH2CH2N(аром)); 3,613 м.ч., 4,8 Гц (4Н, O(CH2CH2)2N(al)); т. 4,613 м.ч., 6,9 Гц (2Н, N(аліф)CH2CH2N(аром)); ароматичні СН: т. 7,377 м.ч., 7,2 Гц (1Н); д. 7,502 м.ч., 8,1 Гц (1Н); м. 7,6437,774 м.ч. (3Н); д.д. 8,113 м.ч., 7,8 Гц, 1,2 Гц (1H); д.д. 8,292 м.ч., 7,8 Гц, 1,5 Гц (1Н); д. 8,487 м.ч., 7,8Гц (1H). Rf 0,53 (бензол - триетиламін 10:1); 7f 0,29 (хлороформ - ацетон 10:1). Приклад 6. Визначення цитотоксичності препаратів в умовах in vitro клітин за дією на моношар клітин та пригніченням їх життєздатності на культурах клітин L929 та ПТП. Культури клітин перевивної лінії фібробластів мишей (L929) та текстикул поросяти (ПТП) вирощували у 96-лункових мікроплатах (в атмосфері, що містить 5 % СО2). Через 24 год. з лунок, де сформувався суцільний моношар клітин, видаляли середовище росту і вносили підтримуюче середовище із розчиненими препаратами в діапазоні концентрацій від 0,1-100 М (на одне розведення не менше 4 лунок). Контроль - лунки, в які було внесене тільки середовище для підтримання росту. Плати поміщали в термостат. Через 24 та 48 год. після інкубації плат при 36 °С в умовах 5 % СО2 клітини розглядали за допомогою інвертованого мікроскопу при малому збільшенні з метою виявлення цитопатичної дії (ЦПД) препаратів, яку оцінювали за порушенням цілісності моношару, появою осередків дегенерованих клітин та визначали за чотириплюсовою системою. Визначали: 3 ТЦД100 - тканинну цитотоксичну дозу (мкг/см ), що викликає повну деструкцію клітин, ТЦД50 - тканин3 ну цитотоксичну дозу (мкг/см ), що викликає зміну 50 % моношару клітин; МВК - максимально витримувану концентрацію - максимальну із дослідже3 них доз речовини (мкг/см ), що не викликає незво 7 ротніх змін у морфології та життєздатності клітин у порівнянні з контролем (фактично вона відповідає ТЦД0). Розрахунок ТЦД50 проводили за методом Ріда і Менча за формулами: log2 ТЦД50=log2A-(50-b)log2d/(а-b) чи log2 ТЦД50=log2В+(а-50)log2d/(а-b), де log2А і Iog2В - логарифми концентрацій за основою 2, що викликали ефекти відповідно більше чи менше 50 %, але найближчі до 50 %: а і b – ефект, викликаний концентраціями А і В, %: log2d логарифм за основою 2 співвідношення між досліджуваними концентраціями. Статистичну обробку результатів виконували згідно з (див. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1990, с. 298-303) при Р