Аналоги інсуліноподібного фактора росту-1 (igf-1), що містять амінокислотну заміну в положенні 59

Реферат: Винахід стосується аналогів інсуліноподібного фактора росту-1 (IGF-1), що містять амінокислотну заміну у положенні 59, та іншу(і) заміну(и), фармацевтичних композицій, що містять вказані аналоги, і застосування вказаних аналогів для лікування станів або захворювань, опосередкованих зв′язуванням рецептора IGF-1. UA 103104 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Галузь винаходу Даний винахід стосується нових аналогів інсуліноподібного фактора росту-1 (IGF-1), фармацевтичних композицій, що містять вказані аналоги, і застосування вказаних аналогів для лікування станів, опосередкованих IGF-1-рецептором, таких як низькорослість, терапії діабету, лікування нейродегенеративних захворювань і для відновлення хряща. Більш конкретно, даний винахід стосується нових аналогів IGF-1, що містять амінокислотну заміну у положенні 59, 59 наприклад, (Asn )hIGF-1(1-70)-OH та іншу(і) заміну(и), як це визначено в описі. Попередній рівень техніки IGF-1 являє собою поліпептидний гормон довжиною 70 амінокислот, що характеризується інсуліноподібною і мітогенною ростовою біологічною активністю. Даний гормон посилює ріст клітин у різних тканинах, включаючи м'язово-скелетні системи, печінку, нирки, кишечник, тканини нервової системи, серце і легені. IGF-1 дикого типу має наведену нижче амінокислотну послідовність з трьома 6 48 47 міжланцюжковими дисульфідними містками, де бічні ланцюги кожної пари залишків A і A , A і 52 18 61 A та A і A утворюють дисульфідний зв'язок (SEQ ID NO: 50): Хоча IGF-1 присутній у різноманітних тканинах організму, звичайно він знаходиться у неактивній формі, в якій він зв'язаний з IGF-зв'язувальним білком (IGFBP). Відомо шість споріднених IGFBP і їх позначають IGFBP1-IGFBP6. Див., наприклад, Holly and Martin, "Insulinlike Growth Factor Binding Proteins: А Review of Methodological Aspects of Their Purification, Analysis and Regulation", Growth Regul., 4(Suppl 1):20-30 (1994). IGFBP грають важливу роль у регуляції IGF-1 за рахунок наявності інгібіторного і/або стимулюючого ефектів на дію IGF-1. Наприклад, приблизно 90 % циркулюючого IGF-1 присутні у тримолекулярному комплексі, що містить IGFBP-3 і чутливу до кислотності додаткову молекулу. IGF-1 у складі таких комплексів не може зв'язуватися з поверхневими рецепторами і тому він не активний біологічно. IGF-1, присутній у складі тримолекулярного комплексу, також характеризується істотно більш тривалим періодом напівжиття, ніж IGF-1, що не входить у комплекс. Порушення дії IGF-1 може здійснювати внесок у деякі фізіологічні порушення, включаючи нейродегенеративні захворювання, такі як хвороба рухового нейрона (тобто бічний аміотрофічний склероз (ALS)), м'язова дистрофія і розсіяний склероз, захворювання хрящів, такі як остеоартрит, кісткові захворювання, такі як остеопороз, запальні захворювання, такі як ревматоїдний артрит, ішемічні ушкодження органів, таких як серце, головний мозок або печінка, і так далі. Як добре відомо фахівцям у даній галузі, відомі і потенційні варіанти застосування IGF-1 різноманітні і багаточисленні. Наприклад, у ряді досліджень повідомляється про застосування IGF-1 як потенційного терапевтичного засобу для лікування нейродегенеративних станів. Див., наприклад, Kanje et al., Brain Res., 486:396-398 (1989); Hantai et al., J. Neurol. Sci., 129:122-126 (1995); Contreras et al., Pharmac. Exp. Therap., 274:1443-1499 (1995); Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 22:1960 (1996); Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 23:894 (1997); Hsu et al., Biochem. Mol. Med., 60(2):142-148 (1997); Gorio et al., Neuroscience, 82:1029-1037 (1998). Терапія IGF-1 показана при багатьох неврологічних станах, включаючи ALS, інсульт, епілепсію, хворобу Паркінсона, хворобу Альцгеймера, гостре травматичне ушкодження та інші порушення, асоційовані з травмою, старінням, захворюванням або ушкодженням. Див., наприклад, патенти США №№ 5093137; 5652214; 5703045; міжнародні публікації WO 90/1483 і WO 93/02695. Застосування терапії IGF-1 при різних інших станах згадується у ряді публікацій. Див. наприклад, Schalch et al., "Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors", ed. Spencer (Elsevier, New York), pp. 705-714 (1991); Clemmons and Underwood, J. Clin. Endocrinol. Metab., 79(1):4-6 (1994); і Langford et al., Eur. J. Clin. Invest., 23(9):503-516 (1993) (що стосуються, наприклад, резистентних до інсуліну станів і діабету); і O'Shea et al., Am. J. Physiol., 264:F917-F922 (1993) (що стосується, наприклад, ниркової недостатності). Також див. патент США № 7258864 (що стосується низькорослості); патенти США №№ 5110604 і 5427778 (що стосуються, наприклад, загоєння ран); патент США № 5126324 (що стосується, наприклад, серцевих захворювань і 1 UA 103104 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 затримки росту); патент США № 5368858 (що стосується, наприклад, дефектів або пошкоджень хряща); патенти США №№ 5543441 і 5550188 (що стосуються, наприклад, косметичної пересадки тканини); патент № 5686425 (що стосується, наприклад, тканини шрамів, локалізованої м'язової дисфункції і нетримання сечі); і патент США № 5656598 (що стосується, наприклад, росту кістки). Також див. міжнародні публікації WO 91/12018 (що стосується, наприклад, захворювань кишечнику); WO 92/09301 і WO 92/14480 (що стосуються, наприклад, загоєння ран); WO 93/08828 (що стосується, наприклад, ушкодження нейронів, асоційованого з ішемією, гіпоксією або нейродегенерацією); WO 94/16722 (що стосується, наприклад, стійкості до інсуліну); WO 96/02565A1 (що стосується, наприклад, комплексу IGF/IGFBP для стимуляції утворення кістки і для регуляції реструктурування кістки); публікацію заявки на видачу патенту США 2003/0100505 (що стосується, наприклад, остеопорозу) і публікацію заявки на видачу патенту США 2005/0043240 (що стосується ожиріння). Хоча терапію IGF-1 використовують для ряду фізіологічних показань, результати іноді непередбачувані. Короткострокові сприятливі ефекти іноді не зберігаються (див., наприклад, Miller et al., Kidney International, 46:201-207 (1994)), і можуть виникати несприятливі побічні ефекти, зокрема, від введення високих доз і/або тривалого введення (див., наприклад, Jabri et al., Diabetes, 43:369-374 (1994); Wilton, Acta Paediatr., 393:137-141 (1992)). Також повідомлялося, що високі концентрації IGF-1 підвищують ризик раку передміхурової залози (Chan et al., Science, 278:563-566 (1998)). Відповідно до цього, у даній галузі існує потреба у кращих шляхах лікування станів, які реагують на IGF-1 і/або інші білки, які зв'язуються з білками, що зв'язують інсуліноподібний фактор росту. Даний винахід задовольняє дані потреби і додатково надає інші пов'язані з ними переваги. Суть винаходу Як виявлено авторами даного винаходу, за рахунок заміни залишку метіоніну у положенні 59 IGF-1 дикого типу, який є хімічно нестабільним і може легко окиснюватися іншою 59 амінокислотою, як описано у даному документі, наприклад, (Asn )hIGF-1(1-70)-OH, одержані у результаті аналоги IGF-1 стають хімічно більш стабільними і, як такі, менш чутливі до окиснення під час продукування, очищення, зберігання і т.д. В одному з аспектів даний винахід стосується пептидних варіантів (тобто аналогів) IGF-1 наведеної нижче формули (І): , в якій: -1 А являє собою Met, Ser або делетована; 1 A являє собою Gly, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu або делетована; 2 A являє собою Pro, Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, Lys або делетована; 3 A являє собою Glu, Ala, Asp, Gln або делетована; 4 A являє собою Thr, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Ser; 5 A являє собою Leu, Acc, Ala, Ile або Val; 6 A являє собою Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, β-Me-Cys, D-β-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen або D-Pen; 7 A являє собою Gly, Ala, Asn, Asp, Gln або Glu; 8 A являє собою Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu або Lys; 9 A являє собою Glu, Ala, Asp або Gln; 10 A являє собою Leu, Acc, Ala, Ile або Val; 11 A являє собою Val, Ala, Ile або Leu; 12 A являє собою Asp, Ala, Arg, Asn, Gln, Glu або Lys; 13 A являє собою Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu або Val; 14 A являє собою Leu, Acc, Ala, Ile або Val; 15 A являє собою Gln, Ala, Asn, Asp або Glu; 16 A являє собою Phe, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Trp або Tyr; 17 A являє собою Val, Ala, Ile або Leu; 2 UA 103104 C2 18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A являє собою Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, β-Me-Cys, D-β-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen або D-Pen; 19 A являє собою Gly, Ala, Asn, Asp, Gln або Glu; 20 A являє собою Asp, Ala, Asn, Gln або Glu; 21 A являє собою Arg, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu або Lys; 22 A являє собою Gly, Ala, Asn, Asp, Gln або Glu; 23 A являє собою Phe, Ala, Trp або Tyr; 24 A являє собою Tyr, Ala, Phe або Trp; 25 A являє собою Phe, Ala, Trp або Tyr; 26 A являє собою Asn, Ala, Asp, Gln, Glu, Ser або Thr; 27 A являє собою Lys, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu або Pro; 28 A являє собою Pro, Ala, Arg або Lys; 29 A являє собою Thr, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu або Ser; 30 A являє собою Gly, Ala, Asn, Asp, Gln або Glu; 31 A являє собою Tyr, Ala, Phe або Trp; 32 A являє собою Gly, Ala, Asn, Asp, Gln або Glu; 33 A являє собою Ser, Ala, Thr або Val; 34 A являє собою Ser, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu або Thr; 35 A являє собою Ser, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu або Thr; 36 A являє собою Arg, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu або Lys; 37 A являє собою Arg, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu або Lys; 38 A являє собою Ala, Asn, Asp, Gln або Glu; 39 A являє собою Pro, Ala, Arg або Glu; 40 A являє собою Gln, Ala, Asn, Asp або Glu; 41 A являє собою Thr, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu або Ser; 42 A являє собою Gly, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu або Lys; 43 A являє собою Ile, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu або Lys; 44 A являє собою Val, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu або Lys; 45 A являє собою Asp, Ala, Arg, Asn, Gln, Glu або Lys; 46 A являє собою Glu, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln або Lys; 47 A являє собою Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, β-Me-Cys, D-β-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen або D-Pen; 48 A являє собою Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, β-Me-Cys, D-β-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen або D-Pen; 49 A являє собою Phe, Ala, Arg, Ile, Leu, Lys, Ser, Thr, Trp, Tyr або Val; 50 A являє собою Arg, Ala, Lys, Ser або Thr; 51 A являє собою Ser, Aib, Ala, Arg, Lys або Thr; 52 A являє собою Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, β-Me-Cys, D-β-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen або D-Pen; 53 A являє собою Asp, Ala, Arg, Asn, Gln, Glu, Lys, Ser або Thr; 54 A являє собою Leu, Acc, Ala, Ile або Val; 55 A являє собою Arg, Ala, Ile, Leu, Lys, Phe, Trp, Tyr або Val; 56 A являє собою Arg, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu або Lys; 57 A являє собою Leu, Acc, Ala, Ile або Val; 58 A являє собою Glu, Acc, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln або Lys; 59 A являє собою Acc, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu, Lys, Nle, Ser, D-Ser, Thr, Trp, Tyr або Val; 60 A являє собою Tyr, Ala, Phe або Trp; 61 A являє собою Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, β-Me-Cys, D-β-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen або D-Pen; 62 A являє собою Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu або Val; 63 A являє собою Pro, D-Pro, Ala, Ser, Thr або делетована; 64 A являє собою Leu, D-Leu, des-Leu, Ala, Ile, Val або делетована; 65 A являє собою Lys, D-Lys, des-Lys, Ala, Arg, Ile, Leu, Val або делетована; 66 A являє собою Pro, D-Pro, Ala або делетована; 67 A являє собою Ala, D-Ala, Aib або делетована; 68 A являє собою Lys, D-Lys, Ala, Arg, Ile, Leu, Val або делетована; 69 A являє собою Ser, D-Ser, Aib, Ala, Thr або делетована; 70 A являє собою Ala, D-Ala, Asn, Asp, Gln, Glu або делетована; 71 A являє собою Asn, Ala, Asp, Gln, Glu, Lys, Ser, Thr або делетована; і 3 UA 103104 C2 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 R являє собою OH або NH2; 6 48 47 52 18 61 за умови, що бічні ланцюги кожної пари залишків A і A , A і A та A і A утворюють дисульфідний зв'язок; і 59 також за умови, що коли A являє собою Leu, Ile, Nle, Thr або Val, аналог містить щонайменше одну додаткову амінокислотну заміну або вставку, визначену у цьому документі. У формулі (I) переважні амінокислотні заміни і доповнення визначені наступним чином: -1 А являє собою Met, Ser або делетована; 1 A являє собою Gly або делетована; 2 A являє собою Pro, Lys або делетована; 3 A являє собою Glu або делетована; 4 A являє собою Thr; 5 A являє собою Leu; 6 A являє собою Cys, hCys, β-Me-Cys, N-Me-Cys або Pen; 7 A являє собою Gly; 8 A являє собою Ala; 9 A являє собою Glu; 10 A являє собою Leu; 11 A являє собою Val; 12 A являє собою Asp; 13 A являє собою Ala; 14 A являє собою Leu; 15 A являє собою Gln; 16 A являє собою Phe; 17 A являє собою Val; 18 A являє собою Cys, hCys, β-Me-Cys, N-Me-Cys або Pen; 19 A являє собою Gly; 20 A являє собою Asp; 21 A являє собою Arg; 22 A являє собою Gly; 23 A являє собою Phe; 24 A являє собою Tyr; 25 A являє собою Phe; 26 A являє собою Asn; 27 A являє собою Lys, Arg або Pro; 28 A являє собою Pro або Lys; 29 A являє собою Thr; 30 A являє собою Gly; 31 A являє собою Tyr; 32 A являє собою Gly; 33 A являє собою Ser; 34 A являє собою Ser; 35 A являє собою Ser; 36 A являє собою Arg; 37 A являє собою Arg; 38 A являє собою Ala; 39 A являє собою Pro; 40 A являє собою Gln; 41 A являє собою Thr; 42 A являє собою Gly; 43 A являє собою Ile; 44 A являє собою Val; 45 A являє собою Asp; 46 A являє собою Glu; 47 A являє собою Cys, hCys, β-Me-Cys, N-Me-Cys або Pen; 48 A являє собою Cys, hCys, β-Me-Cys, N-Me-Cys або Pen; 49 A являє собою Phe, Arg, Leu або Thr; 50 A являє собою Arg або Ser; 51 A являє собою Ser, Aib, Arg або Thr; 52 A являє собою Cys, hCys, β-Me-Cys, N-Me-Cys або Pen; 53 A являє собою Asp, Arg або Ser; 4 UA 103104 C2 54 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A являє собою Leu або A6c; A55 являє собою Arg або Tyr; 56 A являє собою Arg або Gln; 57 A являє собою Leu; 58 A являє собою Glu або Arg; 59 A являє собою A6c, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu, Nle, Ser, D-Ser, Trp або Tyr; 60 A являє собою Tyr або Phe; 61 A являє собою Cys, hCys, β-Me-Cys, N-Me-Cys або Pen; 62 A являє собою Ala або Asn; 63 A являє собою Pro, D-Pro, Thr або делетована; 64 A являє собою Leu, D-Leu, des-Leu або делетована; 65 A являє собою Lys, D-Lys, des-Lys, Arg або делетована; 66 A являє собою Pro, D-Pro або делетована; 67 A являє собою Ala, D-Ala, Aib або делетована; 68 A являє собою Lys, D-Lys, Arg або делетована; 69 A являє собою Ser, D-Ser, Aib, Thr або делетована; 70 A являє собою Ala, D-Ala, Glu або делетована; і 71 A являє собою Asp, Glu, Lys, Ser або делетована. 59 Підмножина сполук, що охоплюється формулою (I), включає сполуки, в яких A являє собою Asn. 59 Інша підмножина сполук, що охоплюється формулою (I), включає сполуки, в яких A являє собою Leu, де вказані сполуки містять щонайменше одну додаткову амінокислотну заміну або 27 65 68 49 47 52 вставку, вибрану з групи, що складається з Arg , Arg , Arg , Leu , -Me-Cys , -Me-Cys , 51 69 71 71 71 71 Thr , Thr , Asp , Glu , Lys і Ser . 59 Ще одна підмножина сполук, що охоплюється формулою (I), включає сполуки, в яких A являє собою Nle, де вказані сполуки містять щонайменше одну додаткову амінокислотну заміну, 51 67 69 54 47 48 52 61 вибрану з групи, що складається з Aib , Aib , Aib , A6c , N-Me-Cys , N-Me-Cys Pen і Pen . 59 Ще одна підмножина сполук, що охоплюється формулою (I), включає сполуки, в яких A являє собою Ile, де вказані сполуки містять щонайменше одну амінокислотну заміну, вибрану з 58 49 51 53 групи, що складається з Arg , Arg , Arg і Arg . 59 Ще одна підмножина сполук, що охоплюється формулою (I), включає сполуки, в яких A являє собою Arg, Asp, A6c, Gln, Glu, Ser, Trp або Tyr. Переважні сполуки формули (I) являють собою: 59 Приклад 1: (Asn )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 1) 59 Приклад 2: (Asn )hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO: 2) 59 Приклад 3: (Asn )hIGF-1(4-70)-ОH; (SEQ ID NO: 3) 27 28 59 Приклад 4: (Pro , Lys , Asn )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 4) 27 28 59 Приклад 5: (Pro , Lys , Asn )hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO: 5) 53 59 Приклад 6: (Ser , Asn )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 6) 1 59 Приклад 7: (Ser-Gly , Asn )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 7) 59 63 64 65 70 Приклад 8: (Asn , Thr , des-Leu , des-Lys , Glu )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 8) 55 59 Приклад 9: (Tyr , Asn )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 9) 49 59 Приклад 10: (Thr , Asn )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 10) 59,62 Приклад 11: (Asn )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 11) 59 60 Приклад 12: (Asn , Phe )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 12) 50 59 Приклад 13: (Ser , Asn )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 13) 56 59 Приклад 14: (Gln , Asn )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 14) 59 63 Приклад 15: (Asn , D-Pro )hIGF-1(1-70)-OH; 59 64 Приклад 16: (Asn , D-Leu )hIGF-1(1-70)-OH; 59 65 Приклад 17: (Asn , D-Lys )hIGF-1(1-70)-OH; 59 66 Приклад 18: (Asn , D-Pro )hIGF-1(1-70)-OH; 59 67 Приклад 19: (Asn , D-Ala )hIGF-1(1-70)-OH; 59 68 Приклад 20: (Asn , D-Lys )hIGF-1(1-70)-OH; 59 69 Приклад 21: (Asn , D-Ser )hIGF-1(1-70)-OH; 59 70 Приклад 22: (Asn , D-Ala )hIGF-1(1-70)-OH; 27,65,68 59 Приклад 23: (Arg , Leu )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 15) 59 65,68 Приклад 24: (Leu , Arg )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 16) 49,59 Приклад 25: (Leu )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 17) 52 59 Приклад 26: (-Me-Cys , Leu )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 18) 47 59 Приклад 27: (-Me-Cys , Leu )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 19) 5 UA 103104 C2 59 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 71 Приклад 28: (Leu , Glu )hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID N0:20) 59 71 Приклад 29: (Leu , Asp )hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO: 21) 59 71 Приклад 30: (Leu , Lys )hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO: 22) 59 71 Приклад 31: (Leu , Ser )hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO: 23) 59 69 Приклад 32: (Leu , Thr )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 24) 51 59 Приклад 33: (Thr , Leu )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 25) 47 59 Приклад 34: (N-Me-Cys , Nle )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 26) 59 69 Приклад 35: (Nle , Aib )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 27) 48 59 Приклад 36: (N-Me-Cys , Nle )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 28) 59 67 Приклад 37: (Nle , Aib )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 29) 52 59 Приклад 38: (hCys , Nle )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQIDNO:30) 51 59 Приклад 39: (Aib , Nle )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID N0:31) 52 59 Приклад 40: (Pen , Nle )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 32) 59 61 Приклад 41: (Nle , Pen )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 33) 54 59 Приклад 42: (A6c , Nle )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 34) 53 59 Приклад 43: (Arg , Ile )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 35) 49 59 Приклад 44: (Arg , Ile )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 36) 51 59 Приклад 45: (Arg , Ile )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 37) 58 59 Приклад 46: (Arg , Ile )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 38) 59 Приклад 47: (A6c )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 39) 59 Приклад 48: (Asp )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 40) 59 Приклад 49: (Trp )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 41) 59 Приклад 50: (Ser )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 42) 59 Приклад 51: (Tyr )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 43) 59 Приклад 52: (Glu )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 44) 59 Приклад 53: (Gln )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 45) 59 Приклад 54: (Arg )hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO: 46) і 1 59 Приклад 55: (Met-Gly , Asn )hIGF-1(1-70)-ОH; (SEQ ID NO: 47). Докладний опис винаходу У заявці використовуються наведені нижче загальноприйняті скорочення: Acc: 1-аміно-1-цикло(C3-C9)алкілкарбонова кислота Acc включає: A3c: 1-аміно-1-циклопропанкарбонову кислоту A4c: 1-аміно-1-циклобутанкарбонову кислоту A5c: 1-аміно-1-циклопентанкарбонову кислоту A6c: 1-аміно-1-циклогексанкарбонову кислоту Aib: α-аміноізомасляна кислота Ala або А: аланін Arg або R: аргінін Asn або N: аспарагін Asp або D: аспарагінова кислота Cys або С: цистеїн цистин: дисульфідний димер цистеїну hCys: гомоцистеїн β-Me-Cys: бета-метилцистеїн, тобто (2S, 3S)-2-аміно-3-меркаптомасляна кислота N-Me-Cys: N-метилцистеїн Gln або Q: глутамін Glu або Е: глутамінова кислота Gly або G: гліцин Ile або I: ізолейцин Leu або L: лейцин des-Leu: делетований Leu Lys або K: лізин des-Lys: делетований Lys Met або M: метіонін Nle: норлейцин Pen: пеніциламін Phe або F: фенілаланін Pro або Р: пролін 6 UA 103104 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Ser або S: серин Thr або Т: треонін Trp або W: триптофан Tyr або Y: тирозин Val або V: валін Всі скорочення (наприклад, Ala) амінокислот у даному описі означають структуру -NRCR’(R")-CO-, в якій кожний з R" і R" незалежно являє собою водень або бічний ланцюг амінокислоти (наприклад, R’=Н і R”=CH3 для аланіну) і в якій R=Н або CH3, крім проліну, тобто Пептид за даним винаходом також позначають у даному документі в іншому форматі, 59 наприклад, (Asn )hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO: 1), з амінокислотами, заміщеними у порівнянні з природною послідовністю, розміщеними між дужками (тобто Asn замість Met у положенні 59 IGF-1 дикого типу). Інтервал, що знаходиться у дужках, стосується тих амінокислот, які знаходяться в аналогу. Наприклад, "IGF-1(4-68)-OH" (SEQ ID NO: 48) вказує, що аналог містить амінокислоти від 4 до 68, які відповідають пептидній послідовності IGF-1 дикого типу. "NH2" в "IGF-1(1-70)-NH2" (SEQ ID NO: 49) вказує на те, що С-кінець пептиду амідований. "IGF-1(1-70)” або "IGF-1(1-70)-OH" вказує на те, що С-кінець являє собою вільну кислоту (SEQ ID NO: 50). Деякі інші скорочення, що застосовуються у даному документі, визначені наступним чином: Act: ацетонітрил Boc: трет-бутилоксикарбоніл BSA: бичачий сироватковий альбумін DCM: дихлорметан DIPEA: діізопропілетиламін DMEM: модифіковане за способом Дульбекко середовище Ігла ДМФА: диметилформамід DTT: дитіотреїтол ESI: іонізація електророзпиленням FCS: ембріональна теляча сироватка Fmoc: 9-флуоренілметилоксикарбоніл HBTU: гексафторфосфат 2-(1H-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію HOBt: N-гідроксибензотриазол ВЕРХ: високоефективна рідинна хроматографія LC-MS: рідинна хроматографія-мас-спектрометрія MPAA: 4-меркаптофенілоцтова кислота NMP: N-метилпіролідинон OtBu: О-трет-бутиловий складний ефір Pbf: 2,2,4,6,7-пентаметилдигідробензофуран-5-сульфоніл QC: контроль якості tBu: трет-бутил TCA: трихлороцтова кислота TCEP: трис-2-карбоксіетилфосфін TIS: триізопропілсилан ТФОК: трифтороцтова кислота Tris: 2-аміно-2-(гідроксиметил)-1,3-пропандіол Trt: тритил УФ-спектроскопія: ультрафіолетова спектроскопія. "Алкіл" стосується вуглеводневої групи, що містить один або декілька атомів вуглецю, де множинні атоми вуглецю, якщо вони присутні, з'єднані одинарними зв'язками. Приклади цієї групи включають, але не обмежуються ними, метил, етил, пропіл і бутил. Алкільна вуглеводнева група може бути лінійною або може містити одну або декілька гілок або циклічних груп, приклади яких включають, але не обмежуються ними, ізопропіл і трет-бутил. "Заміщений алкіл" стосується алкілу, в якому один або декілька водневих атомів вуглеводневої групи замінені одним або декількома замісниками, вибраними з групи, що складається з галогену, OH, CN, SH, NH 2, NHCH3, NO2, (C1-2)-алкілу, заміщеного 1-6 галогенами, CF3, OCH3, OCF3 і (CH2)0-4-COOH. В інших варіантах здійснення присутні 1, 2, 3 або 4 замісники. 7 UA 103104 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Арил" стосується необов'язково заміщеної ароматичної групи, щонайменше з одним кільцем, що має кон'юговану систему пі-електронів, яка містить до трьох кон'югованих або конденсованих кільцевих систем. Арил включає карбоциклічний арил, гетероциклічний арил і біарильні групи. Переважно, арил являє собою 5- або 6-членне кільце. Переважні атоми для гетероциклічного арилу являють собою один або декілька атомів сірки, кисню і/або азоту. Приклади арилу включають феніл, 1-нафтил, 2-нафтил, індол, хінолін, 2-імідазол і 9-антрацен. Арильні замісники вибирають з групи, що складається з -C1-20-алкілу, -C1-20-алкокси, галогену, OH, -CN, -SH, -NH2, -NO2, -C1-20-алкілу, заміщеного галогенами, -CF3, -OCF3 і -(CH2)0-20-COOH. В інших варіантах здійснення арил містить 0, 1, 2, 3 або 4 замісники. "Алкіларил" стосується "алкілу", приєднаного до "арилу". Процедури синтезу Представлені як приклад аналоги IGF-1 за даним винаходом одержували за допомогою першої стадії синтезу пептидних фрагментів, другої стадії зшивання (лігування) і третьої стадії фолдингу. Наведені далі процедури синтезу ілюструють як фахівець-хімік може забезпечити одержання будь-якого з представлених як приклад аналогів IGF-1 за даним винаходом. 56 59 A) Синтез пептидного фрагмента (Gln , Asn )hIGF-1(48-70)-OH, тобто Cys-Phe-Arg-Ser-CysAsp-Leu-Arg-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-Ala-Lys-Ser-Ala-OH_(SEQ ID NO: 51) Твердофазовий пептидний синтез, що базується на Fmoc, застосовували для збирання вказаного у заголовку пептидного фрагмента з використанням допоміжної мікрохвильової обробки на пептидному синтезаторі Liberty (CEM; Matthews, NC, USA). Перший фрагмент з 14 залишків, наприклад, залишків 57-70 hIGF-1, або пептид з С-кінцевих кислот синтезували у масштабі 1,0 ммоль з використанням Fmoc-Ala-смоли Ванга (0,72 мг-екв./г). Одержаний у результаті пептидний фрагмент потім розділяли на чотири партії по 0,25 ммоль для подовження і розділення. Зразок смоли масою 1,36 г вміщували у конічну пробірку на 50 мл разом з 15 мл розчину 1:1 ДМФА і DCM, яку завантажували у задане положення у синтезатор. Потім смолу переносили у реакційну посудину за допомогою автоматичного процесу синтезатора. Використовували стандартний протокол Liberty для масштабу 1,0 ммоль. Протокол включав видалення N-кінцевої захисної групи Fmoc шляхом обробки 20 мл 20 % піперидину, що містить 0,1 M HOBt у ДМФА. Вихідна стадія зняття захисту за допомогою мікрохвильової енергії (45 ват, максимальна температура 75 °C) і барботування азотом (3 секунди увімкнено, 7 секунд вимкнено) продовжувалася протягом 30 секунд. З реакційної посудини видаляли розчин і смолу ретельно промивали ДМФА декілька разів. Потім додавали наступну амінокислоту (цикл 1), яку потрібно було приєднати до зростаючого пептиду (Fmoc-Ser(tBu)-OH), одержану у вигляді маточного розчину 0,2 M у ДМФА (15 мл, 3 еквіваленти). Додавали 6,0 мл 0,45 M (3 еквіваленти) HBTU у ДМФА, після чого вносили 3,0 мл 2 M (6 еквівалентів) DIPEA в NMP. Стадію приєднання проводили з використанням мікрохвильової енергії (20 ват, максимальна температура 75 °C) з барботуванням азотом у тому ж співвідношенні, як на стадії зняття захисту, протягом періоду 5 хвилин. Потім з реакційної посудини видаляли розчин у злив і повторювали стадію приєднання. Протокол приєднання для Fmoc-Cys(Trt)-OH являв собою злегка модифіковану версію стандартного протоколу. Для залишків Cys протягом перших 2 хвилин не використовували мікрохвильову енергію. Потім йшов 4-хвилинний відрізок використання мікрохвильової енергії (20 ват, максимальна температура 50 °C). Всі амінокислоти вводили однаковим шляхом, використовуючи стратегію подвійного приєднання протягом всієї цілої послідовності. Цикли синтезу для вказаного у заголовку пептидного фрагмента після першого Ser були наступними: цикл 2, Fmoc-Lys(Boc)OH; цикл 3, Fmoc-Ala-OH; цикл 4, Fmoc-Pro-OH; цикл 5, Fmoc-Lys(Boc)-OH; цикл 6, Fmoc-LeuOH; цикл 7, Fmoc-Pro-OH; цикл 8, Fmoc-Ala-OH; цикл 9, Fmoc-Cys(Trt)-OH; цикл 10, FmocTyr(tBu)-OH; цикл 11, Fmoc-Asn(Trt)-OH; цикл 12, Fmoc-Glu(OtBu)-OH; і цикл 13, Fmoc-Leu-OH. Як тільки вихідний пептидний фрагмент був завершений, смолу переносили зворотно у конічну пробірку на 50 мл з використанням ДМФА як розчинника. Смолу вручну рівномірно розділяли на чотири зразки, які вміщували у чотири конічні пробірки на 50 мл, які потім встановлювали зворотно у синтезатор. Частину вказаного у заголовку пептиду, що залишилася, синтезували у масштабі 0,25 ммоль. Використовуваний протокол був тим самим, як той, який використовували для синтезу у більшому масштабі, однак використовували менші кількості реагентів. Видалення N-кінцевої захисної групи Fmoc складалося з обробки розчином, що містить 10 мл 20 % піперидину і 0,1 M HOBt у ДМФА. Вихідна стадія зняття захисту за допомогою мікрохвильової енергії (45 ват, максимальна температура 75 °C) і барботування азотом (3 секунди увімкнено, 7 секунд вимкнено) продовжувалася протягом 30 секунд. Потім з реакційної посудини видаляли розчин і смолу ретельно промивали декілька разів ДМФА. Потім вводили наступну амінокислоту (цикл 14), одержану у вигляді 0,2 M маточного розчину у ДМФА 8 UA 103104 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (5,0 мл, 4 еквіваленти) у зростаючий пептид (Fmoc-Gln(tBu)-OH). Потім додавали 2,0 мл 0,45 M розчину (4 еквіваленти) HBTU у ДМФА, після чого вносили 1,0 мл 2 M розчину (8 еквівалентів) DIPEA в NMP. Протоколи приєднання для Fmoc-Cys(Trt)-OH і Fmoc-Arg(Pbf)-OH являли собою злегка модифіковані версії стандартного протоколу. Для приєднання залишків Cys мікрохвильову енергію спочатку вимикали на перші 2 хвилини, потім вмикали на 4 хвилини (20 ват, максимальна температура 50 °C). Для приєднання залишків Arg мікрохвильову енергію не використовували при першому приєднанні, однак була потрібна друга стадія стандартного приєднання. У циклах 14, 16 і 21 використовували процедуру кепінгу, яка йшла безпосередньо за стадією приєднання, що включає додання 7 мл 0,5 M оцтового ангідриду, що містить 0,015 M HOBt і 2 мл 2 M DIPEA, причому обидві сполуки були розчинені в NMP, використовуючи при цьому багатостадійний протокол мікрохвильової обробки (50 ват протягом 30 секунд з максимальною температурою 65 °C, потім без обробки протягом 30 секунд, 50 ват протягом 30 секунд з максимальною температурою 65 °C, потім без обробки протягом 30 секунд). Цикли синтезу для вказаного у заголовку пептидного фрагмента після Gln були наступними: цикл 15, Fmoc-Arg(Pbf)-OH; цикл 16, Leu-OH; цикл 17, Fmoc-Asp(OtBu)-OH; цикл 18, Fmoc-Cys(Trt)-OH; цикл 19, Fmoc-Ser(tBu)-OH; цикл 20, Fmoc-Arg(Pbf)-OH; цикл 21, Fmoc-Phe-OH; і цикл 22, FmocCys(Trt)-OH. Після завершення пептидного кістяка видаляли N-кінцеву захисну групу Fmoc, а смолу знову промивали ДМФА. Потім смолу переносили зворотно у конічну пробірку на 50 мл з використанням ДМФА як розчинника для перенесення. Смолу переносили у реакційну посудину з фільтром з пористого скла. Видаляли ДМФА і смолу інтенсивно промивали DCM. Пептидний фрагмент відщеплювали і звільняли від захисту обробкою наступним реагентом: 5 % TIS: 5 % вода: 90 % ТФОК. Реакційну суміш залишали інкубуватися протягом 3 годин при кімнатній температурі і постійному перемішуванні. Потім розчин фільтрували у конічну пробірку на 50 мл. Рівень ТФОК знижували упарюванням у потоці газоподібного азоту. Пептидний фрагмент осаджували доданням 40 мл холодного простого етилового ефіру з подальшим центрифугуванням при 3000 об./хв. протягом 30 хвилин при 4 °C у центрифузі з охолоджуванням (Sorvall Legend RT; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA). Одержаний у результаті осад розчиняли в 0,1 % ТФОК у воді перед очищенням шляхом препаративної ВЕРХ, укомплектованої колонкою з оберненою фазою C18 (Luna, 10 мкм, колонка 250×21,2 мм), з використанням градієнта 0-60 % ацетонітрилу (0,1 % ТФОК) протягом 50 хвилин при швидкості потоку 10 мл/хв. Очищений пептидний фрагмент аналізували шляхом ВЕРХ (Luna C18, 3 мкм, колонка 4,6×100 мм) з градієнтом 5-80 % ацетонітрилу (0,08 % ТФОК) протягом 30 хвилин зі швидкістю потоку 1 мл/хв. і шляхом мас-спектрометрії (LCQ Advantage; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA). Пептидний фрагмент потім ліофілізували і зберігали при 50 °C для подальшого застосування. B) Синтез пептидного фрагмента hIGF-1(1-47)-тіоефір, тобто Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys-GlyAla-Glu-Leu-Val-Asp-Ala-Leu-Gln-Phe-Val-Cys-Gly-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Pro-Thr-GlyTyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr-Gly-Ile-Val-Asp-Glu-Cys-тіоефірпропіоніл-Leu-NH2 (SEQ ID NO: 52) N-кінцевий пептидний фрагмент, наприклад, залишки 1-47 hIGF-1, об'єднували з використанням твердофазового пептидного синтезу, що базується на Вос-хімії. Для синтезу у масштабі 0,5 ммоль використовували пептидний синтезатор ABI 433A (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA), модифікований для запуску стандартного протоколу FastBoc. Реакційну посудину, що містить 0,645 мг 0,77 мг-екв./г смоли Tampal, вміщували на синтезатор. Для набухання смоли вводили ДМФА. Протокол ABI FastBoc 0,5 використовували для одержання фрагмента. Кожний цикл складався з деблокування N-кінцевої захисної групи Boc за допомогою чистої ТФОК з подальшим рясним промиванням ДМФА. Заздалегідь упаковані картриджі на 2,0 ммоль (4 еквіваленти) кожної амінокислоти потім розчиняли в 0,40 M HBTU і ДМФА. Після повного розчинення кожної амінокислоти, розчин автоматично переміщували в ємність для активації. Розчин DIPEA (чистого) вводили у посудину для активації і піддавали впливу смоли протягом тривалого періоду. Реакційну посудину спорожнювали і смолу промивали ДМФА. Для картриджів Arg/Asn був потрібен тривалий час активації, щоб гарантувати розчинність. Крім того, будь-яку амінокислоту, додану безпосередньо після приєднання залишку Gln, промивали DCM до і після виконання протоколу деблокування. Час приєднання становив 30 хвилин. Наступні амінокислоти використовували для вказаного у заголовку пептидного фрагмента: BocArg(Tos)-OH, Boc-Asp(cHex)-OH, Boc-Glu(cHex)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Cys(4Me-Bzl)-OH, Boc-Lys(ClZ)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Ser(OBzl)-OH, Boc-Thr(OBzl)-OH і Boc-Tyr(BrZ)-OH. 9 UA 103104 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Після останнього циклу приєднання смолу промивали DCM і сушили. З пептидного фрагмента знімали захист і відщеплювали його від смоли з використанням обробки 10 мл фтороводню і анізолу. Реакції давали проходити протягом 70 хвилин, причому до цього моменту фтороводень вимивали струменем азоту. Залишок промивали простим ефіром і потім пептид розчиняли у 10-15 мл ТФОК. Пептидний фрагмент осаджували шляхом фільтрування ТФОК у 40 мл холодного простого етилового ефіру з подальшим центрифугуванням при 3000 об./хв. протягом 30 хвилин при 4 °C у центрифузі з охолоджуванням (Sorvall Legend RT; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA). Одержаний у результаті осад розчиняли в 0,1 % ТФОК у воді і очищали шляхом препаративної ВЕРХ, укомплектованої колонкою з оберненою фазою C18 (Luna, 10 мкм, колонка 250×21,2 мм), з використанням градієнта 20-40 % ацетонітрилу (0,1 % ТФОК) протягом 120 хвилин зі швидкістю потоку 10 мл/хв. Очищений пептидний фрагмент аналізували шляхом ВЕРХ (Luna C18, 3 мкм, колонка 4,6×100 мм) з градієнтом 5-80 % ацетонітрилу (0,08 % ТФОК) протягом 30 хвилин зі швидкістю потоку 1 мл/хв. і шляхом масспектрометрії (LCQ Advantage; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA). Потім пептидний фрагмент ліофілізували і зберігали при -50 °C для подальшого використання. C) Загальна процедура зшивання Повнорозмірні аналоги hIGF-1 конструювали способом хімічного зшивання, яке відбувається у природі між N-кінцевим фрагментом зі складним тіоефіром, наприклад, hIGF-1(1-47)-S56 59 (CH2)2C(0)-Leu-NH2 (SEQ ID NO: 52), і С-кінцевим фрагментом, наприклад, (Gln , Asn )hIGF1(48-70)-OH (SEQ ID NO: 51), який містить на своєму N-кінці залишок цистеїну. Для початку способу одержання вказаного у заголовку пептиду 5,5 мг С-кінцевого фрагмента hIGF-1 розчиняли в 0,5 мл буфера для зшивання (200 мМ фосфат натрію, pH 8,5, 6M гідрохлорид гуанідину) у пробірці Епендорфа на 1,5 мл. До даного розчину додавали 100 мкл розчину TCEP (40 мг/мл) і суміш струшували. Суміш переносили у другу пробірку Епендорфа, що містить 6,5 мг N-кінцевого фрагмента hIGF-1 зі складним тіоефіром. Реагенти ретельно змішували. Невеликий зразок (5 мкл) видаляли і аналізували шляхом LC-MS (LCQ Deca XP; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA). До реакційної суміші додавали 100 мкл розчину MPAA (20 мг/мл) з подальшим перемішуванням. Зразки (5 мкл) періодично діставали, щоб стежити за процесом реакції з використанням LC-MS. Приблизно через 3,5 години, коли реакція була близька до завершення, суміш гасили і розбавляли доданням 9,5 мл 0,1 % ТФОК у воді. Продукт зшивання очищали шляхом напівпрепаративної ВЕРХ (Vydac 218TP101510, C18, 10-15 мкм, 10×250 мм) у градієнті 5-80 % ацетонітрилу (0,1 % ТФОК) протягом 40 хвилин зі швидкістю потоку 5 мл/хв. Пік продукту ліофілізували і зберігали при -50 °C. Масу продукту зшивання, що не був підданий фолдингу, визначали шляхом фізичного вимірювання. D) Загальна процедура фолдингу (окиснювально-відновлювальна пара глутатіону) для 56 59 прикладу 14, тобто (Gln , Asn )hIGF-1 (1-70)-ОH (SEQ ID NO: 14) Білок, одержаний у процесі зшивання на стадії С), як описано вище, розчиняли у буфері для зшивання (200 мМ фосфат натрію, pH 8,5, 6M гідрохлорид гуанідину) до концентрації 1 мг/мл. Потім додавали буфер для фолдингу (100 мМ Tris, pH 8,5, 1 мМ окиснений глутатіон, 10 мМ відновлений глутатіон) до досягнення кінцевої концентрації білка 0,25 мг/мл. Забезпечували здійснення процесу фолдингу протягом 3 годин. Після цього реакцію гасили шляхом додання по краплях ТФОК до досягнення у реакційній суміші pH 3. Потім продукт очищали шляхом напівпрепаративної ВЕРХ (Vydac 218TP101510, C18, 10-15 мкм, колонка 10×250 мм) у градієнті 5-60 % ацетонітрилу (0,1 % ТФОК) протягом 40 хвилин зі швидкістю потоку 5 мл/хв. Продукт ліофілізували. Вміст білка визначали шляхом повторного розчинення продукту в 0,1 % ТФОК у воді, вимірюючи потім оптичну густину при 280 нм (спектрофотометр NanoDrop ND1000). Потім білок аналізували для QC (ВЕРХ і MS). 1 59 E) Процедура окиснення для одержання (гліоксиліл-Gly , Asn )hIGF-1(1-70)-OH (SEO ID 1 59 NO:53) з прикладу 7, тобто (Ser-Gly , Asn )hIGF-1(1-70)OH (SEQ ID NO: 7) Масу підданого фолдингу аналога hIGF-1 визначали за оптичною густиною при 280 нм в 0,1 % ТФОК у воді (спектрофотометр NanoDrop ND1000). Білок, одержаний у процесі фолдингу на стадії D, як описано вище, повторно розчиняли в 50 мМ імідазольному буфері (pH 7,0) до 4 кінцевої концентрації 2 мг/мл (2,66×10- М). Додавали періодат натрію (NaIO4) (4 еквіваленти), розчинений в імідазольному буфері, і одержаний у результаті розчин обережно перемішували. Реакції давали відбуватися при кімнатній температурі без подальшого перемішування. Через 5 хвилин реакцію гасили доданням 10 еквівалентів етиленгліколю. Суміші давали відстоятися протягом 15 хвилин при кімнатній температурі. Суміш розбавляли 0,1 % ТФОК у воді до кінцевого об'єму 10 мл. Потім продукт очищали шляхом напівпрепаративної ВЕРХ (Vydac 218TP101510, C18, 10-15 мкм, колонка 10×250 мм) у градієнті 5-60 % ацетонітрилу (0,1 % ТФОК) 10 UA 103104 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 протягом 40 хвилин зі швидкістю потоку 5 мл/хв. Потім продукт ліофілізували і зберігали при 50 °C до необхідного застосування. 47 59 F) Процедура синтезу для прикладу 27, тобто (-Me-Cys , Leu )hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO: 19) Вказаний у заголовку білок об'єднували шляхом нативного хімічного зшивання з використанням hIGF(1-46)-тіопропіоніл-Leu-NH2 (SEQ ID NO: 54) і С-кінцевого фрагмента, тобто 47 59 (-Me-Cys , Leu )hIGF-1(47-70) (SEQ ID NO: 55). Складний тіоефір білка (7,4 мг, 1,45 мкмоль) і С-кінцевий фрагмент (3,8 мг, 1,38 мкмоль) розчиняли у буфері для зшивання (6 M гідрохлорид гуанідину у 200 мМ фосфаті натрію, pH 8,5, 400 мкл) і TCEP (80 мкл, 40 мг/мл, pH 7). Додавали каталізатор MPAA (80 мкл, 20 мг/мл, pH 7). Прогресування реакції відстежували шляхом LC-MS на LCQ Deca XP (Thermo Finnigan) з колонкою Luna C18(2) (5 мкм, 4,6×100 мм) у градієнті 580 % ацетонітрилу (0,1 % ТФОК) протягом 30 хвилин. Реакцію гасили розбавленням 1:10 dH 2O з 0,1 % ТФОК (об./об.). Неочищену суміш центрифугували і пропускали через скляний фільтр з порами 1,0 мкм для видалення якого-небудь осаду MPAA. Повнорозмірний білок очищали з використанням лінійного градієнта В 5-60 % протягом 40 хвилин зі швидкістю потоку 5 мл/хв. на Vydac C18 (10 мкм, 10×250 мм). Білок визначали кількісно шляхом УФ-спектроскопії (спектрофотометр NanoDrop ND1000) і ліофілізували для подальшого застосування. Білок, що знаходиться на зберіганні (1,8 мг, 235 нмоль), розчиняли у розчині 200 мМ H 2PО4-, 6 M гуанідинію-HCl, що має pH 8,5, до концентрації 1,0 мг/мл. Буфер для фолдингу (100 мМ Tris, 10 мМ глутатіон, 1 мМ окиснений глутатіон при pH 8,5) додавали до розчину до досягнення кінцевої концентрації білка 250 мкг/мл. Суміш залишали інкубуватися при кімнатній температурі, здійснюючи при цьому моніторинг методом ВЕРХ. Як тільки досягалася рівновага (що візуалізувалося у вигляді стабільного профілю ВЕРХ), реакцію гасили шляхом перемішування або з оцтовою кислотою, або з ТФОК для доведення pH розчину до 3. Розчин очищали з використанням спочатку скляного фільтра з порами 1,0 мкм і потім напівпрепаративної колонки. Підданий фолдингу білок очищали з використанням лінійного градієнта В 5-60 % протягом 40 хвилин зі швидкістю потоку 5 мл/хв. Білок визначали кількісно шляхом УФ-спектроскопії (спектрофотометр NanoDrop ND1000) і ліофілізували. Одержували приблизно 92 мкг очищеного продукту з представленням виходу 5 %. Масу білка підтверджували на Finnigan LCQ Advantage MAX MS. 48 59 G) Процедура синтезу для прикладу 36, тобто (N-Me-Cys , Nle )hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO: 28) Вказаний у заголовку білок об'єднували шляхом нативного хімічного зшивання з використанням hIGF-1(1-46)-тіопропіоніл-Leu-NH2 (SEQ ID NO: 52) і С-кінцевого фрагмента, 48 59 тобто (N-Me-Cys , Nle )hIGF-1(48-70) (SEQ ID NO: 56). Складний тіоефір білка (4,3 мг, 824 нмоль) і С-кінцевий фрагмент (2,1 мг, 790 нмоль) розчиняли у буфері для зшивання (400 мкл, 6 M гідрохлорид гуанідину у 200 мМ фосфаті натрію, pH 8,5) і TCEP (80 мкл, 40 мг/мл, pH 7). Додавали каталізатор MPAA (80 мкл, 20 мг/мл, pH 7). Прогресування реакції відстежували, використовуючи LC-MS на LCQ Deca XP (Thermo Finnigan) з колонкою Luna C18(2) (5 мкм, 4,6×100 мм) у градієнті 5-80 % ацетонітрилу (0,1 % ТФОК), протягом 30 хвилин. Реакцію гасили розбавленням 1:10 dH2O з 0,1 % ТФОК (об./об.). Неочищену суміш центрифугували і пропускали через скляний фільтр з порами 1,0 мкм для видалення якого-небудь осаду MPAA. Повнорозмірний білок очищали з використанням лінійного градієнта В 5-60 % протягом 40 хвилин зі швидкістю потоку 5 мл/хв. на Vydac C18 (10 мкм, 10×250 мм). Білок визначали кількісно шляхом УФ-спектроскопії (спектрофотометр NanoDrop ND1000) і ліофілізували для подальшого застосування. Білок, що знаходиться на зберіганні, розчиняли у розчині 200 мМ H 2PО4 , 6 M гуанідинію-HCl (pH 8,5) до досягнення концентрації 1,0 мг/мл. Буфер для фолдингу (100 мМ Tris, 10 мМ глутатіон, 1 мМ окиснений глутатіон, pH 8,5) додавали до розчину до досягнення кінцевої концентрації білка 250 мкг/мл. Суміш залишали інкубуватися при кімнатній температурі, здійснюючи при цьому моніторинг методом ВЕРХ. Як тільки досягалася рівновага (що візуалізувалося у вигляді стабільного профілю ВЕРХ), реакцію гасили або оцтовою кислотою, або ТФОК до pH 3. Розчин очищали з використанням спочатку скляного фільтра з порами 1,0 мкм і потім напівпрепаративної колонки. Підданий фолдингу білок очищали з використанням лінійного градієнта В 5-60 % протягом 40 хвилин зі швидкістю потоку 5 мл/хв. Білок визначали кількісно шляхом УФ-спектроскопії (спектрофотометр NanoDrop ND1000) і ліофілізували. Одержували приблизно 0,415 мг очищеного продукту з наданням виходу 10,6 %. Масу білка підтверджували на Finnigan LCQ Advantage MAX MS. 11 UA 103104 C2 Фахівцем у даній галузі можуть бути одержані інші пептиди за винаходом з використанням процедур синтезу, аналогічних тим, які розкриті у вказаних вище прикладах. Фізичні дані для сполук, приклади яких наведені у даному документі, подані у таблиці 1. Таблиця 1 Номер прикладу 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 Мол. маса (ESI-MS) 7631,6 6839,5 7347,9 7632,1 6839,3 7602,5 7718,7 7454,1 7639,7 7586,0 7675,3 7616,9 7563,6 7605,1 7634,1 7633,2 7632,9 7631,6 7631,9 7631,8 7631,7 7631,8 7713,9 7686,7 7596,7 7645,5 7644,9 7760,4 7746,5 7758,4 7718,5 7645,5 7645,4 7643,9 7628,1 7644,8 7644,6 7645,3 7628,4 7658,8 7658,8 7641,7 7672,4 7641,8 7701,0 7658,7 7640,9 7632,5 7704,0 7604,7 Мол. маса (очікувана) 7631,6 6838,6 7348,3 7631,6 6838,6 7603,6 7718,7 7452,3 7638,6 7585,5 7674,6 7615,6 7562,5 7603,6 7631,6 7631,6 7631,6 7631,6 7631,6 7631,6 7631,6 7631,6 7714,7 7686,7 7596,6 7644,7 7644,7 7759,8 7745,8 7758,8 7717,7 7644,7 7644,7 7644,7 7628,7 7644,7 7644,7 7644,7 7628,7 7658,7 7658,7 7642,7 7671,8 7641,7 7699,8 7657,7 7642,7 7632,6 7703,7 7604,6 5 12 % очищення (ВЕРХ) 99,9 95,2 93,0 97,7 95,9 99,9 99,9 99,9 99,9 99,9 99,9 99,9 99,9 98,5 96,8 97,2 95,1 96,7 97,9 98,5 97,6 98,1 99,9 99,9 99,9 99,9 99,9 100 100 100 100 100 95,5 100 94,0 99,9 99,9 99,9 99,9 99,9 99,9 99,9 99,9 99,9 97,7 96,1 99,9 99,9 99,9 99,9 UA 103104 C2 Продовження таблиці 1 Номер прикладу 51 52 53 54 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Мол. маса (ESI-MS) 7680,5 7646,2 7644,9 7674,7 Мол. маса (очікувана) 7680,7 7646,6 7645,6 7673,7 % очищення (ВЕРХ) 100 100 100 99,9 Функціональні аналізи A) Аналіз зв'язування з рецептором IGF-1 in vitro Одержували мембрани для досліджень зв'язування радіоактивного ліганду шляхом гомогенізації клітин MCF-7 людини, що експресують природний рецептор IGF-1 у 20 мл льодяного 50 мМ Tris-HCl за допомогою Brinkman Polytron (Westbury, NY, USA) (режим 6, 15 сек.). Гомогенати промивали двічі при центрифугуванні (39000 g/10 хвилин) і кінцеві осади ресуспендували у 50 мМ Tris-HCl, що містить 2,5 мМ MgCl2 і 0,1 % BSA. 125 Для аналізу аліквоти інкубували з 0,05 нМ [ I]IGF-1. Іноді включали немічені конкурентні пептиди, що тестуються. Кінцевий об'єм для аналізу становив 0,25 мл. Після періоду інкубації, 125 що дорівнює 120 хвилин, (20 °C) зв'язаний [ I]IGF-1 (~2000 Кі/ммоль, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA) відділяли від вільних радіоактивних частинок шляхом центрифугування при 3000 об./хв. протягом 10 хвилин. Супернатант декантували і радіоактивні частинки, захоплені осадом, зчитували шляхом гамма-спектрометрії (Wallac LKB, Gaithersburg, MD, USA). 125 Специфічне зв'язування визначали як загальний зв'язаний [ I]IGF-1 мінус той, що зв'язувався у присутності 100 нМ IGF-1. Дані зі зв'язування рецептора IGF-1 in vitro (тобто значення EC50) для сполук, наведених як приклади у даному документі, подані у таблиці 2. B) Аналіз біологічної активності IGF-1 in vitro Мишачі клітини 3T3/R (одержані від Dr. Е. Rozengurt з UCLA в Los Angeles, CA, USA) культивували у 24-ямковому планшеті (DMEM+10 % FCS) та інкубували протягом 2 діб у культурі. Для аналізу середовище видаляли і промивали один раз безсироватковим DMEM. Потім 3 інкубували без сироватки протягом 24 годин. Після сироваткового голодування додавали [ H]тимідин і пептиди IGF-1. Потім клітини інкубували протягом 24 годин при 37 °C. У кінці інкубації середовище аспірували. Потім клітини відмивали льодяним 0,9 % розчином NaCl. Потім додавали 5 % льодяний розчин TCA для інкубації протягом 30 хвилин при 4 °C. TCA аспірували і ямки інкубували з 95 % етанолом протягом 4 годин. Потім середовище переносили у флакон для рідинної сцинтиляції з метою оцінки радіоактивності. Дані з біологічної активності IGF-1 in vitro (тобто значення EC50) для сполук, приклади яких наведені у даному документі, також подані у таблиці 2. C) Скринінг in vitro пептидів IGF-1 на перехресну реактивність з інсуліновим рецептором на клітинах U2ОS Клітини U2ОS (каталожний № 93-0466C3, DiscoveRX Corporation, Fremont, CA, USA) 5 висівали у кількості 6×10 клітин/мл у 96-ямковий покритий полі-D-лізином планшет за 16 годин до аналізу у безсироватковому середовищі для аналізу. Інсулін дикого типу (каталожний № 10908, Sigma, St. Louis, MO, USA), IGF-1 дикого типу (Increlex®, Tercica, Inc., Brisbane, CA, USA) або пептид IGF-1, що тестується, описаний у даній заявці, додавали в інтервалі доз від 10 мкМ (мікромолярна) до 0,15 нм (наномолярна) та інкубували протягом 3 годин при 37 °C з 5 % CО2. Реагент PathHunter™ (каталожний № 93-001, DiscoveRX) одержували за інструкціями виробника і додавали у кожну ямку. Планшети інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Люмінесценцію зчитували на спектрофотометрі для багатомаркерного аналізу планшетів Envision 2104 (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA). Аналізували активність кожного пептиду, що тестується, і повідомляли у вигляді максимального/мінімального (max/min) значень. Дані in vitro з перехресної реактивності з інсуліновим рецептором (тобто значення max/min) для сполук, приклади яких наведені у даному документі, також подані у таблиці 2. Виявлено, що багато зі сполук, приклади яких наведені у даному документі, є значно більш активними, ніж IGF-1 дикого типу, який характеризується значенням IC50 4,59 нМ, значенням EC50 3,75 нМ і значенням max/min 2,1. 13 UA 103104 C2 Таблиця 2 Номер прикладу 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 IC50 (нМ) 0,57 0,50 2,41 0,88 1,14 0,66 4,11 19,02 3,62 2,90 1,85 1,47 1,25 5,94 0,81 2,61 2,77 0,72 2,77 1,60 1,57 0,91 2,69 2,89 2,40 3,60 0,58 3,25 13,25 1,95 2,03 2,66 2,25 N/А 3,64 N/А 23,25 23,13 28,10 N/А N/А 1,49 1,27 6,31 9,27 N/А 1,46 18,49 4,54 30,63 2,18 1,29 N/А 3,49 EC50 (нМ) 0,51 2,31 7,17 1,90 1,89 0,98 7,41 32,00 8,31 1,09 3,34 5,11 7,02 3,56 3,70 7,59 4,59 3,33 7,69 3,13 3,95 4,22 3,86 2,60 6,72 1,28 1,13 2,12 4,86 1,87 1,18 5,45 2,30 N/А 3,15 N/А 3,42 4,21 0,93 N/А N/А 2,01 5,08 3,69 6,24 N/А 1,31 1,81 2,69 2,63 1,29 2,44 N/А 2,34 14 max/min 2,1 N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А N/А UA 103104 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Введення Аналоги IGF-1 за даним винаходом можуть бути представлені у формі фармацевтично прийнятних солей. Приклади таких солей включають, але не обмежуються ними, солі, утворені з органічними кислотами (наприклад, оцтовою, молочною, малеїновою, лимонною, яблучною, аскорбіновою, бурштиновою, бензойною, метансульфоновою, толуолсульфоновою або памовою кислотою), неорганічними кислотами (наприклад, соляною кислотою, сірчаною кислотою або фосфорною кислотою) і полімерними кислотами (наприклад, дубильною кислотою, карбоксиметилцелюлозою, полімолочною, полігліколевою кислотою або співполімерами полімолочної-гліколевої кислот). Звичайний спосіб одержання солі пептиду за даним винаходом добре відомий у даній галузі і може бути здійснений стандартними способами обміну солі. Наприклад, сіль ТФОК пептиду за даним винаходом (сіль ТФОК утворюється у результаті очищення пептиду з використанням препаративної ВЕРХ, в якій елюювання відбувається буферними розчинами, що містять ТФОК) перетворювали в іншу сіль, таку як ацетатна сіль, шляхом розчинення пептиду у невеликій кількості 0,25 н. водного розчину оцтової кислоти. Одержаний у результаті розчин наносили на колонку для напівпрепаративної ВЕРХ (Zorbax, 300 SB, С-8). Елюювання з колонки проводять (1) 0,1 н. водним розчином ацетату амонію протягом 0,5 години, (2) 0,25 н. водним розчином оцтової кислоти протягом 0,5 години і (3) лінійним градієнтом (від 20 % до 100 % розчину В протягом 30 хв.) при швидкості потоку 4 мл/хв. (розчин А являє собою 0,25 н. водний розчин оцтової кислоти і розчин В являє собою 0,25 н. оцтову кислоту у суміші ацетонітрил/вода у співвідношенні 80:20). Фракції, що містять пептид, збирають і ліофілізують досуха. Дозування активного інгредієнта у композиціях за даним винаходом може варіювати; однак необхідно, щоб кількість активного інгредієнта була такою, щоб була одержана придатна лікарська форма. Вибране дозування залежить від необхідного терапевтичного ефекту, від шляху введення і від тривалості лікування. Дозування легко визначається професійним, компетентним лікарем-терапевтом. Сполуки за даним винаходом можуть бути введені пероральним, парентеральним (наприклад, шляхом внутрішньом'язової, інтраперитонеальної, внутрішньовенної або підшкірної ін'єкції, або за допомогою імплантату), назальним, вагінальним, ректальним, сублінгвальним або місцевим шляхом введення, і можуть бути складені з фармацевтично прийнятними носіями для забезпечення лікарських форм, придатних для кожного шляху введення. Тверді лікарські форми для перорального введення включають капсули, таблетки, пілюлі, порошки і гранули. У таких твердих лікарських формах активну сполуку змішують щонайменше з одним інертним фармацевтично прийнятним носієм, таким як сахароза, лактоза або крохмаль. Такі лікарські форми можуть також включати, як звичайна практика, додаткові субстанції, які відрізняються від таких інертних розріджувачів, наприклад, мастила, такі як стеарат магнію. У випадку капсул, таблеток і пілюль, лікарські форми можуть також включати буферні засоби. Таблетки і пілюлі можуть бути додатково одержані з ентеросолюбільними покриттями. Рідкі лікарські форми для перорального введення включають, без обмеження, фармацевтично прийнятні емульсії, розчини, суспензії, сиропи, еліксири і т. п., що містять інертні розріджувачі, які звичайно використовуються у даній галузі, такі як вода. Крім таких інертних розріджувачів, композиції можуть також включати допоміжні засоби, такі як зволожувачі, емульгувальні і суспендуючі засоби, а також підсолоджувачі, смакові домішки і віддушки. Препарати за даним винаходом для парентерального введення включають, без обмеження, стерильні водні або неводні розчини, суспензії, емульсії і т. п. Приклади неводних розчинників або носіїв включають пропіленгліколь, поліетиленгліколь, рослинні олії, такі як оливкова олія і кукурудзяна олія, желатин, і органічні складні ефіри, що вводяться шляхом ін'єкції, такі як етилолеат. Такі лікарські форми можуть також містити допоміжні засоби, такі як консерванти, зволожуючі, емульгувальні і диспергуючі засоби. Препарати можна стерилізувати, наприклад, шляхом фільтрування через затримуючий бактерії фільтр, шляхом введення у композиції стерилізуючих засобів, шляхом опромінення композицій і/або шляхом нагрівання композицій. Фармацевтичні композиції, що містять нові аналоги IGF-1, які описуються у даному документі, можуть також бути одержані у формі стерильних твердих композицій, які можуть розчинятися у стерильній воді або якому-небудь іншому стерильному середовищі, що ін'єктується, безпосередньо перед використанням. Композиції для ректального або вагінального введення переважно являють собою супозиторії, які можуть містити, на додаток до активної речовини, ексципієнти, такі як масло какао або віск для супозиторіїв. 15 UA 103104 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Композиції для назального або сублінгвального введення також одержують зі стандартними ексципієнтами, добре відомими у даній галузі. Крім того, сполуки за даним винаходом можна вводити у композиції з уповільненим вивільненням, такі як композиції, описані у наведених далі патентах і патентних заявках. У патенті США № 5672659 описані композиції з уповільненим вивільненням, що містять біоактивний засіб і складний поліефір. У патенті США № 5595760 описані композиції з уповільненим вивільненням, що містять біоактивний засіб у гелеподібній формі. У патенті США № 5821221 описані композиції з уповільненим вивільненням, що містять біоактивний засіб і хітозан. У патенті США № 5916883 описані композиції з уповільненим вивільненням, що містять біоактивний засіб і циклодекстрин. У публікації PCT WО99/38536 описані композиції з уповільненим вивільненням, що абсорбуються, які містять біоактивний засіб. У публікації PCT WО00/04916 описаний спосіб одержання мікрочастинок, що містять терапевтичний засіб, такий як пептид, у системі емульсії "масло у воді". У публікації PCT WO00/09166 описані комплекси, що містять терапевтичний засіб, такий як пептид, і фосфорилований полімер. У публікації PCT WO00/25826 описані комплекси, що містять терапевтичний засіб, такий як пептид, і полімер, який несе лактон, що не полімеризується. Крім того, винахід, описаний у патенті США № 7258864, стосується способу лікування суб'єкта з дефіцитом інсуліноподібного фактора росту-1 (IGFD), що включає введення пацієнту педіатричного профілю ефективної кількості немодифікованого IGF-1, де суб'єкт характеризується наступним: a) під час лікування або перед вихідним лікуванням IGF-1 має або мав ріст щонайменше приблизно на 2 стандартних відхилення (SD) нижче нормального середнього росту для відповідного віку і статі, і b) під час лікування або перед вихідним лікуванням IGF-1 має або мав рівень IGF-1 у крові щонайменше приблизно на -1 SD нижче нормальних середніх рівнів, де суб'єкт не страждає на синдром Ларона або синдром часткової нечутливості до гормону росту, і де вказане введення ефективне для лікування IGFD у суб'єкта. Аналогічно, винахід, описаний у WO 2006/130769, стосується способу лікування суб'єкта з ідіопатичною низькорослістю (ISS), що включає введення пацієнту педіатричного профілю, який страждає на ISS, що характеризується неповною активністю або неповною сигналізацією ендогенного гормону росту, кількості IGF-1, ефективної для прискорення росту у суб'єкта, де суб'єкт додатково характеризується наступним: a) під час лікування або перед вихідним лікуванням IGF-1 має або мав ріст щонайменше приблизно на 2 стандартних відхилення (SD) нижче нормально середнього росту для відповідного віку і статі, і b) має рівні GH і IGF-1 у крові, які є щонайменше нормальними для суб'єкта того ж віку і статі. Крім того, нові аналоги, що описуються у даному документі, можуть бути введені окремо або у поєднанні з іншим терапевтичним засобом, що визначається професійним лікаремтерапевтом. Якщо не визначено інакше, всі технічні і наукові терміни, що використовуються у даному документі, мають те ж значення, яке їм звичайно надається фахівцем у галузі, якої стосується даний винахід. Також, всі публікації, патентні заявки, патенти та інші посилання, вказані у даному документі, включені, таким чином, у нього шляхом посилання, причому кожне у повному обсязі. 16 UA 103104 C2 17 UA 103104 C2 18 UA 103104 C2 19 UA 103104 C2 20 UA 103104 C2 21 UA 103104 C2 22 UA 103104 C2 23 UA 103104 C2 24 UA 103104 C2 25 UA 103104 C2 26 UA 103104 C2 27 UA 103104 C2 28