Спосіб отримання днк для полімеразно-ланцюгової реакції із тканин пухлини

Реферат: Спосіб отримання ДНК для полімеразно-ланцюгової реакції(ПЛР) із тканин пухлини, що є молекулярно-генетичним методом досліджень. Для спрощення зберігання досліджуваних тканин та широкого і доступного використання методів на основі ПЛР, використовують фіксовані формаліном та заключні в парафін зразки різних тканин, в т.ч. пухлин людини, шляхом отримання із них гістологічних тонких зрізів. Далі прогрівають ці зразки при температурі в лізуючому розчині, який використовується для ПЛР з наступним охолодженням. Беруть ДНК із під парафінової плівки лізуючого розчину, в якому міститься вивільнена із тканини ДНК для подальшого її використання в ПЛР. UA 99734 U (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ ДНК ДЛЯ ПОЛІМЕРАЗНО-ЛАНЦЮГОВОЇ РЕАКЦІЇ ІЗ ТКАНИН ПУХЛИНИ UA 99734 U UA 99734 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме нейрохірургії та молекулярногенетичної діагностики може бути використана для визначення різних генетичних змін в ДНК при різних пухлинах в т.ч. і при пухлинах мозку. Протягом останніх років в медицині та біології та ветеринарію впроваджені високочутливі та високо специфічні методи досліджень на основі імуногістохімії та молекулярно-генетичних розробок, які суттєво розширили погляди на клітинно-молекулярні процеси в нормі та порушення, які виникають при патології. Особливе місце серед широкого спектру займає полімерно-ланцюгова реакція (ПЛР), яка завдяки простоти виконання не лише широко впроваджується в різних галузях та науках, а й дозволила отримати можливості вивчати глибокі генетичні та молекулярні процеси в клітинах організму (1, 2). Методика ПЛР складається із 3-х основних етапів, які досить детально описані в багатьох посібниках та адаптовані для різних практичних та наукових задач (3, 4, 5). Існує більше 50 варіантів поставок ПЛР, серед яких самими сучасними та високо інформаційними є методики автоматичної ПЛР в реальному часі, яка складає не тільки якісне, а й кількісне уявлення про експресію генів, поліморфізм певних генів, синтез РНК та ДНК (4, 5). Важливим етапом проведення ПЛР є так названа пробопідготовка, яка полягає в виділенні із тканини молекули ДНК, очистки та збереження її для подальшої роботи (1, 2). Для цього розроблені спеціальні стандартні розчини та процедури. Такі умови необхідні для того щоб не допустили руйнування ДНК, а саме ДНК-азою, яка є ферментом приводить до розривів ДНК та її фрагментації на маленькі частки, що робить неможливим проведення реакції ПЛР по причині загибелі руйнування молекул ДНК. В той же час отримання ДНК для ПЛР необхідно використовувати живі клітини або заморожені в рідкому азоті при t° - 170 °C клітини тканини. Все це ускладнює використання цієї методики та обмежує її широке використання, так як не завжди можливість брати в роботу живі клітини або їх зберігати в умовах низьких температур, що є суттєвим недоліком цього методу. Іншим недоліком є те, що постановка ПЛР з виділенням ДНК із живих клітин, обмежує можливості ретроспективного аналізу матеріалу із-за необхідності тривалого його накопичення та збереження в умовах низьких температур, що є гальмівним чинником при використанні даного методу. Для тривалого зберігання матеріалу, який планується досліджувати, необхідно спеціальні морозильні сосуди з рідким азотом, та сам азот, що дуже дорого і не завжди є можливість систематично отримувати рідкий азот для цих цілей. Задачею корисної моделі є розробка способу отримання ДНК із уже фіксованих та проведених через парафін зразків тканин, в т.ч. і пухлин, що дозволить отримувати ДНК із гістологічного матеріалу і тим самим розширити можливість використання ПЛР та спростить методику збереження матеріалу без використання живих клітин або низьких температур. Поставлена задача вирішується тим, що для спрощення зберігання досліджуваних тканин та широкого і доступного використання методів на основі ПЛР, використовують фіксовані формаліном та заключні в парафін зразки різних тканин, в т.ч. пухлин людини, шляхом отримання із них гістологічних тонких зрізів товщиною до 10 нм, далі прогрівають ці зразки при температурі 60-62 °C в лізуючому розчині, який використовується для ПЛР з наступним охолодженням до температури 4-8 °C і беруть ДНК із під парафінової плівки лізуючого розчину, в якому міститься вивільнена із тканини ДНК для подальшого її використання в ПЛР. Таким чином для швидкого отримання ДНК із досліджуваного біологічного матеріалу використовується в якості об'єкту парафінізовані зразки тканин, які були підготовлені загально признаними гістологічними методами та які можуть зберігатися у звичайних умовах досить тривалий час, який може визначатися роками. Запропонований спосіб здійснюється наступним чином у кілька етапів. 1 етап - підготовчий, проводиться відбір гістологічних парафінних зразків, з яких планується отримання ДНК. З кожного зразка тканин отримувані на мікротомі 2-3 зрізи товщиною 5-7 мікрон, які переносили в пробірку "епендорф" та добавляли 300 мкл лікуючого розчину, який використовується в стандартних наборах для ПЛР. 2 етап - депарафінізація гістологічних зрізів, яка досягалась нагріванням до 60-62 С пробірок із забраним матеріалом протягом 30 хвилин. За цей час парафін розплавлявся і підіймався над лікуючим розчином, так як температура плавлення парафіну 42° і він легший води, а біологічна тканина, яка досліджується, звільняється від парафіну і під дією лікуючого розчину руйнується, що приводить до вивільнення в розчин молекул ДНК. Вибір температури прогрівання був підібраний емпірично, шляхом відпрацьованих умов, при цій температурі плавиться не лише парафін, а й денатуруються ферменти та білки, в т.ч. і залишки ДНКази. 3 етап - розділення лікуючого розчину з ДНК та парафіну. Цей етап проводиться шляхом центрифугування при 12000 об/хв. 5 хвилин, нагрітих до 60° пробірок з реакційною сумішшю. 1 UA 99734 U 5 10 15 20 25 При цьому проходить повністю відокремлення парафіну від рідини. Після центрифугування пробірки ставляться в холодильник при t – 4 °С на 10-15 хвилин. За цей час відбувається затвердіння парафіну зверху над рідиною, що забезпечує після його проколу піпеткою забрати всю рідину та залишки тканин, яка залишилась під плівкою із парафу в чисту пробірку епендорф. Зібрану рідину, яка складається із лізуючого розчину та ДНК і залишків гістологічних зрізів в об'ємі 100 мкл використовувати для подальшого очищення, згідно методики проведення ПЛР. Методика ПЛР для визначення наявності ДНК патогенів або окремих генів проводиться, як відомо, в 3 стадії (1, 3, 5). Перша стадія - виділення ДНК із біологічного матеріалу за допомогою описаного вище методу та отримання чистої ДНК за допомогою реактивів ТОВ "Амплісенс", Росія. Друга стадія ПЛР складається з ампліфікації (розмноження) ДНК збудника з відомим вірусним фрагментом ДНК (праймером) в спеціальному середовищі протягом 2-3 годин. Третя стадія проведення електрофореза в агарозному гелі, виділеної та розмороженої ДНК та оцінка результатів реакції за допомогою програмного забезпечення "БіоТест". В роботі при постановці реакції ПЛР можуть використовуватись різні набори, таких фірм як "Амплісенс". "ДНКтехнологія", "ГенеРак" (Росія) та інші. Прикладом застосування запропонованого методу виділення ДНК із парафінних зрізів пухлин людини, може бути робота по вивченню вмісту в пухлинах мозку вірусу герпеса 4 типу (вірус Епштейна-Барр), який є онкогеном, що визиває пухлини гортані та лімфоїдної тканини. Біло відібрано для дослідження 21 гістологічних зразка злоякісних гліом мозку III та IV стадії анаплазії та 39 гістологічних зразків медулобластом, які накопились в гістологічній лабораторії за 5 років при постановці гістологічного діагнозу встановленні типу та ступеня злоякісності пухлин. Було проведено виділення ДНК із гістологічних зразків запропонованим способом "отримання ДНК", а потім було проведено дослідження наявності онковірусу герпеса 4 типу в цих зразках пухлин. В якості контрольного гена був отриманий ген -актину, який є присутнім у всіх клітинах і виявлення якого в ПЛР свідчить про наявність повноцінної ДНК та вірного проведення реакції (позитивний контроль на ДНК). Результати цих досліджень показані в таблиці. Тип пухлин Злоякісні гліоми III та IV стадії анаплазії Медулобластом и Кількість зразків Наявність гену -актину в ДНК Наявність вірусу герпеса 4 типу 21 21 (100 %) 67 (33,3 %) 39 39 (100 %) 5 (13 %) 30 35 40 45 50 55 Таким чином, як видно із даних таблиці, у всіх зразках була присутня ДНК про те, що свідчить 100 % визначення гену -актину в цих пухлинах, тобто запропонованим методом можна виділити клітину ДНК, а також досліджували різні клітинні гени. В той же час кількість пухлин, що мали в собі онковіруси була різна в злоякісних пухлинах онковірус виявляється в кожній третій пухлині (33,3 %), тоді медулобластомах цей онковірус визначався в 13 % спостережень, що дозволяє говорить про те, що цей онковірус може бути причиною розвитку певної частини пухлин, причому в гліомах він знаходиться частіше, ніж в медулобластомах. Крім того, хворих, які мають вірус в крові потрібно лікувати не лише проти пухлин, але і проти вірусів. Якщо ж використовувати для цієї мети живі клітини пухлин зразу після операції, то цю роботу виконати практично неможливо із-за необхідності проведення більше 50 досліджень ПЛР, а матеріал для неї збирати кілька років. Якщо використовувати для цієї мети заморожені при низькій температурі зразки, то потрібно спеціальне обладнання та наявність рідкого азоту, щоб підтримувати набраний матеріал протягом 3-5 років. А це не лише дорого, а й організаційно складно здійснювати, щоб забезпечити безперебійну поставку холодоагенту. Таким чином, розроблений метод дає можливість широко використовувати метод ПЛР в різних лабораторіях, а також використовувати архівний гістологічний матеріал для вивчення питань пов'язаних з молекулами ДНК збудників та клітин. Запропонований нами спосіб має такі переваги: - розроблений метод дозволяє отримувати ДНК для реакції із неживої, формалізованої тканини; - розроблений метод значно спрощує збір та зберігання вихідного матеріалу для проведення досліджень; - розроблений метод не є дорого вартісним і не потребує спеціального обладнання; - розроблений метод не потребує постійного контролю за збереженням зразків та забезпеченням реагентами для зберігання; 2 UA 99734 U 5 10 15 - розроблений метод значно розширює можливості використання ПЛР в практичній та науковій роботі не лише в великих центрах, а й в маленьких лабораторіях; - розроблений метод дозволяє одночасно з ПЛР співставляти дані з гістологічними особливостями, що дає нову наукову якість. Джерела інформації: 1. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения. Москва, Россия. 1996. - 15 с. 2. Меньшиков В.В. Молекулярно-биологические исследования в клинической лабораторной диагностике: возможности проблемы (лекция). Клиническая лабораторная диагностика. - 2006, № 3. - С. 23-30. 3. Глоба А.Г., Демидова B.C., Дикова О.Н. Определение уровня экспрессии генов цитокинов и маркеров апоптоза методом полимеразной цепной реакции в реальном времени у пациентов с хирургической инфекцией. Молекулярная медицина. - 2007, № 7. - С. 48-51. 4. Трофимов Д.Ю., Бурминская О.В., Батенева Е.И. и др. Разработка комплекса Тест систем на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени для определения цитокинового профиля в мононуклеарных клетках крови. Медицинская иммунология. - 2008, № 6. - С. 513-570. 5. Nishimura N. et al. Direct polymerase chain reaction from whole blood without DNK isolation. Ann. Clin. Biochim. - 2000,V. 37. - P. 674-800. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб отримання ДНК для полімеразно-ланцюгової реакції(ПЛР) із тканин пухлини, що є молекулярно-генетичним методом досліджень, який відрізняється тим, що для спрощення зберігання досліджуваних тканин та широкого і доступного використання методів на основі ПЛР, використовують фіксовані формаліном та заключні в парафін зразки різних тканин, в т. ч. пухлин людини, шляхом отримання із них гістологічних тонких зрізів товщиною до 10 нм, далі прогрівають ці зразки при температурі 60-62 °C в лізуючому розчині, який використовується для ПЛР з наступним охолодженням до температури 4-8 °C і беруть ДНК із під парафінової плівки лізуючого розчину, в якому міститься вивільнена із тканини ДНК для подальшого її використання в ПЛР. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3