Ђађ,

1. Фармацевтическая композиция, в случае потенциирования торможения предназначенная для торможения'Зависипроизводства цитокина она в качестве акмой от интерлейкина-2 пролиферации опутивного вещества содержит интерлейкинхолевых клеток, увеличения содержания 4 и интерлейкин-10. у-интерферона, лечения воспалительных заболеваний кишечника, потенцирования 5. Фармацевтическая композиция по торможения производства цитокина и огп. 1, о т л и ч а ю щ а я с я тем, что раничения или торможения аллергичесв случае ограничения или торможения алкой реакции замедленного типа, содерлергической реакции замедленного типа жащая по меньшей мере один фармацевона в качестве активного вещества сотически приемлемый носитель и активное держит интерлейкин-10 или комбинацию вещество, о т л и ч а ю щ а я с я тем, интерлейкина-4 и интерлейкина-10. что в качестве активного вещества она содержит вещество, выбранное из груп6. Фармацевтическая композиция по пы, включающей интерлейкин-4, интерлейлюбому из пп. 1-5, о т л и ч а ю щ а я кин-10, комбинацию интерлейкина-4 и инс я тем, что интерлейкин-4 и интерлейтерлейкина-10 и антитела против интеркин-10 получены из человеческого источника. Изобретение относится к области подкрепления иммунной системы млеко питающих, включая человека, в частности к фармацевтической композиции, пред* с О 26644 назначенной для торможения зависимой от интерлейкина-2 пролиферации опухолевых клеток, увеличения содержания уинтерферона, лечения воспалительных заболеваний кишечника, потенцирования тор- 5 можения производства цитокина и ограничения или торможения аллергической реакции замедленного типа. Предлагаемая фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один 10 фармацевтически приемлемый носитель и активное вещество из группы, включающей • интерлейкин-4, интерлейкин-10, комбинацию интерлейкнна-4 и интерлейкина-10 и анти- • тела против интерлейкина-4 и интерлейки- 15 на-10, в эффективном количестве. Для торможения зависимой от интерлейкина-2 пролиферации опухолевых клеток и лечения воспалительных заболеваний кишечника используют композицию, в ка- 20 честве активного вещества содержащую интерлейкин-10 в эффективном количестве. Для увеличения содержания у-интерферона используют композицию, в качестве активного вещества содержащую анти- 25 тела против интерлейкина-4 и интерлейкина-10 в эффективном количестве. Для потенцирования торможения производства цитокина используют композицию, в качестве активного вещества 30 содержащую интерлейкин-4 и интерлейкин-10 в эффективном количестве. . Для ограничения или торможения аллергической реакции замедленного типа используют композицию, в качестве актив- 35 ного вещества содержащую интерлейкин10 или комбинацию интерлейкина-4 и интерлейкина-10 в эффективном количестве. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может иметься в виде 40 любого известного препарата, пригодного для любого способа дачи. Все указанные последовательности нуклеиновых кислот определяют с 5'-конца до З'-конца, т. е., слева направо. В 45 указанных последовательностях для нуклеотидных оснований использованы стандартные сокращения, каждое состоящее из одной буквы. Под "интерлейкином-4" в рамках нас- 50 тоящего изобретений подразумевается протеин, а) имеющий аминокислотную последовательность, в основном идентичную с последовательностью зрелого человеческого интерлейкина-4, приведенного в 55 фиг. 1С международной патентной заявки, опубликованной под № WO 87/02990, и б) обладающий биологической активностью природного интерлейкина-4. Выражение "в основном идентичная амино кислотная последовательность" следует понимать в том смысле, что последовательность другого интерлейкина-4 или идентична с приведенной в указанной заявке последовательностью, или отличается от нее лишь одним или.больше изменениями аминокислот (делецией, добавлением, заменой), не в значительной степени влияющими на биологическую активность. Интерлейкин-4 можно приобрести у разных фирм, например, Genzyme Corporation, г. Cambridge, Массачусетс, США, или его можно получать известными методами, или с использованием естественных источников, или путем рекомбинации ДНК (см., например, Sheehan и др., J.Immunol. 142, стр. 884, 1989 г., и Starnes и др. J.fmmunol. 145, стр. 4185, 1990 г.). Альтернативно для обнаружения кодирующей интерлейкин-^ ДНК в геномных библиотеках или библиотеках кДНК можно использовать смешанные пробы олигонуклеотидов на основе известных нуклеотидных последовательностей интерлейкина-4. Обнаруженную таким образом ДНК можно вырезать из библиотекипутем расщепления эндонуклеазной рестрикции, или ее можно получать с использованием пригодных праимеров и путем метода цепной реакции с помощью полимеразы {см. Saiki и др., Science, 239, стр. 487, 1988 г.), чередовать и экспримировать в эукариотной экспрессионной системе или, в случае необходимости после делеции интрона известным методом, в прокариотной или эвкариотной экспрессионной системе. Вместо использования олигонуклеотидных проб или осуществления цепной реакции с помощью полимеразы можно также экранировать библиотеки и кДКН, и геномной ДНК, известными методами экспрессионного клонирования. Полученный таким образом интерлейкин-4 можно обнаруживать известным методом, например, иммунохимическим способом или путем биоанализа. В качестве интерлейкина-4 предпочтительно используют человеческий рекомбинантный интерлейкин-4. Можно использовать или гликозилированный интерлейкин-4, например, рекомбинантный интерлейкин-4, полученный в эвкариотной экспрессионной системе, или негликозилированный интерлейкин-4, полученный, например, путем химического синтеза или в бактериальной экспрессионной системе. Под "интерлейкином-Ю" подразумевается протеин, а) имеющий аминокислотную последовательность, в основном 26644 идентичную с последовательностью зрелого интерлейкина-10 (то есть, интерлейкина-10, не содержащего секреторной лидерной последовательности), приведенного в международной патентной заявке, опубликованной под № WO 91/00349, и б) обладающий биологической активностью природного интерлейкина-10. Можно использовать или гликозилированный интерлейкин-10, полученный, например, в звкариотных клетках как, например, клетках яичника китайского хомячка, или негликозилированный интерлейкин-10, полученный, например, известным методом путем химического синтеза или в E.coli. Охватываются также мутеины и другие аналоги, включая протеин BCRF1 (вирусный интерлейкин-10 из вируса Eppstein Barr, далее: вирусный интерлейкин-10), обладающий биологической активностью интерлейкина10. В международной патентной заявке, опубликованной под № WO 91/00349, описан ряд проведенных in vitro опытов, пригодных для определения активности интерлейкина-10. В рамках настоящей заявки описан ряд предпочтительных форм интерлейкина-10. Интерлейкин-10 можно получать из разных источников. Например, его можно выделять из культуры активированных Тклеток, способных к выделению протеина. Кроме того, интерлейкин-10 или его активные фрагменты можно получать известным методом путем химического синтеза (см. например, Merrifield, Science 233, стр. 341-347, 1986 г., и Atherton и др., Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, 1989 г., издательство I.R.L Press, f. Oxford). Рекомбинантный человеческий интерлейкин-10 можно также приобрести на рынке, например, у фирмы PeproTech, Inc., г. Rocky Hill, Нью-Джерси, США. Альтернативно рекомбинантный интер. лейкин-10 можно получать описанным выше для интерлейкина-4 способом с использованием известной информации о лоследовательностях человеческого или вирусного интерлейкина-10. Методы получения рекомбинантного человеческого интерлейкина-1, описаны, например, в международной патентной заявке, опубликованной под № WO 91/00349, Клоны, содержащие кодирующие человеческий интерлейкин-10 последовательности, были депонированы в Американской коллекции культур, г. Rockville, Мэриленд, США, 20-го декабря 1989 г., под №№ 68191 и 68192. Клонирование и экспрессия вирусного интерлейкина-10 (протеина BCRFI) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 ^ 50 55 из вируса Эпштейна и Барра описаны в источнике Moore и др., Science, 248, стр.1230, 1990 г. Для лечения человека предпочтительно используют человеческий интерлейкин10, хотя можно использовать также вирусный интерлейкин-10 или интерлейкин10, полученный из других млекопитающих. Наиболее предпочтительным является использование рекомбинантного человеческого интерлейкина-10. Интерлейкин-4 и интерлейкин-10 любого происхождения можно очищать известными методами, например, путем осаждения в виде кислоты или соли, ионообменной хроматографии, хроматографии на хелатном соединении металлов, гель-фильтрации, высокопроизводительной жидкостной хроматографии протеинов, жидкостной хроматографии высокого разрешения, гелевого препаративного дискэлектрофореза или другого вида электрофореза, изоэлектрического фокусирования, фракционирования в органическом растворителе при низких температурах, противоточного распределения и иммуноаффинной хроматографии. Антитела против интерлейкина-4 и интерлейкина-10 можно также получать путем известных методов. В данном контексте понятие "антитело" охватывает и поликлональные, и моноклональные антитела. Оно охватывает и целые иммуноглобулины, и их связывающие антигены фрагменты. Поликлональные антитела можно получать путем иммунизации животного-хозяина, например, зайца, крысы, козы, овца, мыши и т. п. с использованием интерлейкина-4 или интерлейкина-10. Предпочтительно для повышения титра антител после первичной инъекции дают одну или больше повторных инъекций. После этого у животного берут кровь и получают сыворотку, которую экранируют известным методом, например путем твердофазного иммуноферментного анализа, в качестве антигена используя полипептид. Фракции иммуноглобулина можно получать известным способом. Иммуногенность интерлейкина-4 или интерлейкина-10 повышается при их комбинации с одним из многочисленных известных стимуляторов, и/или путем превращения в большую форму перед иммунизацией, например, путем известной поперечной сшивки. Сыворотку, полученную из иммунизованных таким образом животных, можно использовать непосредственно без даль 15 нейшей пере цию иммуної из сыворотк например, пл ной хроматог цифических і на G адсорб* ванного про Монокло лучать изве( мер, Kohler 1975 г., или 1976 г.). В ос ТИЧЄСКИХ КЛ€ животное иг способом. 3 деляют из им СЛИЯНИЯ С Ml Соматич< производству ки, пригоднь КЛеТОЧНОЙ Лк клетки можн< го узла, селе; ви подвержє вию антиген зуют клетки но, отчасти клетками до шой процент ломными ли было бы во: человека, мь других живот холей спецу клеточных ли СЛИЯНИЯ С П( но, наприме Immunol. 6, др., Nature 5 др., J. Virol, получения rv тела клеток кого узла и включают пр ких клеток с ношении 10: жет колебат 1:1), в прису го или элею ВуЮЩЄГО СЛИ5 собы слияни1 Milstein (см. Gefter и др. 231, 1977 г.) 220, 1982 г. данных иста вующихслияі рус Сендай і 26644 но-активное вещество. Таким образом компоненты находятся под повышенном давлении до их выпуска через сопло. Для продления периода полураспада сыворотки интерлейкин-10 можно заключать в капсулах, вводить в полость липозом, приготовлять в виде коллоида, или можно использовать другие известные методы, продлевающие долговечность пептидов. Так, например, в некоторых случаях интерлейкин-10 можно заключать в липозомах. Известны разные методы получения липозом (см., например, Szoka и др., Ann. Rev. Biophys. Bloeng. 9, стр. 467, 1980 г., или патенты США №№ 4235871, 4501728 и 4837028). После получения ли позом их размер можно варьировать желаемым образом с получением липозом со сравнительно узким гранулометрическим составом. Даже при применении самого эффективного метода заключения в капсулы первичная суспензия липозом может содержать 5 0 % или больше активного вещества в свободном (незаключенном в капсулы) виде. Известны разные методы удаления незаключенного активного вещества из суспензии липозом. Например, согласно одному методу имеющиеся в суспензии липозомы переводят в гранулят путем высокоскоростного центрифугирования, после чего свободное активное вещество и очень мелкие липозомы содержатся в сверхосадочной жидкости. Согласно другому методу суспензию сгущают путем ультрафильтрации с последующим повторным суспендированием концентрированных липозом в замененной среде. Другая альіернатива заключается в гель-фильтрации, причем большие липозомы отделяются от растворенных молекул. После описанной переработки липозомсодержащую суспензию приводят до желаемой концентрации, пригодной для внутривенной дачи. Если липозомы имеются в концентрированном виде в результате центрифугиривания или ультрафильтрации, то для получения пригодного для внутривенной дачи препарата липозомы можно повторно суспендировать в определенном количестве инъекционного раствора, а если объем суспензии большой, то ее можно сгущать. После этого полученную суспензию можно вышеописанным методом стерилизировать путем фильтрации. Липозомы, содержащие пептиды согласно изобретению, можно дать парентерально вышеописанным способом. Повышение производства у-интерферона. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 16 Фармацевтические композиции, предназначенные для увеличения содержания у -интерферона, особенно полезны в том случае, если пациент болен инфекционной болезнью, приводящей к торможению производства у -интерферона иммунной системой пациента вследствие производства интерлейкина-4 и интерлейкина10. В качестве таких болезней можно называть, например, индийский висцеральный лейшманиоз, лепроматозную лепру и мукозы, причем к последним относятся, например, кандидамикоз, паракокцидиоидомикоз, бластомикоз и криптоспироидиум. Определенные инфекционные организмы или непосредственно, или косвенно извлекают пользу при низком содержанииу -интерферона. Такие инфекции часто являются хроническими, и их типическим признаком явпяется неравновесие реакции Т-клеток-помощников 2 по сравнению с Т-клетками-помсщниками 1 на инфекционный агент. В результате данного ^равновесия производство у-интерферона клетками Тп1 тормозится вследствие производства интерлейкина-4 и интерлейкина-10 Т-клетками-помощниками 2. Антитела, получаемые в рамках изобретения, предпочтительно являются аутологичными для пациента. Полезны также антитела, представляющие собой не собственные антитела, но получаемые из клеток того же вида. Можно также использовать антитела, полученные из другого вида, но при этом рекомендуются применение методов, снижающих вероятность отрицательной иммунной реакции. Иммунную реакцию человека можно сократить до минимума, например, при использовании гуманизованных антител крысы. Предпочтительно антитела имеют константы связывания, приближенные к сродству интерлейкина-4 и интерлейкина-10 к их естественным рецепторам, или превышающие данное сродство. Предпочтительными являются антитела, константа связывания до 100 раз превышает константу связывания данных цитокинов к их соответствующим рецепторам Сравнение связывания можно осуществлять путем известных методов равновесия. Основной подход описан в главе 25 в Immunochemistryi том 1, под ред. D.M. Weir, 4-е издание, 1986 г., издательство Blackwell Scientific РиЫ., пункты 25.1-25.30. Альтернативно можно исследовать молярный избыток антитела, нейтрализующий определенное количество интерлейкина-4 или интерлейкина-10 в стандартном биологическом опы 49 26644 50 ная популяция более чем на 9 6 % ее то заражения L. major, которые перерабажала C D 4 \ тывали с получением отдельных клеточЛишенные Т-клеток спленоциты » ных суспензий в фосфатсодержащем сочали из селезенок нормальных дон» левом буфере, содержащем 0,25% альбумина сыворотки крупного рогатого скота. 5 из которых выделяли клетки, окрашк щие антитела против CD4 и CD8, г Для очистки Т-клеток СО4 + все приемы " негативной селекции с использование! осуществляли при температуре 4°С. Пририков Dynabeads овцы против крысь мерно 4 х 10 е клеток лимфатических узвыше описано для клеток лимфатич лов в течение 30 минут маркировали с 10 узлов. С помощью клеточного сорт» использованием 2 мл раствора фосфатвозбуждением флуоресценции устане содержащего солевого буфера и альбучто полученные препараты были на мина сыворотки крупного рогатого скота, негативными относительно CD4 и С дополнительно содержащего по 12 мкг/ Неразделенные клетки лимфатич /мл антител против В220, М а с - 1 , CD8 и d 15 узлов или очищенные Т-клетки СС класса Н 1-A . Маркированную антителавышеуказанных количествах в кач ми клеточную суспензию затем промывадвойных культур подали в круглодс ли в смеси фосфатсодержащего солево-, снабженные 96 углублениями, плас го буфера и альбумина сыворотки крупемкостью 250 мкл в среду с RPMI, с ного рогатого скота, после чего инкубировали в течение 30 минут на вращаю- 20 жащей 5% ТЭС, в случае очищень клеток CD4+ вместе с 5 х 10 5 нор щемся колесе вместе с Dynabeads овцой, ных спленоцитов, лишенных клеток, снабженными оболочкой против крысы сутствии или отсутствии аніигена г (Dynabeads можно приобрести у фирмы L. major. Под cRPMI подразумеваете Robbins Scientific, г. Mountain View, Кали25 пая культурная среда, содержащая форния, США), используемыми в коли1640 (фирмы J. R.H. Biosciences, г. I честве 2 шариков на клетку. Негативные Кансас, США), 1 0 % ТЭС, 2 ммоль клетки выделяли путем магнитной сепатамина, 0,05 ммоль 2 - ME и по К рации. Т-клетки CD4+ далее обогащали /мл пенициллина и стрептомицина из получаемой клеточной суспензии, которая примерно на 85% состояла из CD4+, 30 генпредставляющие клетки пульсиі в течение 4 часов или в присутств путем позитивной селекции с использоватигена L. major в количестве 2 нием клеточного сортера с магнитной акорганизмов/мл, или лишь в среде, тивацией (марки MACS, фирма Miltenyi, г. лишенные Т-клеток спленоциты пер Dussetdorf, Германия). Для этого клетки 35 ращиванием обрабатывали у-раді маркировали в течение 15 минут с ис1000 rad. В некоторых случаях в уг пользованием 12 мкг/мл биотинилированния подают 50 мкг/мл рекомбинг ного антитела против CD4 в смеси фосинтерлейкина-10, 100 нг/мл реком* фатсодержащего солевого буфера и ального интерлейкина-4 и/или нейтра бумина сыворотки крупного рогатого ско40 щие моноклональные антитела прот та, взятой в количестве примерно 50 мл е цитокинов. Надосадочную жидкост на 10 клеток. Клетки промывали в фосрали по истечении 72 часов и поди фатсодержащем солевом буфере и инкуанализу для обнаружения синтеза t бировали вместе с микрошариками нов. Содержание цитокинов в над< Streptavidin Microbeads (фирмы Becton Dickinson, г. Sunnyvale, Калифорния, США) 45 ной жидкости определяли путем • фазного иммуноферментного анал в количестве примерно 50 мкл на 10 в тодом, описанного выше для у -иь клеток. По истечении 15 минут добавляли рона (см. Chatelain и др., в укг Streptavidin-РЕ (фирмы Becton Dickinson) источнике, 1992 г.), для интерле с конечной концентрацией 1/50. Далее 50 (см. Chatelain и др., в указанном v\ инкубировали в течение '5 минут, после ке, 1992 г.) и для интерлейкина-1 чего клеточную суспензию промывали и терлейкина-3. Пробы подвергали к< по указаниям производителя пропускали венному анализу путем сравнения через магнитную колонку (марки MACS, дартными кривыми, полученными і фирма Miltenyi, г. Dusseldorf, Германия). Оставшиеся на намагниченной колонке 55 лизе очищенного рекомбинантн природного цитокина. клетки элюировали путем удаления коПредварительная обработка * лонки от магнита и тщательно промыванальным антителом против CD4 ли смесью фосфатсодержащего солевоуменьшило количество имеющих* го буфера и альбумина сыворотки круппоряжении Т-клеток животного, ного рогатого скота. Полученная клеточ 59 ІІ 60 26644 Т а б л и ц а 8 Дифференциация костного мозга % общего количества клеток Мыши юнг Ж 3 20 37 29 4 5 6 4 2 2 »MOL IL-10T 28 18 27 2 1 1 2 1 1 »MOL Б В Г № 1 № 2 46 39 35 12 9 10 10 5 12 4 3 4 №1 №2 №3 46 56 53 12 19 14 7 4 2 2 1 1 Е Д №3 Контроль А 1 П р и м е ч а н и я : А - нейтрофилы; Б - нейтрофильные миелобласты; В эозинофилы; Г - эозинофильные миелобласты; Д - содержащие ядро эритроциты; Є плазматические клетки; Ж - лимфоциты; 3 - первичные недифференцированные бластоциты. Т а б л и ц а 9 Исследования по образованию колоний Мыши GM GEM GEMM BFU-e MEG MEG/MIX 618 1,488 433 2,100 14,135 14,357 1,236 893 433 6,300 12,116 9,252 978 680 958 1,276 986 1,628 CFU-e 419 1,021 958 1,276 1,424 4,132 Селезенка (колонии в селезенке) С СС РН нениями аминокислот (делецией, добавлением, заменой), не в значительной степени влияющими набиологическую активность. Интерлейкин-4 можно приобрести у разных фирм, например, Genzyme Corporation, г. Cambridge, Массачусетс, США, или его можно получать известными методами, или с использованием естественных источников, или путем рекомбинации ДНК (см., например, Sheehan и др., J.lmmunol. 142, стр. 884, 1989 г., и Starnes и др. J.lmmunol. 145, стр. 4185, 1990 г.). Альтернативно для обнаружения кодирующей интерлейкин-^ ДНК в геномных библиотеках или библиотеках кДНК можно использовать смешанные пробы олигонуклеотидов на основе известных нуклеотидных последовательностей интерлейкина-4. Обнаруженную таким образом ДНК можно вырезать из библиотеки путем расщепления эндонуклеазной рестрикции, или ее можно получать с использованием пригодных праимеров и путем метода цепной реакции с помощью полимеразы