Імуногенна композиція глікопротеїну g вірусу hendra і/або nipah

Реферат: Винахід стосується вакцини, що містить глікопротеїн G вірусу Hendra і/або Nipah у кількості 5100 мкг/дозу, імуностимулюючий комплекс (ISC), який містить сапонін та стероїд, і один або більше ексципієнтів, у кількості, здатній ефективно викликати імунологічний захист проти вірусів Hendra і/або Nipah після введення суб'єкту, який сприйнятливий до вірусу Hendra і/або Nipah, де вказаний суб'єкт являє собою коня або свиню. UA 114086 C2 (12) UA 114086 C2 UA 114086 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Опис Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується імуногенних і вакцинних композицій, що містять глікопротеїн G вірусу Hendra (HeV) і/або вірусу Nipah (NiV), і способів їх застосування. Опис відомого рівня техніки Повторювані спалахи NiV, що приводять до значного числа людських смертей, останнім часом стали проблематичними (див., наприклад, Butler (2000) Nature 429, 7). Відомо також, що HeV приводить до загибелі людей і тварин, і генетично та імунологічно знаходиться у близькій спорідненості з NiV. У наш час відсутня вакцина або терапевтичні засоби для запобігання інфікуванню або захворюванням, що викликаються вірусом Nipah або вірусом Hendra. Як вірус Nipah, так і вірус Hendra, Національним інститутом Алергічних та Інфекційних Захворювань США віднесені до агентів категорії С стосовно біозахисту. Крім того, оскільки вказані віруси є зоонозними агентами 4 рівня біологічної безпеки (BSL-4), виробництво вакцин і/або діагностичних засобів з вказаною безпекою досить дороге і складне. Таким чином, існує необхідність у створенні вакцин і діагностичних засобів, що стосуються вірусу Nipah або вірусу Hendra, які зможуть забезпечити високу продуктивність вакцин і/або діагностичних засобів. Параміксовіруси, такі як HeV і NiV, містять два основних закріплених на мембрані глікопротеїни в оболонці вірусної частинки. Один глікопротеїн потрібен для прикріплення віріону до рецепторів на клітинах хазяїна і позначається або як гемаглютинін-нейрамідазний білок (HN), або як гемаглютиніновий білок (Н), і інший являє собою глікопротеїн (G), який не має ні гемаглютиназної, ні нейрамідазної активності. Глікопротеїни приєднання являють собою мембранні білки II типу, в яких аміно (N) кінець молекул орієнтований у напрямі цитоплазми, і карбокси (С) кінець білків є позаклітинним. Іншим основним глікопротеїном є злитий глікопротеїн (F), який являє собою тривимірний ф'юзогенний оболонковий глікопротеїн класу I, що містить дві ділянки гептадних повторів (HR) і гідрофобний злитий пептид. HeV і NiV інфікують клітини за рахунок рН-незалежного процесу мембранного злиття у сприймаючі клітини хазяїна за рахунок узгодженої дії їх глікопротеїну G і глікопротеїну F після рецепторного зв'язування. Основна функція глікопротеїну G приєднання HeV і NiV полягає в ангажуванні відповідних рецепторів на поверхні клітин хазяїна, які для більшості добре охарактеризованих параміксовірусів є фрагментами сіалової кислоти. Глікопротеїни G HeV і NiV використовують рецептори білків ефрину B2 і/або ефрину B3 клітин хазяїна, і були створені антитіла, які блокують приєднання вірусів за рахунок глікопротеїну G (WO2006137931, Bishop (2008) J. Virol. 82: 11398-11409). Крім того, були створені вакцини, які також використовують глікопротеїн G як засіб для вироблення імунозахисної реакції проти HeV і NiV інфекції (WO2009117035). Доза-сайт реакційна здатність є основною проблемою як у ветеринарії, так і для використання людиною Quil А у препаратах вакцин. Одним зі способів, які дозволяють уникнути вказаної токсичності Quil А, є використання імуностимулюючих комплексів (Rajput (2007) J. Zhejiang Univ. Sci. В, 8: 53-161). Це відбувається, головним чином, тому, що Quil А є менш реакційноздатним при включенні в імуностимулюючі комплекси, оскільки його зв'язок з холестерином у комплексі знижує його здатність витягувати холестерин з клітинних мембран, і, отже, його клітинолітичні ефекти. Крім того, для створення ефекту, аналогічного рівню ад'юванту, потрібна менша кількість Quil А. Імуномодуляторні властивості Quil А сапонінів і додаткові переваги, які можна одержати з вказаних сапонінів, якщо вони включені в імуностимулюючий комплекс, були розкриті у WO2000041720. Комбінація глікопротеїнів G HeV і/або NiV з імуностимулюючими комплексами в одній вакцині являє собою вдосконалення у розробці ефективних HeV і NiV вакцин, створюючи потенціал для підвищеної імунореактивності при зниженні побічних ефектів ад'ювантів, якщо вказані компоненти вводять у комбінації. Суть даного винаходу Даний винахід включає імуногенну композицію, що містить білок G вірусу Hendra і/або Nipah, імуностимулюючий комплекс (ISC) і один або більше ексципієнтів у кількості, ефективній для того, щоб викликати продукування нейтралізуючих антитіл проти вірусу Hendra і/або Nipah після введення суб'єкту. У деяких варіантах здійснення вказана імуногенна композиція містить сапонін, фосфоліпід і стероїд. У деяких варіантах здійснення розчинний глікопротеїн G вірусу Hendra складається з амінокислот 73-604 нативного глікопротеїну G Hendra (SEQ ID NO:2). У деяких варіантах здійснення розчинний глікопротеїн G вірусу Hendra кодується нуклеотидною послідовністю, що включає нуклеотиди 64-1662 у послідовності SEQ ID NO:16. У деяких варіантах здійснення розчинний білок G вірусу Hendra присутній у димерній формі, де кожна розчинна субодиниця димеру глікопротеїну G вірусу Hendra з'єднана одним або більше дисульфідними зв'язками. У 1 UA 114086 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 деяких варіантах здійснення розчинний білок G вірусу Hendra присутній у формі тетрамеру. У деяких варіантах здійснення тетрамерна форма представлена у вигляді димеру димерів, нековалентно зв'язаних і/або з'єднаних одним або більше дисульфідними зв'язками. Концентрація розчинного G білка вірусу Hendra може складати від 5 до 100 мкг/мл в імуногенній композиції. У деяких варіантах здійснення вказаний сапонін виділяють з Quillaja saponaria Molina, і може бути вибраний з QH-A, QH-B, QH-C або QS21. У деяких варіантах здійснення вказаний фосфоліпід вибирають з групи, що складається з фосфатидилхоліну (PC), дипальмітоїлфосфатидилхоліну (DPPC), фосфатидинової кислоти (фосфатидату) (PA), фосфатидилетаноламіну (PE), фосфатидилсерину (PS), фосфатидилінозиту (PI), фосфатидилінозитфосфату (PIP), фосфатидилінозитбісфосфату (PIP2), фосфатидилінозиттрифосфату (PIP3), фосфорилхоліну (SPH), церамідфосфорилетаноламіну (Cer-PE) і церамідфосфорилгліцерину. У деяких варіантах здійснення вказаний сапонін являє собою Quil А, вказаний фосфоліпід являє собою DPPC, стероїд являє собою холестерин і відношення Quil А:DPPC:холестерин у вказаній композиції становить 5:1:1 за масою. Даний винахід також включає спосіб вироблення у суб'єкта нейтралізуючої реакції антитіл проти вірусів Hendra і/або Nipah, що включає введення вказаному суб'єкту зазначеної імуногенної композиції, що розкривається у даному описі, у кількості і протягом періоду часу, ефективних для вироблення нейтралізуючої реакції антитіл. У деяких варіантах здійснення нейтралізуюча реакція антитіл знижує репродукування вірусів Hendra і/або Nipah у суб'єкта і може також зменшити шединг Hendra і/або Nipah вірусу у суб'єкта. У деяких варіантах здійснення суб'єкт був підданий впливу вірусу Hendra і/або Nipah, тоді як в інших варіантах здійснення суб'єкт уражений інфекцією вірусу Hendra і/або Nipah. У деяких варіантах здійснення даний винахід включає спосіб вироблення у суб'єкта нейтралізуючої реакції антитіл проти вірусу Hendra, що включає введення вказаному суб'єкту вказаної імуногенної композиції, що розкривається у даному описі, у кількості і протягом періоду часу, ефективних для вироблення нейтралізуючої реакції антитіл. У деяких варіантах здійснення даний винахід включає спосіб вироблення у суб'єкта нейтралізуючої реакції антитіл проти вірусу Nipah, що включає введення вказаному суб'єкту імуногенної композиції, що розкривається у даному описі, у кількості і протягом періоду часу, ефективних для вироблення нейтралізуючої реакції антитіл. У деяких варіантах здійснення вказану імуногенну композицію вводять внутрішньом'язово. У деяких варіантах здійснення вказану імуногенну композицію вводять у вигляді множини доз, причому після першої дози другу дозу вводять щонайменше від близько двадцяти одного дня до близько двадцяти восьми днів після першої дози. У деяких варіантах здійснення кожна доза містить близько 50 або близько 100 мкг розчинного білка G вірусу Hendra. Даний винахід, крім того, включає спосіб диференціації суб'єкта, вакцинованого імуногенною композицією, що розкривається у даному описі, від суб'єкта, який був підданий впливу вірусу Hendra і/або Nipah, що включає детектування присутності антитіл у біологічному зразку, виділеному з суб'єкта, проти щонайменше одного з будь-яких наступних вірусних білків HeV і/або NiV, вибраних з групи, що складається зі злитого білка (F), матриксного білка (M), фосфопротеїну (Р), великого білка (L) і нуклеокапсидного білка (N). Імуногенну композицію і способи даного винаходу можна застосовувати для суб'єктів, таких як людина, кінь, корова, вівця, свиня, коза, курка, собака або кішка. Даний винахід також включає спосіб вироблення у людини нейтралізуючої реакції антитіл проти вірусів Hendra і/або Nipah, що включає введення вказаному суб'єкту імуногенної композиції, що містить розчинний глікопротеїн G вірусу Hendra у кількості і протягом періоду часу, ефективних для вироблення нейтралізуючої реакції антитіл. У деяких варіантах здійснення вказана імуногенна композиція додатково містить ад'ювант. Опис фігур На фіг. 1 показана ректальна температура протягом часу для коней, яким вводять розчинний рекомбінантний глікопротеїн (sG) вірусу Hendra у кількості 50 або 100 мкг/доза з доданням як ад'юванту 250 мкг імуностимулюючого комплексу, з подальшим впливом живого вірусу Hendra у день 0. На фіг. 2 показана частота скорочень серця з плином часу у коней, яким вводять розчинний рекомбінантний глікопротеїн (sG) вірусу Hendra у кількості 50 або 100 мкг/доза з доданням як ад'юванту 250 мкг імуностимулюючого комплексу, з подальшим впливом живого вірусу Hendra у день 0. На фіг. 3 схематично показане одержання імуностимулюючого комплексу. На фіг. 4 схематично показана діаграма sGHeV вакцинації і схема зараження NiV. Дати sGHeV вакцинації, NiV зараження і евтаназії вказані стрілками. Зразки крові і мазків відбирають 2 UA 114086 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 у дні -42, -7, 0, 3, 5, 7, 10, 14, 21 і 28 після зараження, як вказано (*). Сірий текст відповідає зараженню тимеліном (верхній ряд); чорний текст відповідає вакцинації тимеліном (нижній ряд). Показане число африканських зелених макак (AGM) як суб'єктів для кожної групи дозування вакциною і один контрольний суб'єкт. На фіг. 5 показана крива виживання інфікованих NiV тварин. Результати для контрольних тварин (n=2) і вакцинованих sGHeV тварин (n=9) використовують для побудови кривої виживання Каплан-Мейєра. Контроль включає результати для однієї додаткової ретроспективної контрольної тварини. Вакциновані тварини одержують 10 мкг, 50 мкг або 100 мкг sGHeV, які двічі вводять підшкірно. Середній час до кінцевої стадії захворювання становить 11 днів для контрольних тварин, тоді як всі вакциновані суб'єкти залишалися живими до евтаназії у кінці дослідження. На фіг. 6 показаний NiV- і HeV-специфічний імуноглобулін (Ig) у вакцинованих тварин. Сироватку і назальні мазки відбирають у вакцинованих тварин, оцінюють реакції IgG, IgA і IgM, використовуючи sGHeV і sGNiV мультиплексний мікросферний аналіз. Сироватку або мазки від тварин в одній і тій самій групі вакцинної дози (n=3) аналізують індивідуально і розраховують середню інтенсивність флуоресценції мікросфер (M.F.I.), які відкладають на Y-осі. Планки погрішностей являють собою середню стандартну помилку від середнього. Сироватковий sGспецифічний Ig зображений чорним (sGHeV (відкриті трикутники), sGNiV (затушовані трикутники)) і мукозальний sG-специфічний IgA представлений сірими символами (sGHeV (відкриті трикутники), sGNiV (затушовані трикутники)). Переважний варіант здійснення даного винаходу Вакцинні та імуногенні композиції Вакцинна та імуногенна композиція даного винаходу викликає щонайменше одну з числа гуморальних і клітинних імунних реакцій у суб'єкта, якому вводять вказану композицію, або є ефективною для посилення щонайменше однієї імунної реакції проти щонайменше одного штаму HeV і/або NiV, тому їх введення придатне з метою вакцинації і/або запобігання проти HeV і/або NiV інфікування одним або більше штамами HeV і/або NiV. Вказана композиція даного винаходу доставляє суб'єкту, який потребує цього, глікопротеїн G, включаючи розчинні глікопротеїни G з HeV і/або NiV та імуностимулюючий комплекс (ISC), який діє як ад'ювант. У деяких варіантах здійснення кількість глікопротеїну G включає, але без обмежень, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200 або 250 мкг/мл, які також можуть містити 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 або 300 мкг/мл ISC. У деяких варіантах здійснення кількість глікопротеїну G становить 5, 50 або 100 і кількість ISC становить 250 мкг на мл. А. Білки G HeV і NiV У деяких варіантах здійснення вказані вакцинні та імуногенні композиції включають один або більше глікопротеїнів G HeV і/або NiV, як розкрито в описі. Термін білок в описі використовують у широкому значенні і він включає поліпептиди або їх фрагменти. Як приклад, але без обмеження, глікопротеїн G HeV може бути у розчинній формі і може включати амінокислоти 73604 амінокислотної послідовності глікопротеїну G HeV за Wang (2000) J. Virol. 74, 9972-9979 (див. також Yu (1998) Virology 251, 227-233). Також як приклад, але без обмеження, глікопротеїн G NiV може бути у розчинній формі і може включати амінокислоти 71-602 амінокислотної послідовності глікопротеїну G NiV за Harcourt (2000) Virology 271: 334-349, 2000 (див. також Chua (2000) Science, 288, 1432-1). Звичайно розчинні форми глікопротеїнів G HeV і NiV включають весь або частину ектодомену (наприклад, позаклітинну) глікопротеїну G з HeV або NiV, і звичайно їх одержують делецією всього або частини трансмембранного домену глікопротеїну G і всього або частини цитоплазмічного кінцевого сегмента глікопротеїну G. Як приклад, розчинний глікопротеїн G може включати повний ектодомен глікопротеїну G HeV або NiV. Також як приклад, але без обмежень, розчинний глікопротеїн G може включати весь або частину ектодомену і частину трансмембранного домену глікопротеїну G HeV або NiV. Розчинні глікопротеїни G HeV або NiV даного винаходу, які звичайно зберігають одну або більше з характеристик відповідного нативного вірусного глікопротеїну, таку як здатність взаємодіяти або зв'язуватися з вірусним рецептором клітин хазяїна, можуть бути одержані в олігомерній формі або формах, або здатність викликати продукування антитіл (включаючи, але, не обмежуючись ними, антитіла, що нейтралізують вірус), здатні розпізнавати нативний глікопротеїн G. Приклади додаткових характеристик включають, але не обмежуючись ними, здатність блокувати або запобігати інфікуванню клітин хазяїна. Звичайну методологію можна використовувати для оцінки розчинних глікопротеїнів G HeV або NiV стосовно однієї або більше вказаних характеристик. 3 UA 114086 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як приклад, але без обмежень, полінуклеотид, що кодує розчинний глікопротеїн G HeV, може включати полінуклеотидну послідовність, що кодує амінокислоти 73-604 амінокислотної послідовності для глікопротеїну G HeV за Wang (2000) J. Virol. 74, 9972-9979 (SEQ ID NO:2). Також як приклад, але без обмеження, полінуклеотид, що кодує розчинний глікопротеїн G HeV, може включати нуклеотиди 9129-10727 полінуклеотидної послідовності для глікопротеїну G HeV за Wang (2000) J. Virol. 74, 9972-9979. Крім того, також можна використовувати оптимізовану кодоном полінуклеотидну послідовність, що кодує амінокислоти 73-604 амінокислотної послідовності для глікопротеїну G HeV (SEQ ID NO:2). У деяких варіантах здійснення вказані оптимізовані кодоном послідовності включають або складаються з нуклеотидів 64-1662 з SEQ ID NO:16. У наступних варіантах здійснення оптимізовані кодоном послідовності включають або складаються з SEQ ID NO:16, яка включає нуклеотиди, що кодують Igk лідерну послідовність. Як приклад, але без обмеження, глікопротеїн G NiV може існувати у розчинній формі і включає амінокислоти 71-602 амінокислотної послідовності для глікопротеїну G NiV за Harcourt (2000) Virology 271, 334-349. Необмежувальні приклади послідовностей, які можна використовувати для конструювання розчинного глікопротеїну G NiV, можна знайти у Harcourt (2000) Virology 271, 334-349. Як правило, можна використовувати послідовності глікопротеїну G з будь-якого ізоляту або штаму вірусу Nipah для одержання полінуклеотидів і поліпептидів даного винаходу. Як приклад, але без обмеження, полінуклеотид, що кодує розчинний глікопротеїн G NiV, може включати полінуклеотидну послідовність, що кодує амінокислоти 71-602 амінокислотної послідовності для глікопротеїну G NiV за Harcourt (2000) Virology 271, 334-349. Також як приклад, але без обмеження, полінуклеотид, що кодує розчинний глікопротеїн G NiV, може включати 234-2042 полінуклеотидної послідовності для глікопротеїну G NiV за Harcourt (2000) Virology 271, 334-349 (SEQ ID NO:4). Крім того, можна також використовувати оптимізовану кодоном полінуклеотидну послідовність, що кодує амінокислоти 71-602 амінокислотної послідовності для глікопротеїну G NiV. Функціональні еквіваленти вказаних глікопротеїнів G можна використовувати в імуногенних і вакцинних композиціях даного винаходу. Як приклад, але без обмеження, функціонально еквівалентні поліпептиди мають одну або більше наведених далі характеристик: їм властива здатність взаємодіяти або зв'язуватися з вірусним рецептором клітини хазяїна, їх можна одержувати у димерній або тетрамерній формі або формах, їм властива здатність викликати продукування антитіла (включаючи, але не обмежуючись ними, нейтралізуючі віруси HeV і/або NiV антитіла), здатність розпізнавати нативний глікопротеїн G і/або здатність блокувати або запобігати інфікуванню клітини хазяїна. У деяких варіантах здійснення вказаний глікопротеїн G може бути у димерній і/або тетрамерній формі. Такі димери залежать від утворення дисульфідних зв'язків, що утворюються між цистеїновими залишками у глікопротеїні G. Такі дисульфідні зв'язки можуть відповідати таким, які утворюються у нативному глікопротеїні G (наприклад, положення цистеїнів залишається незмінним), коли експресовані у поверхні HeV або NiV, або можуть бути змінені у присутності або розташуванні (наприклад, за рахунок зміни положення цистеїну(ів) в амінокислотній послідовності) глікопротеїну G, таким чином утворюються відмінні димерна і/або тетрамерна форми глікопротеїну G, які підвищують антигенність. Крім того, недимеризовані і нететрамеризовані форми також включені в обсяг даного винаходу, знову беручи до уваги той факт, що глікопротеїн G присутній у вигляді численних конформаційно-залежних епітопів (тобто таких, що виникають за рахунок третинних тривимірних структур) і що збереження множини таких природних епітопів є особливо переважним, оскільки забезпечує реакцію нейтралізації антитіл. HeV імуногенні і вакцинні композиції даного винаходу можуть містити білки різної довжини, але включають амінокислотні залишки 73-604 з SEQ ID NO:2. В одному варіанті даного винаходу оболонкові білки даного винаходу щонайменше на близько 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 % ідентичні глікопротеїну HeV SEQ ID NO:2 (включаючи амінокислоти 73-604). Відповідно, глікопротеїни G HeV даного винаходу включають імуногенні фрагменти нативного глікопротеїну G HeV з достатньою кількістю амінокислот, щоб одержати конформаційні епітопи. Необмежувальні приклади імуногенних фрагментів включають амінокислотні послідовності, які можуть бути довжиною щонайменше 530, 531, 532, 533, 534 або 535, або більше амінокислот. У деяких варіантах здійснення вказаний глікопротеїн G HeV включає або складається з SEQ ID NO:2, або синтетичних конструкцій, що додатково включають Igx лідерну послідовність (SEQ ID NO:15). Вказані NiV імуногенні і вакцинні композиції даного винаходу можуть містити білки різної довжини, але включають амінокислотні залишки 71-602 з SEQ ID NO:4. В одному варіанті 4 UA 114086 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 даного винаходу капсульні білки даного винаходу щонайменше на близько 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 % ідентичні білкам глікопротеїну NiV SEQ ID NO:4 (включаючи амінокислоти 71-602). Відповідно, вказані глікопротеїни G NiV даного винаходу включають імуногенні фрагменти нативного глікопротеїну G NiV з достатньою кількістю амінокислот, щоб забезпечити одержання конформаційних епітопів. Необмежувальні приклади імуногенних фрагментів включають амінокислотні послідовності, які можуть бути довжиною щонайменше 528, 529, 530, 531, 532 або 533, або більше амінокислот. У деяких варіантах здійснення глікопротеїн G NiV включає або складається з SEQ ID NO:4 або синтетичних конструкцій, що додатково включають лідерну послідовність. Імуногенні фрагменти, як розкрито у даному описі, містять щонайменше один епітоп антигену і проявляють HeV і/або NiV антигенність, і здатні підвищувати імунну реакцію, якщо представлені у придатній конструкції, такій як, наприклад, коли вони злиті з іншими HeV і/або NiV антигенами або представлені на носії, причому імунна реакція направлена проти нативного антигену. В одному варіанті даного винаходу вказані імуногенні фрагменти містять щонайменше 20 безперервних амінокислот з HeV і/або NiV антигену, наприклад, щонайменше 50, 75 або 100 безперервних амінокислот з HeV і/або NiV антигену. Варіанти здійснення глікопротеїну G HeV і NiV крім того включають ізольований поліпептид, що включає амінокислотну послідовність, яка характеризується щонайменше 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 або 100 % ідентичністю нативним глікопротеїнам G HeV або NiV, де вказана поліпептидна послідовність може бути ідентична нативній амінокислотній послідовності глікопротеїну G HeV або NiV, або може включати аж до деякого цілого числа амінокислотних змін у порівнянні з амінокислотною послідовністю нативного HeV або NiV білка G, де вказані зміни вибирають з групи, що складається з щонайменше однієї амінокислотної делеції, заміщення, включаючи консервативне і неконсервативне заміщення, або вставки, і де вказані зміни можуть відбуватися по аміно- або карбокси-кінцевих положеннях порівняльної поліпептидної послідовності, або у будь-якому місці між вказаними кінцевими положеннями, розсіяними украпленими або розсіяними індивідуально між амінокислотами у порівняльній послідовності, або в одній або більше безперервних групах всередині амінокислотної послідовності нативного глікопротеїну G HeV або NiV. Рівень ідентичності або гомологічності послідовності по амінокислотній послідовності можна визначити, використовуючи BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) аналіз (програма для виявлення подібності послідовностей білків шляхом їх локального вирівнювання), при використанні алгоритму, що використовується програмами blastp, blastn, blastx, tblastn і tblastx (Altschul (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 і Karlin (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268), які сконструйовані для пошуку подібності послідовностей. Підхід, який використовується у вказаній BLAST програмі, зводиться спочатку до пошуку аналогічних сегментів, з гепами (не безперервними) і без гепів (безперервних), між послідовністю, що вивчається, і послідовністю з бази даних, потім оцінюють статистичну значущість всіх виявлених збігів і, нарешті, підсумовують тільки ті збіги, які відповідають заздалегідь вибраному порогу значущості. Для обговорення основних проблем пошуку подібності з базою даних послідовностей див. Altschul (1994) Nature Genetics 6, 119-129. Параметри пошуку для гістограм, описів, вирівнювань, припущень (тобто порогу статистичної значущості для інформованих збігів проти послідовностей бази даних), відсічок, матриць і фільтрів (низька комплексність) встановлені за умовчанням. Дефолтна матриця замін, що використовується blastp, blastx, tblastn і tblastx, являє собою BLOSUM62 матрицю (Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919), рекомендується для послідовностей, що вивчаються, довжиною більше 85 амінокислот. Вакцинні та імуногенні композиції даного винаходу можуть додатково включати додаткові білки G HeV і/або NiV з різних штамів, які можуть далі потенціювати способи імунізації даного винаходу. В. Імуностимулюючі комплекси Як правило, у даному винаході запропоновані імуногенні композиції, включаючи вакцинні композиції, що містять розчинні форми глікопротеїну G HeV і/або NiV оболонкового білка у комбінації з імуностимулюючим комплексом (ISC), і способи застосування вказаних композицій для запобігання і лікування HeV і/або NiV інфекцій у суб'єкта. У даному винаході вакцинні і/або імуногенні композиції включать імуностимулюючий комплекс, який діє як ад'ювант. Як використовується у даному описі, термін "ад'ювант" стосується агентів, які, хоча самі по собі не мають якого-небудь специфічного антигенного ефекту, можуть стимулювати імунну систему, підвищуючи реакцію на антиген. ISC має ряд відмітних ознак, які роблять його ідеальним для деяких застосувань: 5 UA 114086 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Економія антигену: Як відмічено, наприклад, у Wee (2008) Mucosal Immunol. 1, 489-496, у ситуаціях, коли доступність антигену обмежена або вартість антигену висока, було показано, що ISC дозволяють здійснювати 10-100 кратну економію антигену. Найбільш вірогідно це пов'язано з комбінацією підвищеної ефективності або більш придатним механізмом дії у порівнянні з іншими ад'ювантами. Крос-презентація: Як відмічено, наприклад, у Schnurr (2009) J. Immunol. 182, 1253-1259, надання антигену клітинами, що представляють антиген (APC), звичайно відбувається за однією з двох схем. Чужий антиген звичайно захоплюється APC, потім процесується і знову експресується на поверхню APC у контексті молекул II класу головного комплексу гістосумісності (MHC). Потім вони здатні до виявлення лімфоцитами і, якщо присутні правильні ко-стимуляторні фактори/сигнали, реагувати на них відповідним чином. Власні або ракові антигени і вірусні антигени звичайно процесуються і експресуються у контексті молекул класу I, оскільки вони присутні у цитоплазмі APC. Ефективний імунітет стосовно ракових і вірусних антигенів вимагає доступу до схеми класу I. Це відбувається природним шляхом у процесі інфікування вірусом або клітинного гомеостазу (клітинна регенерація внутрішніх антигенів). Антигенам (вірусним або власним), введеним у вигляді вакцини, необхідно потрапити із зовнішньої сторони клітини у механізм процесингу антигену вказаної клітини зі схеми класу II у схему класу I. Це може відбуватися природним шляхом у дендритних клітинах (DC-фахівці APC) або цього можна досягти шляхом вакцинації антигенами, змішаними з ISC як ад'ювантом. Вказаний процес знаходження шляху зовні одержаним антигеном у схему презентації антигену класу I називають перехресною презентацією. Точний механізм, за рахунок якого ISC досягає перехресної презентації антигену, повністю не був з'ясований, але може базуватися на порушенні структури мембран ISC компонентів. Гуморальні і опосередковані клітинами реакції: Як відмічено, наприклад, у Марасковського (2009) Immunol. Cell Biol. 87, 371-376, за рахунок механізму дії ISC задіяні як гуморальні, так і клітинні "плечі" адаптивної імунної системи. Для деяких видів це є паралельним профілю цитокінів, стимульованих вакцинацією вказаним ад'ювантом. Імунні реакції типу 1 характеризуються експресією інтерлейкіну-2 і IFN-гамма, і захистом від внутрішньоклітинних патогенів (бактерій, найпростіших і вірусів), і реакції типу 2 характеризуються експресією інтерлейкіну-4 і виробленням нейтралізуючих антитіл для імунітету, пов'язаного з антитоксинами і антипатогенами. ISC забезпечує збалансований профіль для цитокінів між вказаними двома крайнощами, забезпечуючи велику міру свободи імунної реакції. Крім того, у ряді досліджень було показано, що ISC можуть бути ефективними, якщо вакцини вводять інтраназально. Такий спосіб забезпечує сенсибілізацію поверхонь слизових оболонок і, таким чином, забезпечує відповідний імунітет у сайті введення патогену, особливо для вказаного випадку (захисні властивості слизових оболонок), див. також Sjolander (2001) Vaccine 19, 40724080. Критерії стерильного фільтрування і стабільного одержання: Розміри ISC частинок звичайно складають 40 нм у діаметрі, що дозволяє їм проходити через фільтри, які використовують для подальшої стерилізації препаратів у лікарській формі. Крім того, природну тенденцію для тритерпеноїдних сапонінів, як виявлено у Quil А, асоціюватися з холестерином і фосфоліпідами, розглядають як перевагу при розробці способів одержання ISC. Зразки Quil А, які не утворюють ISC частинок, видаляють діалізом з кінцевого продукту. Регулюючи відношення компонентів, однорідний продукт одержують з гетерогенного спектра Quil А сапонінів. Вказане відношення є важливим, оскільки відхилення приводять до структур, які не характеризуються розміром частинок 40 нм (спіралі, листи і т.д.). Характер, що вільно пересипається, ISC колоїду і можливість його вимірювання з використанням трансмісійної електронної мікроскопії, ВЕРХ та інших методів, робить вказаний ад'ювант придатним для розробки оцінок виходів та інших характеристик якості. Таким чином, на основі викладеного вище, у деяких варіантах здійснення лікарська форма імуностимулюючих комплексів з оптимальною кількістю глікопротеїну G включає молекули сапоніну, фосфоліпіду і стероїду. У деяких варіантах здійснення молярне відношення молекул сапоніну, фосфоліпіду і стероїду складає 5:1:1. Імуностимулюючі комплекси можуть містити, наприклад, 5-10 % мас. сапоніну, 1-5 % молекул стероїду і фосфоліпіду та інше складає глікопротеїн G. Глікопротеїн G можна включати в імуностимулюючі комплекси або безпосередньо, або хімічним поєднанням з білком носія (наприклад, у вигляді гібридного або злитого білка) після включення білка в імуностимулюючі комплекси. У посиланнях на імуностимулюючі комплекси потрібно розуміти, що вони включають посилання на їх похідні, хімічні еквіваленти і аналоги. У деяких варіантах здійснення ISC змішують окремо від глікопротеїнів G HeV і/або NiV, і потім домішують глікопротеїни G, з одержаним ISC. У деяких 6 UA 114086 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіантах здійснення глікопротеїни G змішують безпосередньо з молекулами сапоніну, фосфоліпіду і стероїду. У деяких варіантах здійснення вказаний сапонін для використання у даному винаході являє собою Quil А і/або його похідні. Quil А являє собою препарат сапоніну, виділений з Південноамериканського дерева Quillaja saponaria Molina, і був вперше описаний як такий, що має ад'ювантну активність Dalsgaard (1974) Saponine adjuvants, Archiv. Fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, pp. 243-254. Очищені фрагменти Quil А були виділені за допомогою ВЕРХ, причому цей метод зберігає ад'ювантну активність, але без токсичності, пов'язаної з Quil А (EP 0362278), наприклад, QS7 і QS21 (також відомі як QA7 і QA21). QS21 являє собою природний сапонін, одержаний з кори Quillaja saponaria Molina, який індукує CD8+ цитотоксичні Т клітини (CTL), Th1 клітини і переважно реакцію lgG2a антитіл, і являє собою сапонін для використання у контексті даного винаходу. Інші сапоніни, придатні для використання в ISC, включають, але не обмежуючись ними, QH-A, QH-B і QH-C субфракції Quil А, які одержують з видів, відмінних від Quillaia saponaria, такі, які одержані з роду Panax (женьшень), Astragalus, Achyranthes, соєвих бобів, Acacia і Codonopsis. У деяких варіантах здійснення вказаний сапонін виділяють з видів, відмінних від Quillaia saponaria. Необмежувальні приклади фосфоліпідів для використання в імуногенних і вакцинних композиціях даного винаходу включають молекули з діацилгліцеридними структурами і фосфоспінголіпідами. Необмежувальні приклади фосфоліпідів з діацилгліцеридними структурами включають фосфатидинову кислоту (фосфатидат) (PA), фосфатидилетаноламін (цефалін) (PE), фосфатидилхолін (лецитин) (PC), дипальмітоїлфосфатидилхолін (DPPC) або фосфатидилсерин (PS). Інший необмежувальний приклад фосфоліпідів з діацилгліцеридними структурами включає фосфоінозитиди. Приклади фосфоінозитидів включають, але не обмежуючись ними, фосфатидилінозит (PI), фосфатидилінозитфосфат (PIP), фосфатидилінозитбісфосфат (PIP2) або фосфатидилінозиттрифосфат (PIP3). Небмежувальні приклади фосфоспінголіпідів включають фосфорилхолінцерамід (сфінгомієлін) (SPH), фосфорилетанол-амінцерамід (сфінгомієлін) (Cer-PE) або фосфорилгліцеринцерамід. Стероїдні молекули для використання в імуногенних і вакцинних композиціях даного винаходу включають молекули, які містять стероїд як частину своєї структури. Необмежувальні приклади стероїдних молекул включають холестерин, прегненолон, 17-альфагідроксипрегненолон, дегідроепіандростерон, адростендіол, прогестерон, 17-альфагідроксипрогестерон, андростендіон, тестостерон, дигідрокситесторон, деоксикортикостерон, 11-деоксикортикостерон, кортизол, кортикостерон, альдостерон, естрон, естрадіол або естріол. У деяких варіантах здійснення імуностимулюючі комплекси являють собою як правило, але не обмежуючись ними, дрібні кейдж-структури діаметром 30-40 нм. У деяких варіантах здійснення утворення імуностимулюючих комплексів вони мають молярне відношення Quil А:холестерин:фосфатидилхолін і глікопротеїн G, що відповідає 5:1:1. Імуностимулюючі комплекси можуть містити, наприклад, 5-10 % мас. Quil А, 1-5 % холестерину і фосфоліпідів, та інше складає глікопротеїн G. Глікопротеїн G може бути включений в імуностимулюючі комплекси або безпосередньо, або шляхом поєднання з білком носія (наприклад, гібридним або злитим білком) після включення білка в імуностимулюючі комплекси. При посиланні на імуностимулюючі комплекси потрібно розуміти, що вони включають також посилання на похідні, хімічні еквіваленти і аналоги. Наприклад, посилання на похідне імуностимулюючого комплексу включає посилання на імуностимулюючий комплекс, в якому один або більше з Quil А, холестерину, фосфатидилхоліну або білка, наприклад, виключений, заміщений, або якийнебудь компонент крім Quil А, холестерину, фосфатидилхоліну або білка доданий до комплексу. Функціональний еквівалент імуностимулюючого комплексу може бути імуностимулюючим комплексом, в якому один або більше з його чотирьох компонентів замінений функціональним еквівалентом. У деяких варіантах здійснення даного винаходу G глікопротеїновий компонент імуностимулюючого комплексу виключений. Такий тип імуностимулюючого комплексу в описі називають імуностимулюючим комплексом, що не містить білка (безбілковим). У деяких варіантах здійснення даний винахід включає, але без обмежень, імуногенну композицію, що містить виділений білок G HeV або NiV, здатний викликати продукування перехресно-реакційної нейтралізуючої антисироватки проти численних штамів HeV і/або NiV in vitro, і ад'ювант, що включає Quil А, DPPC і холестерин, наприклад, де композиція містить: 5, 50 або 100 мкг розчинного G білка HeV або NiV, і відповідні кількості Quil А, DPPC і холестерину. Додаткові приклади варіантів здійснення імуностимулюючих комплексів і способів їх одержання розкриті в EP 0242380B1 і EP 0180564B1, а також у WO2000041720 (див., наприклад, стор. 3 і 9, посилання на: Cox & Coulter (1992) Advances in Adjuvant Technology and Application in Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology, Chapter 4, Yong (ed.), CRC Press; Dalsgard (1974) 7 UA 114086 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Gesamte Вірус forsch, 44, 243-254; Australian Patent Specification Nos. 558258, 589915, 590904 & 632067. Див. також репрезентативні протоколи, розкриті у патенті США 6506386, і посилання, що наводяться там на добре відомий факт, що імуностимулюючі комплекси можна використовувати, якщо білковий антиген включений в імуностимулюючий комплекс при його створенні (див. EP 0109942B1), або, альтернативно, надані заздалегідь одержані імуностимулюючі комплекси, які потім змішують з аліквотою антигену, що окремо додається, для створення вакцини (див. EP 0436620B1). Як звичайно потрібно розуміти, білковий антиген може бути також ковалентно приєднаний до імуностимулюючого комплексу (див. знову EP 0180564B1). Як також повинно бути добре зрозуміло фахівцям у даній галузі, імуностимулюючі комплекси можна вводити шляхом вакцинації через слизову оболонку (див. Mowat (1991) Immunology 72, 317-322) і імуностимулюючі комплекси даного винаходу можна далі вдосконалити для вакцинації через слизову оболонку шляхом включення в них націлених на мембрану білків (WO 9730728). У деяких варіантах здійснення даний винахід включає, але без обмежень, імуногенну композицію, що містить виділений білок G HeV або NiV, здатний індукувати продукування перехресно-реактивної нейтралізуючої антисироватки проти численних штамів HeV і/або NiV in vitro, і ад'ювант, що включає Quil А, DPPC і холестерин, наприклад, де композиція містить: 5, 50 або 100 мкг розчинного G білка HeV або NiV, і відповідні кількості Quil А, DPPC і холестерину. Додаткові приклади варіантів здійснення імуностимулюючих комплексів розкриті у WO 200004720. У наступному варіанті здійснення даного винаходу вказані вакцинні та імуногенні композиції можуть складати частину фармацевтичної композиції. Фармацевтичні композиції даного винаходу можуть містити придатні фармацевтично прийнятні носії, що включають ексципієнти і допоміжні речовини, які полегшують переробку активних сполук у лікарські препарати, які можна використовувати фармацевтично для доставки їх у місце дії. С. Ексципієнти Імуногенні та вакцинні композиції даного винаходу можуть додатково включати фармацевтично прийнятні носії, ексципієнти і/або стабілізатори (див., наприклад, Remington: The Science and practice of Pharmacy (2005) Lippincott Williams), у формі ліофілізованих лікарських препаратів або водних розчинів. Придатні носії, ексципієнти або стабілізатори є нетоксичними для реципієнтів у вказаних дозах і концентраціях і можуть включати буфери, такі як фосфат, цитрат та інші органічні кислоти; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту і метіонін; консерванти (такі як натрієва сіль ртуть(о-карбоксифеніл)тіо)етилу (тіомерсал), октадецилдиметилбензиламонійхлорид; гексаметонійхлорид; бензалконійхлорид, бензетонійхлорид; фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метилпарабен або пропілпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол і м-крезол); білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідин; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, включаючи глюкозу, манозу або декстрани; хелатуючі агенти, такі як EDTA; цукри, такі як сахароза, маніт, трегалоза або сорбіт; протиіони, що утворюють солі, такі як натрій; комплекси металів (наприклад, комплекси Zn-білок); і/або неіонні поверхнево-активні речовини, такі як поліетиленгліколь (PEG), твін або плуронікс. Композиції даного винаходу можуть бути у дозованій формі, суспендованій у будь-якому придатному фармацевтичному засобі доставки або носії, у достатньому об'ємі, для здійснення дозування. Як правило, кінцевий об'єм, включаючи носії, ад'юванти і т.п., складає щонайменше 1,0 мл. Верхня межа визначається практично кількістю, яку необхідно ввести, звичайно не більше, ніж від близько 0,5 мл до близько 2,0 мл. Способи застосування Даний винахід включає способи запобігання і/або лікування вірусної інфекції Hendra і/або Nipah, що включають введення імуногенних і вакцинних композицій даного винаходу будь-якому ссавцю. Активний імунітет, що виробляється шляхом вакцинації глікопротеїном G HeV і/або NiV з ад'ювантами, розкритими у даному описі, може ініціювати або підвищувати клітинну або гуморальну імунну відповідь. Ефективна кількість глікопротеїнів G HeV і/або NiV або їх антигенних фрагментів може бути одержана у суміші з ад'ювантом для одержання вакцини. Даний винахід включає способи запобігання і/або лікування людей, інфікованих вірусом Hendra і/або Nipah, що включають введення імуногенних і/або вакцинних композицій, які містять розчинний глікопротеїн G HeV і/або NiV або їх комбінації, окремо або у комбінації з щонайменше одним ад'ювантом, придатним для використання у медицині. Ад'юванти, придатні для використання у медицині, можна використовувати окремо або у комбінації. Приклади ад'ювантів, придатних для використання у медицині, включають, але не обмежуючись ними, 8 UA 114086 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 солі алюмінію. Приклади солей алюмінію включають, але не обмежуючись ними, гідроксид алюмінію, гель гідроксиду алюмінію (Alhydrogel™), фосфат алюмінію, алюм (калійалюмінійсульфат) або суміші солей алюмінію. Додаткові приклади ад'ювантів, придатних для використання у медицині, включають, але не обмежуючись ними, емульсії типу вода-умаслі, емульсії типу масло-у-воді і AS04 (комбінацію гідроксиду алюмінію і монофосфорилліпіду А) і CpG олігодезоксинуклеотиди. CpG олігодезоксинуклеотиди являють собою синтетичні олігонуклеотиди, які містять неметильовані CpG динуклеотиди у визначеній послідовності контекстів (CpG фрагменти). Вказані фрагменти CpG присутні у 20-кратному надлишку у бактеріальних ДНК у порівнянні з ДНК ссавців. CpG олігодезоксинуклеотиди розпізнаються Tollподібним рецептором 9 (TLR9), що приводить до сильних імуностимулюючих ефектів. Введення вакцини або імуногенної композиції, що містить глікопротеїн G HeV і/або NiV з одним або більше розкритими в описі ад'ювантами, може здійснюватися або з профілактичною, або з терапевтичною метою. В одному аспекті даного винаходу вказану композицію можна використовувати з метою профілактики. Якщо вакцинну композицію вводять профілактично, її вводять до виявлення яких-небудь ознак або симптомів інфікування HeV і/або NiV. Профілактичне введення ефективної кількості сполуки(сполук) служить для запобігання або ослаблення якого-небудь подальшого інфікування HeV і/або NiV. Якщо вакцину вводять з терапевтичною метою, тоді вказану вакцину вводять в ефективній кількості після визначення симптомів реального інфікування. Вважають, що композиція "фармакологічно прийнятна", якщо її введення переноситься реципієнтом. Таку композицію потрібно вводити у "терапевтично або профілактично ефективній кількості", якщо кількість, що вводиться, є фізіологічно значущою. Вакцинна або імуногенна композиції даного винаходу є фізіологічно значущими, якщо їх присутність приводить до помітних змін у фізіології реципієнта, наприклад, підвищуючи високореакційні гуморальні або клітинні реакції відносно одного або більше зі штамів HeV і/або NiV. Захист, що надається, не повинен бути абсолютним (тобто HeV або NiV інфікування не повинно бути повністю запобігнуте або усунене), за умови, що існує статистично значуще поліпшення у порівнянні з контрольною популяцією. Захист може бути обмежений ослабленням тяжкості захворювання або зменшенням швидкості виникнення симптомів захворювання. Вакцинна або імуногенна композиція даного винаходу може надавати стійкість до численних штамів HeV і/або NiV. Як використано у даному описі, вакцина призначена для запобігання або ослаблення інфікування, якщо її введення суб'єкту приводить або до повного, або часткового ослаблення (тобто придушення) симптому або стану інфекції, або до вироблення повного або часткового імунітету індивідуума до інфікування. Щонайменше одну вакцинну або імуногенну композицію даного винаходу можна вводити будь-якими способами, які досягають поставленої мети, використовуючи фармацевтичну композицію, як розкрито у даному описі. Наприклад, вводити таку композицію можна різними парентеральними способами, такими як підшкірне, внутрішньовенне, черезшкірне, внутрішньом'язове, внутрішньочеревинне, інтраназальне, трансдермальне, букальне введення. В одному варіанті здійснення даного винаходу вказану композицію вводять підшкірно. Парентеральне введення може бути болюсною ін'єкцією або може здійснюватися введення у вигляді постійної перфузії протягом деякого проміжку часу. Звичайна схема запобігання, придушення або лікування захворювання або стану, які можна ослабити за рахунок клітинної імунної реакції, викликаної активною специфічною клітинною імунотерапією, включає введення ефективної кількості вакцинної композиції, як вказано вище, здійснюване як окреме введення або як повторне введення у вигляді посилюючих або бустерних доз, протягом проміжку часу аж до і включаючи від одного тижня до близько двадцяти чотирьох місяців. Необмежувальні приклади включають першу дозу з подальшою другою дозою через близько щонайменше 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 або 24 дні після першої дози (день 0). Кількість імуногенної або вакцинної композиції у дозі може бути менше ніж, рівна або більше ніж у першій дозі, введеній у день 0. Відповідно до даного винаходу, "ефективна кількість" вакцинної або імуногенної композиції є такою, якої досить для досягнення необхідного біологічного ефекту, причому у цьому випадку виникає щонайменше одна з клітинних або гуморальних реакцій на один або більше штамів HeV і/або NiV. Потрібно розуміти, що величина ефективної дози буде залежати від віку, статі, стану здоров'я і маси суб'єкта, типу супутнього лікування, якщо воно проводиться, частоти введення дози і характеру очікуваного ефекту. Інтервали ефективних доз, які наводяться нижче, жодним чином не обмежують даний винахід і являють собою приклади інтервалів доз, які можуть виявитися придатними для введення композицій даного винаходу. Однак, вказані дози 9 UA 114086 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можуть бути підібрані відповідно до конкретного суб'єкта, як легко може бути зрозуміло фахівцям у даній галузі, без якого-небудь експериментування. Реципієнтами вакцинних та імуногенних композицій даного винаходу можуть бути будь-які суб'єкти, які можуть набути специфічного імунітету за рахунок клітинної або гуморальної імунної реакції на HeV і/або NiV, де клітинна реакція опосередкована білком MHC класу i або класу ii. Серед ссавців реципієнтами можуть бути ссавці типу приматів, включаючи людей, шимпанзе, приматів і мавп. В одному варіанті здійснення даного винаходу запропонований спосіб лікування людей вакцинними або імуногенними композиціями даного винаходу. Суб'єкти можуть бути інфіковані HeV і/або NiV, або можуть представляти модель HeV або NiV інфікування в експериментальних дослідженнях. У деяких варіантах здійснення суб'єктом є домашній ссавець, включаючи, але не обмежуючись ними, коня, корову, бика, буйвола, вівцю, свиню (Mingyi (2010) Vet. Res. 41, 33), козу, собаку (Biosecurity Alert-Hendra Virus Update, 27 July 2011, Press Release, Biosecurity Queensland) або кішку. У деяких варіантах здійснення суб'єктом є домашні птахи, включаючи курку. Вакцини даного винаходу також забезпечують перехресний імунітет проти інфікування вірусом Nipah, у дозах, які використовують для захисту проти інфікування вірусом Hendra, а також забезпечують ефективну вакцинацію проти вірусу Nipah. Посилання на ефективну імунну реакцію потрібно розуміти як посилання на імунну відповідь, яка безпосередньо або опосередковано приводить до сприятливого профілактичного або терапевтичного ефекту. У тому випадку, якщо імуноген включає глікопротеїн G HeV або NiV, як розкрито у даному описі, така реакція включає зниження або припинення вірусного репродукування і/або вірусного шедингу, і/або ослаблення симптомів захворювання у тварини. Потрібно розуміти, що ефективність є функціональною мірою і не визначається тільки посиланням на титри анти-HeV і/або анти-NiV антитіл, оскільки тільки присутність циркулюючих антитіл не є необхідним показником ефективності вказаних циркулюючих антитіл стосовно припинення вірусного репродукування і шедингу. Також як приклад, але без обмеження, якщо розчинний G білковий поліпептид даного винаходу вводять для посилення імунної відповіді у суб'єкта, інфікованого або такого, який підозрюється в інфікуванні Hendra або Nipah, і/або якщо антитіла даного винаходу вводять у вигляді пасивної імунотерапії, вказані композиції можуть додатково включати, наприклад, інші терапевтичні засоби (наприклад, противірусні засоби). Приклад 4 нижче пропонує інформацію про деякі переважні композиції для застосування при вакцинації коней. Що стосується інших тварин, які можуть бути інфіковані вірусом Hendra, і яким тому потрібна вакцинація для захисту як тварин, так і людей від інфікування обома вірусами Hendra і Nipah, звичайно застосовна наступна інформація, яка може бути легко адаптована фахівцями у даній галузі. Кажучи загалом, тваринам-компаньйонам (собакам і кішкам) потрібно приблизно 25 мікрограмів антигену Hendra, і може бути сприятливим використання ISC ад'юванту в інтервалі 25-150 мікрограмів, при відношенні 5:1:1 сапоніну, фосфоліпіду і стерину, що входять у переважні ISC композиції, причому можна використовувати будь-який з типів компонентів, як розкрито у даному описі. Для тварин-компаньйонів переважно, щоб кінцева доза складала близько 1 мл. Polygen™ (MVP Technologies), ад'ювант на базі співполімеру, також можна використовувати, переважно у кількості близько 5-15 % (об./об.). Кажучи загалом, для великих фермерських тварин (овець, корів, свиней і т.д.) застосовні дозові кількості антигену і ад'юванту (і кінцевий об'єм доз), які відрізняються від наведених в описі для коней, тобто, можна використовувати близько 50-100 мікрограмів антигену, і звичайно близько 250 мікрограмів ISC, при кінцевому об'ємі, наприклад, 1-3 мл. Що стосується свиней, то альтернативна і ефективна композиція ад'юванту містить (приблизно для такої ж кількості антигену) суміш ISC та іонного полісахариду, конкретно 100 мг DEAE декстрану і 800 мікрограмів ISC в 1-3 мл кінцевого об'єму дози (знову 5:1:1 Quil А:фосфатидилхолін:холестерин (див. WO 2000/41720)). Диференціація вакцинованих тварин Даний винахід також включає способи диференціації здорових вакцинованих тварин від тварин, які були піддані впливу або інфіковані HeV і/або NiV. За час інфікування HeV і NiV експресують додаткові білки, відмінні від глікопротеїну G (G), включаючи злитий білок (F), матриксний білок (M), фосфопротеїн (Р), великий білок (L) і нуклеокапсидний білок (N). Вказані додаткові білки мають здатність індукувати у тварин імунні відповіді у формі антитіл, які зв'язуються з вказаними білками, або Т клітинний імунітет. Рівень реакції антитіл на вказані інші білки звичайно можна виміряти, використовуючи аналізи, такі як імуноферментний аналіз (EIA). Імуногенні і вакцинні композиції даного винаходу у деяких варіантах здійснення містять тільки глікопротеїн G як HeV і/або NiV антиген і тому індукують імунні реакції антитіл тільки з 10 UA 114086 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 глікопротеїнами G HeV і/або NiV. Тварини, вакциновані розкритими у даному описі імуногенними композиціями, яких потім інфікують HeV або NiV, виробляють бустерну імунну реакцію на глікопротеїн G, але також демонструють презентацію антитіл на деякі інші HeV і NiV білки, відмінні від глікопротеїну G. Таким чином, присутність антитіл до будь-якого зі злитого білка (F), матриксного білка (M), фосфопротеїну (Р), великого білка (L) і нуклеокапсидного білка (N) можна виміряти, використовуючи EIA, для визначення присутності або відсутності антитіл, специфічних до вказаних білків у зразках сироватки. Якщо детектується антитіло до будь-якого з вказаних інших білків (тобто відмінних від глікопротеїну G), це означає, що тварина була піддана впливу HeV і/або NiV. Альтернативно, якщо не детектується антитіло до вказаних інших білків, а детектуються тільки антитіла, що зв'язують білок G, це означає, що тварина була тільки вакцинована. EIA даного винаходу одночасно і високоспецифічні, і високоселективні при детектуванні і диференціюванні між тваринами, інфікованими HeV і/або NiV та здоровими тваринами, які були вакциновані розкритими у даному описі імуногенними композиціями. У даному винаході можна використовувати різні способи аналізів, включаючи ELISA, як у гомогенному, так і у гетерогенному оточенні. Вказані способи аналізів можна проводити на зразках, таких як кров, сироватка, молоко або будь-які інші рідини організму, що містять антитіла. У деяких варіантах здійснення антитіла, що використовуються для EIA, можуть унікально конкурувати з антитілами, що виробляються за рахунок вакцинації глікопротеїном G, але не з антитілами, що виробляються у тварин внаслідок інфікування HeV і/або NiV. Це дозволяє не тільки проводити серологічну діагностику HeV і NiV інфікування, але і диференціацію вакцинованих від інфікованих тварин в одному аналізі. Процедуру EIA можна проводити на стандартних зразках сироватки крові або на будь-яких рідинах організму або секретах організму, що містять антитіла. У процедурах EIA можна використовувати моноклональні і/або поліклональні антитіла до глікопротеїнів G і будь-яких інших HeV і/або NiV вірусних білків (наприклад, до злитого білка (F), матриксного білка (M), фосфопротеїну (Р), великого білка (L) і нуклеокапсидного білко (N), оскільки такі білки не присутні у вакцинованих здорових тварин, які не були піддані впливу HeV і/або NiV). Вказані EIA можна здійснювати на будь-якій з комерційно доступних стаціонарних або портативних-ручних, напівавтоматичних або роботехнічних автоматизованих ELISA установок з програмним забезпеченням і комп'ютерною обробкою результатів. У деяких варіантах здійснення вказані способи диференціації здорових вакцинованих тварин від тварин, підданих впливу або інфікованих HeV і/або NiV, можна проводити на біологічних зразках, виділених з домашніх ссавців, включаючи, але не обмежуючись ними, коней, корів, овець, свиней, кіз, собак або кішок. У деяких варіантах здійснення суб'єктом є домашні птахи, включаючи курей. У деяких варіантах здійснення суб'єктом є людина. Приклади Наведені нижче приклади ілюструють тільки деякі, але аж ніяк не всі варіанти здійснення даного винаходу, і тому їх не треба розглядати як такі, що обмежують обсяг даного винаходу. Приклад 1: Конструкції векторів Вектори конструюють для експресії HeV G або NiV G з видаленим трансмембранним/цитоплазмічним кінцем. Клоновану кДНК повної довжини білка G HeV або NiV ампліфікують, використовуючи ПЛР (полімеразну ланцюгову реакцію) для створення фрагментів з близько 2600 нуклеотидів, що кодують білок G HeV або NiV з видаленим трансмембранним/цитоплазмічним доменом/цитоплазмічним кінцем. Для ампліфікації HeV G синтезують наведені нижче олігонуклеотидні праймери sHGS: 5'-GTCGACCACCATGCAAAATTACACCAGAACGACTGATAAT-3' (SEQ ID NO:5). sHGAS: 5-GTTTAAACGTCGACCAATCAACTCTCTGAACATTGGGCAGGTATC-3'. (SEQ ID NO:6). Для ампліфікації NiV G були синтезовані наведені нижче олігонуклеотидні праймери. sNGS: 5'-CTCGAGCACCATGCAAAATTACACAAGATCAACAGACAA-3' (SEQ ID NO:7). sNGAS: 5-CTCGAGTAGCAGCCGGATCAAGCTTATGTACATTGCTCTGGTATC-3'. (SEQ ID NO:8). Всі ПЛР реакції проводять, використовуючи Accupol ДНК полімеразу (PGS Scientifics Corp) у наступному режимі: спочатку 94 °C протягом 5 хвилин і потім 94 °C протягом 1 хвилини, 56 °C протягом 2 хвилин, 72 °C протягом 4 хвилин; 25 циклів. Вказані праймери створюють продукт ПЛР для sHeV G ORF оточеної Sal 1 сайтами і sNiV G ORF оточеної Xho 1 сайтами. ПЛР продукти очищають на гелі (Qiagen). Після очищення на гелі sHeV G і sNiV G субклонують у TOPO вектор (Invitrogen). 11 UA 114086 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 PSectag2B (Invitrogen) купують і модифікують таким чином, щоб вони містили S-пептидний маркер або myc-епітопний маркер. Синтезують олігонуклеотиди, що перекриваються, які кодують послідовність для S-пептиду, і переварюють Kpn 1 і EcoR1 виступаючі ("липкі") кінці. SPEPS: 5'-CAAGGAGACCGCTGCTGCTAAGTTCGAACGCCAGCACATGGATTCT-3' (SEQ ID NO:9). SPEPAS: 5'-AATTAGAATCCATGTGCTGGCGTTCGAACTTAGCAGCAGCGGTCTCCTTGGTAC3' (SEQ ID NO:10). Синтезують олігонуклеотиди, що перекриваються, які кодують послідовність для mycепітопного маркера і переварюють Kpn 1 і EcoR1 виступаючі ("липкі") кінці. MTS: 5'-CGAACAAAAGCTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3' (SEQ ID NO:11). MTAS: 5-AATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGCTTTTGTTCGGTAC-3' (SEQ ID NO:12). 64 пмоль SPEPS і 64 пмоль SPEPAS змішують і нагрівають до 65 °C протягом 5 хвилин і повільно охолоджують до 50 °C. 64 пмоль MTS і 64 пмоль MTAS змішують і нагрівають до 65 °C протягом 5 хвилині повільно охолоджують до 50 °C. Дві одержані суміші розбавляють і клонують у Kpn1-EcoR1 переварений pSecTag2B з одержанням модифікованого S-пептидом pSecTag2B або модифікованого myc-епітопом pSecTag2B. Всі конструкції спочатку скринують, використовуючи фрагменти рестрикції, і потім підтверджують секвенуванням. TOPO sG конструкцію переварюють, використовуючи Sal 1, очищають на гелі (Qiagen) і субклонують у рамці у сайт Xho 1 модифікованого S-пептидом pSecTag2B або модифікованого myc-епітопом pSecTag2B. Всі конструкції спочатку скринують, використовуючи фрагменти рестрикції, і потім підтверджують секвенуванням. Створюють Igk лідер-S-пептид-s HeVG (sGS-tag) і Igk лідер-myc tag-sHeVG (sGmyc-tag) конструкції, які потім субклонують у вакцинний шатл вектор pMCО2. Синтезують олігонуклеотид SEQS: 5'TCGACCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTA-3' (SEQ ID NO:13) і використовують у комбінації з олігонуклеотидом sHGAS для ампліфікації за допомогою ПЛР sGs-tag і sGmyc-tag. Всі ПЛР реакції здійснюють, використовуючи Accupol ДНК полімеразу (PGS Scientifics Corp.) у наступному режимі: 94 °C протягом 5 хвилин спочатку і потім 94 °C протягом 1 хвилини, 56 °C протягом 2 хвилин, 72 °C протягом 4 хвилин; 25 циклів. Вказані праймери створюють ПЛР продукти, фланковані Sal 1 сайтами. ПЛР продукти очищають на гелі (Qiagen). Після очищення на гелі sGs-tag і sGmyc-tag субклонують у TOPO вектор (Invitrogen). sG S-маркер і sG myc-маркер переварюють за допомогою Sal 1 і субклонують у Sal 1 сайт pMCО2. Всі конструкції спочатку скринують, використовуючи фрагменти рестрикції, і потім підтверджують секвенуванням. Потім створюють оптимізовану кодоном нуклеотидну послідовність для полегшення продукування в еукаріотній клітинній лінії, яка представлена у SEQ ID NO:16. Приклад 2: Одержання розчинного білка G з використанням вакцин Для одержання білка генетичні конструкції, що містять оптимізовані кодоном послідовності, використовують для створення рекомбінантних поксвірусних векторів (вакцинний вірус, штам WR). Потім одержують рекомбінантний поксвірус, використовуючи стандартні методики, що використовують tk-селекцію і фарбування GUS. Коротко, CV-1 клітини трансфікують, або використовуючи pMC02 sHeV G злиття або pMC02 sNiV G злиття, використовуючи кальційфосфатний трансфекційний набір (Promega). Одержані моношари потім інфікують вакцинним вірусом штамом дикого типу Western Reserve (WR) при множинності зараження (MOI) 0,05 БУЕ/клітина. Через 2 дні клітинний осад збирають як сирі рекомбінантні вірусні маси. TK клітини інфікують, використовуючи сирі рекомбінантні вірусні маси у присутності 25 мкг/мл 5-бром-2'дезоксіуридину (BrdU) (Calbiochem). Через 2 години вірус замінюють, наносячи верхній шар EMEM-10, що містить 1 % агарози (Life Technologies) з низькою температурою плавлення (LMP) і 25 мкг/мл BrdU. Після 2 днів інкубування додають додатково верхній шар EMEM-10, що містить 1 % LMP агарози, 25 мкг/мл BrdU і 0,2 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-індоліл-P-D-глюкуронової кислоти (X-GLUC) (Clontech). Протягом 24-48 годин стають помітні сині бляшки, які збирають і здійснюють ще два раунди очищення бляшок за рахунок подвійної селекції. Потім одержані рекомбінантні вакцинні віруси vKB16 (sHeV G злиття) і vKB22 (sNiV G злиття) ампліфікують і очищають стандартними способами. Коротко, рекомбінантні вакцинні віруси очищають методом очищення бляшок, ампліфікації клітинних культур, сахарозного пелетування в ультрацентрифузі і титруванням в аналізі бляшок. Експресію sHeV G перевіряють у клітинних лізатах і культуральних супернатантах. Приклад 3: Одержання розчинного G білка з використанням 293F клітин Генетичні конструкції, що містять оптимізовані кодоном послідовності, використовують для трансформації 293F клітин (Invitrogen) для одержання стабільної клітинної лінії, яка експресує розчинний глікопротеїн G HeV. CHO-S клітини (Invitrogen) також можна використовувати для трансформації і експресії розчинного глікопротеїну G HeV. Трансформовані клітини висівають у 12 UA 114086 C2 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 162 см колби для культури тканин, що містять 35 мл DMEM-10. Клітинам дають можливість прикріпитися і рости при 37 °C і 5-8 % CО2 протягом декількох днів. Коли клітини досягають конфлюентності, їх розділяють на декілька колб з DMEM-10 зі 150 мкг/мл гігроміцину В (по 30 мл у колбі). Коли клітини досягають 70-80 % конфлюентності, їх двічі промивають 30 мл PBS, потім додають 20 мл 293 SFM II (Invitrogen) і клітини інкубують при 37 °C і 5-8 % CО2 протягом ночі. На наступний день клітини переносять у колби Ерленмейєра, що містять 200 мл SFM II середовища. Клітинам дають рости при 37 °C і 5-8 % CО2 при 125 об./хв. протягом 5-6 днів доти, доки вони не починають гинути. У цей час збирають одержаний супернатант. Середовище з кожної колби Ерленмейєра центрифугують зі швидкістю 3500 об./хв. протягом 30 хвилин. Одержаний супернатант потім переносять у 250 мл центрифугові колби і обертають зі швидкістю 10000 об./хв. протягом однієї години. Одержаний супернатант збирають і додають інгібітор протеази відповідно до рекомендацій виробників разом з Triton X-100 до кінцевої концентрації 0,1 %. Одержаний супернатант потім фільтрують через 0,2 мкм мембранний фільтр з низьким зв'язуванням білка. HeVsG очищають, використовуючи S-білкову агарозну афінну колонку. 20 мл об'єму шару Sпротеїнагарози (Novagen) завантажують у колонку XK 26 (GE Healthcare). Колонку промивають 10× об'ємами шару зв'язувального/промивального буфера (0,15 M NaCl, 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5 і 0,1 % Triton X-100). Одержаний супернатант HeV sG вводять у колонку, підтримуючи швидкість потоку 3 мл/хв. Колонку промивають 10× об'ємами шару (200 мл) зв'язувального/промивального буфера I, потім 6× об'ємами шару (120 мл) промивального буфера, 1× промивального буфера (0,15 M NaCl, і 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5). Потім насос вимикають і промивальний буфер зливають доти, доки він не досягає поверхні кульок, і тоді додають 30 мл елюювального буфера (0,2 M лимонна кислота, pH 2). Збирають перші 10 мл прохідного потоку (це все ще повинен бути промивальний буфер) і потім елюювальний буфер інкубують з кульками протягом 10 хвилин. Потім 15 мл елюату збирають у 50 мл стерильну конічну центрифугову ампулу, що містить 25 мл нейтралізуючого буфера (1M Tris, pH 8). pH доводять до нейтрального значення і елюювання та інкубування повторюють тричі. Весь нейтралізуючий елюат об'єднують і концентрують до близько 4 мл. Зібрані HeV sG (4 мл) очищають, використовуючи 0,2 мкм мембранний фільтр з низьким зв'язуванням білка (Acrodisc 13 мМ шприцьовий фільтр з 0,2 мкм HT Tuffryn мембраною). Гельфільтрацію можна використовувати для подальшого очищення HeV sG. Після якісного контрольного аналізу і підтвердження чистоти олігомерного статусу, аліквоти HeV sG зібраних фракцій тетрамер+димер, димеру і мономеру зберігають при -80 °C. Приклад 4: Одержання вакцинного препарату Схема одержання препарату ISC представлена далі на фіг. 3 і описана нижче. Стадія 1: Розчин 90 г/л деканоїл-н-метилглюкаміду (Mega-10 детергент) одержують у воді для ін'єкцій (WFI). Одержаний розчин нагрівають для забезпечення повного розчинення Mega10, потім його використовують або негайно на стадії 2, або стерилізують на фільтрі. Стадія 2: Одержують розчин, що містить 25 г/л холестерину і 25 г/л дипальмітоїлфосфатидилхоліну (DPPC), розчиняючи вказані компоненти у початковому розчині Mega-10 детергенту. Одержаний розчин нагрівають до розчинення всіх компонентів, потім або використовують негайно на стадії 3, або стерилізують на фільтрі. Стадія 3: Одержують буферований ізотонічний сольовий розчин, 10 мМ фосфатний буфер, pH 6,2±1 (BIS) з WFI і використовують стерилізуючу фільтрацію, якщо не використовують негайно. Стадія 4: Quil А одержують у BIS до кінцевої концентрації 100 г/л і використовують стерилізуючу фільтрацію, якщо не використовують негайно. Стадія 5: ISC одержують у реакторі з регульованою температурою при перемішуванні (2237 °C) шляхом послідовного додавання попередньо нагрітих BIS, холестерин/DPPC у розчині Mega-10 (160 мл/л), і Quil розчину (200 мл/л). Реакційну суміш доводять до потрібного об'єму, додаючи BIS. Стадія 6: Всю композицію доводять до стану рівноваги при потрібній температурі (цільова 27 °C з прийнятним робочим інтервалом 22-37 °C), потім інкубують протягом 15 хвилин при перемішуванні для полегшення утворення ISC. Розчин ISC або обробляють додатково на стадії 7, або використовують стерилізуючу фільтрацію для проміжного зберігання. Стадія 7: ISC реакційну суміш промивають, використовуючи діаліз (мембрана: Hydrosart 30 кДа (Sartorius AG Goettingen)) мінімум у 20 об'ємах обмінів проти BIS при контролі температури (цільова 27 °C з прийнятним робочим інтервалом 22-37 °C) для видалення компонентів, що не війшли в утворені комплекси. 13 UA 114086 C2 5 10 15 20 25 Стадія 8: Діалізовані ISC концентрують приблизно у два рази шляхом ультрафільтрації, використовуючи ту саму мембрану, яку використовували для діалізу. У фільтраційну систему додають BIS для відновлення початкового об'єму ISC. Стадія 9: ISC переносять у стерильні контейнери для зберігання, використовуючи стерилізуючу фільтрацію через 0,22 мкм целюлозоацетатний фільтр. Стадія 10: ISC ад'ювант зберігають при 2-8 °C до реалізації для застосування у вакцинних композиціях. Імуностимулюючу композицію (250 мкг/мл) потім комбінують з відповідними кількостями розчинного глікопротеїну G HeV (наприклад, 5, 50, 100 мкг/мл) і доводять до об'єму, використовуючи BIS. Приклад 5: Перший клінічний експеримент на конях Вакцина 1, що тестується: Розчинний рекомбінантний глікопротеїн вірусу Hendra (sG) у кількості 100 мкг/доза, доповнений ад'ювантом 250 мкг імуностимулюючого комплексу; об'єм доводять до 1 мл/доза при використанні сольового розчину. Вакцина 2, що тестується: Розчинний рекомбінантний глікопротеїн вірусу Hendra (sG) у кількості 50 мкг/доза, доповнений ад'ювантом 250 мкг імуностимулюючого комплексу; об'єм доводять до 1 мл/доза при використанні сольового розчину. Вакцина 3, що тестується: Розчинний рекомбінантний глікопротеїн вірусу Hendra (sG) у кількості 5 мкг/доза, доповнений ад'ювантом 250 мкг імуностимулюючого комплексу; об'єм доводять до 1 мл/доза при використанні сольового розчину. Серологічні дані і результати захисту від зараження коней збирають для двох груп коней, яким вводять вакцини, що містять більш високі рівні антигену (50 мкг/доза і 100 мкг/доза). Серологія: Кожного з двох коней імунізують двома дозами вакцини (100 мкг sG з ISC) з проміжком у 21 день. Серологічні дослідження зразків, одержаних після примування і до зараження, підтверджують індуковану вакциною серологічну конверсію у HeV (таблиця 1). До зараження рівні нейтралізуючих вірус антитіл були порівнянні з рівнями, які, як було виявлено, є захисними для кішок, підданих впливу в іншому випадку летальної дози близько спорідненого вірусу Nipah. У коня, якому вводили тільки ад'ювант (негативний контроль), не вироблялися антитіла до HeV до зараження вірусом. 30 Таблиця 1 Кінь No. V1 V2 V3 (Контроль) 35 40 45 50 Базова лінія 2560 14 28 * * >2560 1074 905 537 453 537 >2560 757 >2560 537 >2560 905 1810 453 >2560 1514 >2560 757 -42 NiV