Біотехнологічний хондроїтинсульфат, сульфатований в положенні 4 або 6 на його полісахаридному ланцюзі, і спосіб його отримання

Реферат: Винахід стосується способу одержання хондроїтинсульфату із середньою молекулярною масою (Mw) 10-30 кДа за допомогою хімічного сульфатування, виходячи з основного ланцюга несульфатованого хондроїтину, одержаного, в свою чергу, за допомогою кислотного гідролізу капсульного полісахариду К4, одержаного прямо з Е. соlі штаму О5:К4:Н4 або безпосередньо зробленого з генетично модифікованого штаму Е. соlі. UA 114085 C2 (12) UA 114085 C2 UA 114085 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується способу отримання хондроітинсульфату за допомогою хімічного сульфатування, виходячи з несульфатованого основного ланцюга хондроітину. Спосіб згідно з даним винаходом дає можливість здійснювати одночасне сульфатування одного і того ж полісахаридного ланцюга в положенні 4 або в положенні 6 залишку N-ацетил-D-галактозаміну. Хондроітинсульфат, що отримується таким чином, має такий же характер сульфатування, як і той, що спостерігається в натуральному хондроітинсульфаті (на відміну від його препаратів, що синтезуються способами, описаними до цього часу). Даний винахід також стосується хондроітинсульфату, який має середню молекулярну масу, визначену за допомогою SEC (Size Exclusion Chromatography, ексклюзійна хроматографія з фракціонуванням по розмірах молекул, гель-фільтрація) (Mw), яка дорівнює 4-9 кДа, і розподіл моносульфатованих груп в діапазоні від 90 % 4-сульфату і 10 % 6-сульфату до 10 % 4-сульфату і 90 % 6-сульфату. Передумови створення винаходу Хондроітинсульфат (CS) являє собою складний природний полісахарид, що належить до класу глікозаміногліканів (GAG), що складається з дисахаридних послідовностей, утворених залишками глюкуронової кислоти (GlcA) і N-ацетил-D-галактозаміну (GalNAc), сульфатованих в різних положеннях і зв'язаних бета-1-3-зв'язками. CS присутній в тканинах тварин зі структурними і фізіологічними функціями. У залежності від його походження, CS переважно складається із змінних процентних часток двох типів дисахаридної одиниці, моносульфатованої в положенні 4 або в положенні 6 залишку GalNAc (дисахариди А і С, відповідно). Однак в полісахаридних ланцюгах можуть бути присутніми різні процентні частки дисахаридів, які містять різне число сульфатних груп, що знаходяться в різних положеннях. Крім того, основний ланцюг CS містить і несульфатований дисахарид (як правило, в невеликих кількостях). Дисульфатовані дисахариди, що мають дві сульфатні групи, пов'язані через атом кисню в різних положеннях, таких як положення 2 в GlcA і положення 6 в GalNAc (дисахарид D), положення 2 в GlcA і положення 4 в GalNac, або положення 4 і 6 в GalNAc (дисахарид Е), можуть бути присутніми в основному ланцюгу CS в різних процентних частках, в залежності від конкретних тварин-джерел (Volpi N. J Pharm Pharmacol 61, 1271, 2009; Volpi N. J Pharm Sci 96, 3168, 2007; Volpi N. Curr Pharm Des 12, 639, 2006). Повторювана дисахаридна одиниця знайдена в CS, має наступну хімічну формулу: в якій R2, R4 і R6 незалежно являють собою Н або SO3-. Негативні заряди карбоксилатних і сульфатних груп в повторюваній одиниці нейтралізуються іонами натрію. Розшифровка абревіатур, що найчастіше використовуються для позначення різним чином сульфатованих дисахаридів, наведена нижче: Ди-0S (R2=H; R4=H; R6=H) Ди-6S (C) (R2=H; R4=H; R6=SO3-) Ди-4S (A) (R2=H; R4=SO3-; R6=H) Ди-4,6диS (E) (R2=H; R4=SO3-; R6=SO3-) Ди-2,6диS (D) (R2=SO3-; R4=H; R6=SO3-) Ди-2,4диS (B) (R2=SO3-; R4=SO3-; R6=H) Ди-2,4,6триS (R2=SO3-; R4=SO3-; R6=SO3-) Зразки CS, що походять з різних тварин-джерел, також характеризуються різною молекулярною масою і щільністю зарядів, причому останній параметр прямо корелює з конкретними сульфатованими групами. Таблиця 1 показує головні дисахариди, знайдені в натуральному CS, екстрагованому з хряща і інших тканин тварин різних видів: 1 UA 114085 C2 Таблиця 1 CS великої рогатої худоби Mn (кДа) Mw (кДа) Коефіцієнт полідисперсності Ди-OS Ди-6S Ди-4S Ди-2,6диS Ди-4,6диS Ди-2,4диS Щільність заряду Відношення 4S/6S 5 10 15 20 25 30 35 40 CS свині Курячий CS 12-17 20-26 9-14 14-20 8-13 16-21 25-40 50-70 27-34 50-70 60-80 80-120 1,8-2,2 1,4-1,8 1,6-2,0 1,0-2,0 1,2-2,5 0,8-1,3 6 33 61 ND ND ND 6 14 80 ND ND ND 8 20 72 ND ND ND 3 44 32 18 2 1 3 39 43 13 1 1 13 15 50 0 22 0 0,90-0,96 1,50-2,00 0,92-0,96 4,50-7,00 CS акули CS ската CS кальмара 0,90-0,94 1,15-1,25 1,08-1,20 1,00-1,20 3,00-4,00 0,45-0,90 1,00-1,40 2,50-4,00 Таблиця 1: Mn - середньочисленна молекулярна маса; Mw - середньомасова молекулярна маса; коефіцієнт полідисперсності = Mw/Mn; щільність заряду являє собою число сульфатних груп, що доводяться на дисахаридну одиницю; ND - не визначено. Як показано в таблиці 1, CS, отриманий з наземних тварин, має схожі параметри молекулярної маси (Mn і Mw), які, однак, відрізняються від відповідних параметрів CS риб, який має більш високі значення молекулярної маси. Зразки CS наземних тварин, крім того, характеризуються значеннями щільності заряду (CD, charge density) менше 1,0, тоді як зразки CS морських тварин завжди мають значення CD, що перевищують 1,0. Причиною цього є різний розподіл сульфатованих дисахаридів. Як правило, в CS наземних тваринах знаходять слідові кількості дисульфатованих дисахаридів; полісульфатовані дисахариди (три- і тетрасульфати) в натуральному CS не спостерігаються. Відсутність три- і тетрасульфатованих дисахаридів можна легко виявити за допомогою аналізу, що проводиться після перетравлення полісахариду хондроітиназою АВС - літичним ферментом, специфічним до моносульфатованих дисахаридів (Ди-4S і Ди-6S) і до несульфатованих дисахаридів (Ди-0S), який здатний переварювати дисульфатовані дисахариди, але не може гідролізувати полісахаридний ланцюг з полісульфатованими дисахаридами. Аналіз натурального CS, перетравленого хондроітиназою АВС, що виконується по методиці FACE (Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis, електрофорез вуглеводів із застосуванням флуорофору), не детектує електрофоретичні фракції, характерні для частково неперетравлених олігосахаридів, які знаходять в синтетичному або напівсинтетичному CS, отриманому в попередніх роботах. Крім того, добре відомо, що внаслідок процесів біосинтезу всі натуральні форми CS завжди показують одночасну присутність моносульфатованих дисахаридів в положенні 4 або 6 залишку GalNAc на одних і тих самих полісахаридних ланцюгах (D'Arcy SM et al., Carbohydr Res. 1994 Mar 4, 255: 41-59; Hardingham TE et al., Carbohydr Res. 1994 Mar 4, 255: 241-54; Cheng F, et al., Glycobiology 1992 Dec, 2 (6): 553-61; Chai W et al., Anal Biochem. 1996 May 15, 237 (1): 88-102; Zaia J et al., Anal Chem. 2001 Dec 15, 73 (24): 6030-9; Desaire H et al., Anal Chem. 2001 Aug 1, 73 (15): 3513-20). Повідомляли про різну активність CS в залежності від його молекулярної структури (Kimata K et al., Mol Cell Biochem 1, 211, 1963; Volpi N. Biomaterials 23, 3015, 2002; Volpi N, Tarugi P. Biochimie 81, 955, 1999; Volpi N. Biomaterials 20, 1359, 1999; Suzuki S et al., J Biol Chem 243, 7, 1968). CS має протизапальну активність, і на основі клінічних даних і відповідного мета-аналізу багатьох клінічних випробувань в цей час в Європі його рекомендують застосовувати при лікуванні остеоартриту (ОА) як засіб SYSADOA (Symptomatic Slow-Acting Drug for OsteoArthritis симптоматичного повільно діючого лікарського засобу для остеоартриту), зокрема, для лікування остеоартриту колінного суглоба (Jordan KM et al., Ann Rheum Dis 62, 1145, 2003), тазостегнового суглоба (Jordan KM et al. Ann Rheum Dis 62, 1145, 2003) і суглобів кисті (Zhang W et al., Ann Rheum Dis 66, 377, 2007). Крім того, в Європі і в США CS широко застосовують як біологічно активну харчову добавка (БАД, нутрицевтик) - індивідуально або в комбінації з 2 UA 114085 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 іншими інгредієнтами (McAlindon TE et al., JAMA 283, 1469, 2000; Volpi N et al., Food Anal Meth 1, 195, 2008; Volpi N et al., Separation Sc 1, 22, 2009). Комерційний CS отримують за допомогою екстракції з тканин тварин, таких як тканини великої рогатої худоби і свиней (Fuentes EP et al., Acta Farm Bonaerense 17, 135, 1998), тканини птахів (Luo XM et al., Poult Sci 81, 1086-1089, 2002) і хрящів риб (Sugahara K et al., Eur J Biochem 239, 871, 1996. Lignot В et al., J Biotechnol 103, 281, 2003). Тваринне походження комерційного CS створює проблеми безпеки, зумовлені переносимими збудниками інфекцій, що викликають такі захворювання, як губчаста енцефалопатія великої рогатої худоби (BSE, bovine spongiform encephalopathy), і обмежує можливі джерела задоволення попиту, зростаючого у всьому світі. Ці чинники виявилися стимулюючими для досліджень альтернативних способів виробництва CS. Робилися інтенсивні спроби пошуку біотехнологічного способу виробництва CS з використанням мікроорганізму як джерела попередника полісахариду, що має структуру, частково подібну структурі CS, і з проведенням хімічного сульфатування для виробництва CS, схожого з натуральним. Одним з прикладів цієї стратегії є виробництво біотехнологічного CS з капсульного полісахариду К4 бактерій Е. coli O5:K4:H4, як описано в EP 1304338 B1. Вказаний патент розкриває спосіб, згідно з яким полісахарид К4, вироблений в рідких культурах, екстрагують і очищають, а потім повторно розчиняють і піддають кислотному гідролізу для видалення залишків фруктози, пов'язаних із залишками GlcA в цьому полімері. Полімер, позбавлений фруктози, ідентичний несульфатованому основному ланцюгу CS (CH), потім сульфатують в положенні 4 або в положенні 6 залишку GalNAc двома різними способами хімічного синтезу. Вказаний патент також розкриває третій спосіб, за яким отримують CS, дисульфатований в обох положеннях (4 і 6). CS, описаний в цьому документі, містить, щонайменше, 70 % сульфатованих полісахаридів, що складаються із залишків GalNAc, моно- і/або дисульфатованих в положеннях 4 і 6 (положення 2' залишку GlcA є несульфатованим), і має молекулярну масу (Mw), що дорівнює 6-25 кДа, і щільність заряду (CD), що дорівнює 0,7-2,0. В EP 1304338 B1 автори розкривають і заявляють, в залежностівід стратегії синтезу, що застосовується, наступні можливості: a) можливість синтезування CS 4S за допомогою виборчого захисту положення 6 у всіх присутніх залишках N-ацетилгалактозаміну (GalNAc) і, таким чином, отримання полімеру, виборче сульфатованого тільки в положенні 4 всіх залишків N-ацетилгалактозаміну (GalNAc). b) можливість отримання полімеру, в якому, аналогічним чином, гідроксильні групи в положенні 6 всіх залишків GalNAc є сульфатованими, причому відповідним чином захищають гідроксильні залишки, присутні в положенні 4. У способі, описаному в EP 1304338 B1, ніколи не відбувається сульфатування одного і того ж ланцюга одночасно в положеннях 4 або 6 - на відміну від ситуації з натуральним CS. Недавня публікація (Bedini Е et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2011 May 18) описує спосіб, за яким вироблений полісахарид К4 є сульфатованим в положенні 4 і/або в положенні 6 залишку GalNAc в одному і тому ж ланцюгу. Однак біотехнологічний CS, описаний Bedini et al., має молекулярну масу, схожу з молекулярною масою натурального CS (тобто приблизно 17 кДа), що приводить до низької біодоступності, типової для натуральних екстрагованих продуктів. Bedini et al. не повідомляють про жодні фармакологічні характеристики отриманого ними продукту. ПЕРЕЛІК ФІГУР Фігура 1 стосується натурального хондроітинсульфату великої рогатої худоби, обробленому хондроітиназою С. Утворені різноманітні олігосахариди різної довжини, що демонструють присутність сульфатних груп в положенні 4 або 6 залишку GalNAc на одному і тому ж полісахаридному ланцюгу. Хроматограму отримували за допомогою градієнтного розділення на колонці з сильним аніонобомінником (SAX-HPLC) і з УФ-детектуванням при 232 нм. Градієнт отримували, підвищуючи концентрацію NaCl від 50 мМ до 1,2 М в інтервалі від 0 до 60 хвилин. Фігура 2 стосується натурального свиного хондроітинсульфату, обробленому хондроітиназою С. Утворені різноманітні олігосахариди різної довжини, що демонструють присутність сульфатних груп в положенні 4 або 6 залишку GalNAc на одному і тому ж полісахаридному ланцюгу. Хроматограму отримували за допомогою градієнтного розділення на колонці з сильним аніонобомінником (SAX-HPLC) і з УФ-детектуванням при 232 нм. Фігура 3 стосується біотехнологічного хондроітинсульфату згідно з даним винаходом, обробленим хондроітиназою С. Для цього полісахариду також утворені різноманітні 3 UA 114085 C2 5 10 15 олігосахариди різної довжини, що демонструють присутність сульфатних груп в положенні 4 або 6 залишку GalNAc на одному і тому ж полісахаридному ланцюгу. Хроматограму отримували за допомогою градієнтного розділення на колонці з сильним аніонобомінником (SAX-HPLC) і з УФ-детектуванням при 232 нм. ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід описує спосіб отримання CS за допомогою хімічного сульфатування, виходячи з несульфатованого основного ланцюга хондроітину (CH), причому цей СН отримують кислотним гідролізом натурального мікробного полісахариду (К4) або проводять прямо з генетично модифікованих бактерій Е. coli, таких як Е. coli штаму DSM23644, описаних в заявках на патенти MI2010A001300 і MI2010A001264. Бактерійний штам, описаний в них, несе мутацію, яка викликає інактивацію гена KfoE, що забезпечує фруктозилування К4. Згідно з аналізами, проведеними по методиках, описаних в Європейській фармакопеї, CS, отриманий способом згідно з даним винаходом, демонструє характеристики натурального CS з титром, що перевищує 95 %. CS, отриманий способом згідно з даним винаходом, має середню молекулярну масу (Mw), виміряну за допомогою SEC, що дорівнює 10-30 кДа (переважно, 20-30 кДа), і демонструє розподіл моносульфатованих груп в діапазоні від 90 % 4-сульфату і 10 % 6-сульфату до 10 % 4сульфату і 90 % 6-сульфату (таблиця 2). Таблиця 2 Характеристики CS, описаного в даному винаході Mw (кДа) Перетравлюваність хондроітиназою ABC Ди-OS Ди-6S Ди-4S Ди-2,6диS Ди-4,6диS Ди-2,4диS Ди-триS Ди-тетраS Титр (по масі) Щільність заряду Відношення 4S/6S 10-30 >95 %