Спосіб інгібування ангіогенезу в тканині, спосіб інгібування ангіогенезу в твердій пухлині, спосіб індукції регресії твердої пухлинної тканини, спосіб інгібування росту твердої пухлинної тканини, спосіб зменшен

1 Способ ингибирования ангиогенеза в ткани, включающий введение в указанную ткань композиции, содержащей ангиогенез-ингибирующее количество антагониста интегрина ccv/33 2 Способ ингибирования ангиогенеза в твердой опухоли пациента, включающий - введение указанному пациенту композиции, содержащей ангиогенез-ингибирующее количество антагониста интегрина ccv/33 3 Способ индукции регрессии твердой опухолевой ткани у пациента, включающий введение указанному пациенту композиции, содержащей терапевтически эффективное количество ангиогенезингибирующего количества антагониста интегрина avfi3, достаточного для ингибирования неоваскуляризации твердой опухолевой ткани 4 Способ ингибирования роста твердой опухолевой ткани у пациента, подвергающейся неоваскуляризации, включающий введение указанному пациенту композиции, содержащей терапевтически-эффективное количество ангиогенезингибирующего количества антагониста интегрина avfi3, достаточного для ингибирования роста твердой опухолевой ткани 5 Способ уменьшения кровоснабжения ткани, необходимого для поддержания новообразования указанной ткани у пациента, включающий введение указанному пациенту композиции, содержащей терапевтически-эффективное количество ангиогенез-ингибирующего количества антагониста интегрина crv/?3, достаточного для уменьшения кровоснабжения указанной ткани 6 Способ ингибирования ангиогенеза в воспаленной, ангиогенной ткани пациента, включающий введение указанному пациенту композиции, содержащей ангиогенез-ингибирующее количество антагониста интегрина ccv/33 7 Способ лечения пациента, у которого наблюдается неоваскуляризация ретинальной ткани, включающий введение указанному пациенту композиции, содержащей терапевтически-эффективное количество ангиогенез-ингибирующего количества антагониста интегрина av{33 8 Способ лечения пациента от рестеноза в тканях, когда наблюдается миграция клеток гладкой мышцы после ангиопластики, включающий введение указанному пациенту композиции, содержащей терапевтически эффективное количество антагониста интегрина av{33 9 Способ по любому из пп 1-8, отличающийся тем, что указанный антагонист интегрина avj3-i ингибирует связывание фибриногена с интегрином CEV/?3,HO не существенно ингибирует связывание фибриногена с интегрином ашРъ 10 Способ по любому из пп 1-8, отличающийся тем, что указанный антагонист интегрина avj3-i представляет собой анти-а„/?3 моноклональное антитело 11 Способ по п 10, отличающийся тем, что антиavj3-i моноклональное антитело специфически связывает комплекс интегрина av{33 12 Способ по п 10, отличающийся тем, что указанное антитело обладает иммунореактивными характеристиками моноклонального антитела LM609 с АТСС каталожным номером НВ 9537 О о> 44729 13 Способ по п 10, отличающийся тем, что ан26 Способ по любому из пп 2-4, отличающийся титело является гуманизированным тем, что указанное введение осуществляют совместно с химиотерапией 14 Способ по п 13, отличающийся тем, что гуманизированное антитело обладает иммунореак27 Способ по любому из пп 2-4, отличающийся тивными характеристиками моноклонального антем, что опухоль является метастазированной титела LM609 имеющего АТСС каталожный номер 28 Способ по любому из пп 2-4, отличающийся НВ 9537 тем, что указанная твердая опухоль ткани представляет собой карциному 15 Способ по любому из пп 1-8, отличающийся 29 Способ по любому из пп 2-4, отличающийся тем, что указанный антагонист интегрина avj3-i тем, что указанная твердая опухоль ткани предпредставляет собой RGD-содержащий полипепставляет собой опухоль легкого, поджелудочной тид железы, молочной железы, толстой кишки, гортани 16 Способ по п 15, отличающийся тем, что укаили яичника занный полипептид выбирают из группы, состоя30 Способ по любому из пп 1, 5-6, отличающийщей из c-(GrGDFV) (SEQ ID № 4), c-(RGfV) (SEQ ID ся тем, что указанная ткань является артритной № 5), c-(RGDFV) (SEQ ID № 7) и тканью YTAECKPQVTRGDVE (SEQ ID № 8) и их солей 31 Способ по п 30, отличающийся тем, что ука17 Способ по п 16, отличающийся тем, что указанная артритная ткань присутствует у млекопизанная соль представляет собой гидрохлорид или тающего с ревматоидным артритом трифторацетат 32 Способ по любому из пп 1, 5-7, отличающий18 Способ по п 15, отличающийся тем, что укася тем, что указанная ткань представляет собой занный антагонист интегрина avj3-i представляет ретинальную ткань пациента с диабетической ресобой циклический полипептид тинопатией, а указанный ангиогенез представляет 19 Способ по любому из пп 2-8, отличающийся собой ретинальный ангиогенез тем, что пациентом является человек 33 Способ по любому из пп 1, 5-7, отличающий20 Способ по любому из пп 1-7, отличающийся ся тем, что ткань представляет собой ретинальтем, что указанное ангиогенез-ингибирующее коную ткань, а ангиогенез представляет собой ретиличество составляет от около 0,1 мг/кг до около нальный ангиогенез 300 мг/кг 34 Способ по п 33, отличающийся тем, что ука21 Способ по п 8, отличающийся тем, что указанная ретинальная ткань принадлежит пациенту занное терапевтически эффективное количество с диабетической ретинопатией или макулярной составляет от около 0,1 мг/кг до около 300 мг/кг дегенерацией 22 Способ по любому из пп 1-8, отличающийся 35 Способ по п 1 или 8, отличающийся тем, что тем, что указанное введение включает внутривенуказанное введение проводят после ангиопластиное, внутрисуставное, трансдермальное, внутрики мышечное или перроральное введение 36 Способ по п 35, отличающийся тем, что ука23 Способ по любому из пп 1-8, отличающийся занная ангиопластика представляет собой коротем, что указанное введение включает перистальнарную ангиопластику тическое введение 37 Способ по п 1 или 8, отличающийся тем, что 24 Способ по любому из пп 1-8, отличающийся указанное введение осуществляют у пациента с тем, что указанное введение включает ежедневриском рестеноза после ангиопластики ное введение одной или более доз в течение одного или нескольких дней 25 Способ по любому из пп 1-8, отличающийся тем, что указанное введение заключается во внутривенном введении однократной дозы Настоящее изобретение относится, главным образом, к области медицины и конкретно, к способам и композициям, предназначенным для ингибирования ангиогенеза тканей с использованием антагонистов витронектинового рецептора avp3 Интегрины представляют собой класс клеточных рецепторов, которые, как известно, связывают внеклеточные матричные белки и, в связи с этим, регулируют взаимодействия клетка-клетка и клетка-внеклеточная матрица, которые обычно обозначаются, как события адгезии клеток Однако, хотя многие интегрины и лиганды, связывающие интегрин, описаны в литературе биологическая функция многих интегринов остается неопреде ленной Интегриновые рецепторы составляют семейство белков с разделенными структурными характеристиками нековалентных гетеродимерных гликопротеиновых комплексов, образованных из a и р субъединиц Витронектиновый рецептор, названный за его первоначальную характеристику преимущественного связывания с витронектином, как известно в настоящее время, имеет отношение к трем различным интегринам, обозначенным, как аурі, аурз и a v p 5 См Horton Int J Exp Pathol , 71 741-759 (1990) аурі связывает фибронектин, и витронектин аурз связывает большое число лигандов, включая фибрин, фибриноген, ламинин, тромбоспондин, витронектин, фактор Виллебранда, остео 44729 состояниях Такие клинические состояния связанные с ангиогенезом и на них ссылаются, как на ангиогенные заболевания См Folkman с сотр , Science 235 442-447 /1987/ Ангиогенез обычно отсутствует во взрослых или зрелых тканях, однако он обычно присутствует при лечении ран и в цикле роста Corpeus leuteum См , например Moses с сотр , Science, 248 1408-1410 /1990/ Было предположено, что ингибирование ангиогенеза может служить полезной терапией ограничения роста опухолей Ингибирование ангиогенеза может осуществляться /1/ ингибированием выделения таких "ангиогенных молекул", как pFGF /фактор роста фибробласта/, 121 нейтрализацией ангиогенных молекул, например путем использования анти- pFGF антител, и /3/ ингибированием реакции эндотелиальной клетки на ангиогенную стимуляцию Последнему варианту было уделено внимание и Folkman с сотр, (Cancer BloLoqu, 3 89-96, 1992) описал несколько ингибиторов эндотеллиального клеточноОбсуждение RGD распознающего сайта можго ответа, включая коллагеназный ингибитор, бано найти в статье Pierschbacher с сотр , в журнале зовый мембранный циклический ингибитор, Nature 309 30-33/1984/ и Pierschbacher с сотр, в ангиостатические стероиды, ингибиторы ангиогежурнале Proc Natl Acad Sci США, 81 5985-5988 неза грибкового происхождения, тромбоцитный /1984/ Различные RGD -полипептиды различной фактор 4, тромбоспондин, такие артритные лекаринтегриновои специфичности были также описаны ства, как D -пеницилламин и тиомолат золота, Grant с сотр , в Cell, 58 933-943 /1989/ Cheresh с аналоги витамина D3, альфа-интерферон и многие сотр, Cell, 58 945-953 /1989/, Aumailley с сотр, другие препараты, которые могут использоваться FEBS Zetts 291 50-54 /1991/ и Plaff с сотр J Biol для ингибирования ангиогенеза Другие предлоChem 269 20233-20238 /1994/ а также в патентах женные ингибиторы ангиогенеза описаны Blood с США №№ 4 517 686, 4 578 079, 4 589 881, сотр , Bioch Bioph Acta, 1032-89-118/1990/, Moses 4614517, 4661111,4792525, 4683291, с сотр Science 248 1408-1410 /1990/, Ingber с сотр 4 879 237, 4 988 621, 5 041 380 и 5 061 693 Zab Invert, 594451 /1988/ и также в патентах Ангиогенез представляет собой процесс васСША №№ 5092885, 5,112946, 5192744, и куляризации ткани, включающий рост вновь раз5 202 352 Ни один из ингибиторов ангиогенеза, вивающихся в ткани кровеносных сосудов, и наописанный ранее, не обладал способностью ингизывается также неоваскуляризацией Этот бировать aVp3 RGD - содержащие пептиды, ингипроцесс опосредован инфильтрацией эндотелибирующие витронектиновый рецептор с аурз, такальных клеток и клеток гладкой мышцы Предпоже был описан Aumailley с сотр FEBS Zetts лагается, что такой процесс реализуется одним из 29150 54 /1991/, Choi с сотр J Vase Surg , трех путей сосуды могут прорастать из уже суще19 125-134 /1994/, Smith с сотр, J Biol Chem, ствующих сосудов, может иметь место de novo 265 12267-12271 /1990/ и Pfaff с сотр J Biol развитие сосудов из клеток предшественников Chem 269 20233-20238/1994/ Однако, до момен/васкулогенез/, либо существующие мелкие сосута создания настоящего изобретения роль интегды могут увеличиваться в диаметре См Blood с рина аурз в развитии ангиогенеза не была предсотр Bioch Biophys Acta 1032 89-118/1990/ Как положена или установлена известно, сосудистые эндотелиальные клетки содержат, по крайней мере, пять RGD - зависимых Ингибирование клеточной адгезии in vitro с исинтегринов, включая витронектиновый рецептор пользованием моноклональных антител, имму/аурз или аурб/, рецепторы коллагенового типа 1 и носпецифичных для различных интегриновых IV /си pi/, ламининовый рецептор /ci2 pi/, фибросубъединиц а или р вовлекает аурз в адгезию кленектин /ламинин/ коллагеновый рецептор /азрі/ и ток большого числа типов, включая микрососудифибронектиновый рецептор /сі5рі/ См статью стые эндотелиальные клетки См Davis с сотр , J DAVIS с сотр, в J Cell Biochem, 52 206-218 Cell Biol 51 206-218 /1993/ Кроме этого, Nicosia с /1993/ Известно, что клетка гладкой мышцы сосотр Am J Pathol 138 829-833 /1991/, описали держит, по крайней мере, шесть RGD -зависимых использование RGD -пептида GBG-DS для in vitro интегринов, включая aspi, аурз и ayps ингибирования образования "микрососудов" крыспонтин и костный сиалопротеин I ayps связывает витронектин Специфические роли в адгезии клеток эти три интегрина играют во многих клеточных взаимодействиях в тканях исследуемых в настоящее время, однако очевидно, что имеются различные интегрины с различными биологическими функциями Одним из важных сайтов узнавания в лиганде для многих интегринов является аргинин-глицинаспаргиновая кислота /RGD/ трипептидная последовательность RGD обнаружена во всех лигандах, идентифицированных выше для витронектиновых рецепторных интегринов Такой RGD распознающий сайт может быть мимикрирован с помощью полипептидов /"пептиды"/, которые содержат RGD последовательность, и такие RGDпептиды являются известными ингибиторами интегриновои функции Однако, важно отметить, что в зависимости от последовательности и структуры RGD -пептида, специфичность ингибирования может изменяться в отношении мишеньспецифичных интегринов Ангиогенез является важным процессом неонатального роста, но он столь же важен в заживлении ран и в патогенезе большого числа клинических заболеваний, таких как воспаление тканей, артриты, рост опухолей, диабетическая ретинопатия, пятнистая дегенерация в результате неоваскуляризации сетчатки глаза и при родственных синой аорты, культурированной в коллагеновом геле Однако, ингибирование образования "микрососудов" in vitro в коллагеновых гелевых культурах не является моделью ингибирования ангиогенеза в ткани, поскольку не показано, что микрососудистые структуры аналогичны капиллярным наростам, или что образование микрососудов в колла 44729 геновои гелевои культуре аналогично росту новых сосудов в интактной ткани, например в артритной ткани, опухолевой ткани или вольной ткани, где желательно ингибирование ангиогенеза Поэтому, помимо сообщенных выше исследований, Заявители неожиданно обнаружили другую демонстрацию, того факта, что ангиогенез может ингибироваться в тканях с использованием ингибиторов клеточной адгезии Главным образом, никогда ранее не было показано, что аурз функция требуется для ангиогенеза в тканях, или что аурз антагонисты могут ингибировать ангиогенез в тканях В настоящем изобретении продемонстрирован тот факт, что ангиогенез с тканях требует наличия интегрина аурз и что ингибиторы аурз могут ингибировать ангиогенез Обнаружение этого факта также демонстрирует то, что антагонисты других интегринов, например, ayps или аурі не ингибируют ангиогенез, возможно по причине их несущественности для развития ангиогенеза В этой связи, в изобретении описываются способы ингибирования ангиогенеза в тканях, включающие применение на ткани композиции, включающей ангиогенез-ингибирующее количество аур5 - антагониста Лечению может подвергаться любая ткань, для которой желательно ингибирование ангиогенеза, такая как "больная" ткань, где происходит неоваскуляризация Примерами таких тканей могут служить воспаленная ткань, твердые опухоли, метастазы, ткани, подверженные ретенозу, и другие ткани Используемый в настоящем изобретении аурз -антагонист способен связывать аурз и полностью ингибировать способность аурз связываться с природным лигандом Предпочтительно, чтобы такой антагонист обладал специфичностью в отношении аурз по сравнению с другими интегринами Согласно особенно предпочтительному воплощению аурз -антагонист ингибирует связывание фибриногена или другого RGD - содержащего лиганда с аурз но несущественно ингибирует связывание фибриногена с апьрз Предпочтительным аурз - антагонистом может служить полипептид, или моноклональное тело или их функциональный фрагмент, который иммунореагируетс аурз На чертежах, составляющих часть настоящего описания показано следующее На фиг 1А - 1Д проиллюстрировано распределение в ткани интегриновых субъединиц рз и pi в случае нормальной кожи и кожи в процессе заживления ран, обозначенной, как гранулированная ткань Иммуногистохимия с использованием антител к рз и pi осуществлялась, как описано в примере ЗА На фиг 1А и 1В, соответственно, проиллюстрирована иммунореактивность анти- рз в нормальной коже и в гранулированной ткани На фиг 1С и 1D, соответственно, проиллюстрирована иммунореактивность анти- рі в нормальной коже и в гранулированной ткани На фиг2А - 2D соответственно показано тканевое распределение фактора фон Виллебранда и ламининовых лигандов, которые, соответственно, связывают интегриновые субъединицы рз и pi 8 в нормальной коже и в коже в процессе заживления ран, обозначенной, как гранулированная ткань Иммуногистохимию с использованием антител на фактор фон Виллебранда /анти- vWF /и ламинин /анти-ламинин/ осуществляли, как описано в Примере ЗВ На фиг 2А и 2В, соответственно, проиллюстрирована иммунореактивность анти-vWF в нормальной коже и в гранулированной ткани Фиг2С и 2Д, соответственно, показывают иммунореактивность анти-ламинина в нормальной коже и в гранулированной ткани На фиг ЗА - ЗД продемонстрировано распределение витронектинового интегринового рецептора, аурз в биопсии ткани рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака молочной железы и рака легких, соответственно Иммуногистохимию с использованием LM609 антитела к аурз проводили, как описано в примере ЗС На фиг 4 показана типичная микрофотография САМ настоящего изобретения лишенной кровеносных сосудов в необработанном 10-дневном курином эмбрионе Препарат описан в Примере 5В На фиг 5А - 5С проиллюстрировано распределение в ткани интегринов pi и аурз в препарате САМ настоящего изобретения На фиг5А показано распределение pi субъединицы в необработанном 10-дневном препарате САМ, как детектировано с помощью иммунофлуоресцентной иммунореактивности с использованием CSAT, анти - pi антителом На фиг 5В показано распределение аурз рецептора в необработанном 10дневном препарате САМ, как детектировано с помощью иммунофлуоресцентной иммунореактивности с LM609 , анти- аурз антителом На фиг5С показано распределение рецептора аурз в обработанном pFGF 10-дневном препарате САМ, как детектировано с помощью иммунофлуоресцентной иммунореактивности с LM609, анти- аурз антителом Методы лечения и полученные результаты описаны в примере 5С На фиг 6 проиллюстрировано количественное определение в столбце диаграммы относительной экспрессии аурз и рі в необработанных и обработанных pFGF 10-дневных препаратах САМ, в соответствии с описанным в Примере 6А Среднее значение интенсивности флуоресценции отложено по оси -У, а интегриновые профили отложены по оси X На фиг7А - 7С проиллюстрирован внешний вид необработанного 10-дневного САМ, образца САМ, обработанного pFGF, и образца САМ, обработанного TNFa, соответственно, методики и результаты описаны в примере 6А Фиг8А - 8Е иллюстрируют влияние актуальной обработки антителом на FCF-индуцированный ангиогенез на 10 день САМ, как это описано в Примере 7А1/ На фиг8А показан необработанный САМ препарат, лишенный кровеносных сосудов На фиг8В продемонстрирована инфильтрация новой сосудистой сети в область, предварительно лишенную сосудистой системы, индуцированную pFGF обработкой Фиг8С, 8Д и 8Е, соответственно, демонстрируют эффекты антител против pi /антитело- pi, CSAT/ ayps /антиavp5 P3C2/ и аурз /анти- a v p 3 , LM609/ 44729 10 опухоли, обработанные контрольным антителом /P3G2/, демонстрировали большое число жизнеспособных и активно делящихся опухолевых клеток, о чем свидетельствовали митотические значения /показаны стрелками сверху/, а также множественные кровеносные сосуды /стрелки/ по всей строме опухоли Напротив, очень небольшое количество, если оно вообще определялось, жизнеспособных опухолевых клеток или кровяных сосудов детектировалось в клетках, обработанных LM609 /анти-аурз/ как показано на фигю14В Фиг15А - 15Е соответствуют M21L опухолям, обработанным пептидами как описано в Примере 9А1 /Ь, и они представляют собой следующее Фиг15А, контрольный циклический RAD пептид /69601/, фиг 15В, циклический RGD пептид /6 6203/, фиг15С, соседняя САМ ткань, взятая из На фиг 10А - ЮС проиллюстрирован эффект того же эмбриона, обработанного циклическим внутривенного применения моноклональных антиRGD пептидом /66203/ и на фиг 15Д представлено тел на ангиогенез, индуцируемый фактором роста, сильное увеличение /13х/ опухолей, обработанных как это описано в примере 7В1 /Фиг 10А демонстконтрольным RAD /69601/, а на 15Е показано уверирует индуцированный с помощью pFGF ангиоличение при обработке циклическим RGD пептигенез без обработки антителом /контрольный эксдом /66203/ Фиг15Д показывает нормальные соперимент/ Ингибирование ангиогенеза не имеет суды из опухоли, обработанной RAD контрольным место когда аналогичный препарат был обработан пептидом 69601/ На фиг 15Е приведены примеры анти- аур5, антителом P3G2, как это показано на разрушенных кровеносных сосудов из опухолей, фигуре 10В обработанных циклическим RGD пептидом /66203/ Ингибирование ангиогенеза реализуется при /стрелки/ обработке анти-аурз, антителом LM609, как это показано на фиг ЮС На фиг 16 - 16Е показано ингибирование антиогенеза под действием антагонистов ангиогенеФиг 11А - 11С иллюстрируют эффект на эмза в модельном анализе in vivo на кроличьем глабрионный ангиогенез после местного применения зу, в соответствии с описанным в примере 10 На анти-интегриновых антител, как описано в примефиг16А и 16В изображен ангиогенез кроличьего ре 7С Ангиогенез не ингибируется в результате глаза в присутствии BFGF и mAbPIF6 /анти-ayps/ обработки 6-дневного САМ анти-рі, и анти- ayps На фиг 16с, 16Д и 16Е показано ингибирование антителами, соответственно, что показано на ангиогенеза кроличьего глаза в присутствии pFGF фиг 11А и 11В Напротив, обработка анти- аурз и mAbl_M609 /анти-аурз/ антителом LM609 приводит к ингибированию образования кровеносных сосудов, как это показано На фиг 17 представлена диаграмма показына фиг 11С вающая как можно создать in vivo мышь человек химерную мышиную модель, что описано в приНа фиг 12 произведено количественное опремере 11А Часть шкуры мыши ЭС1Д заменяли на деление числа сосудов, входящих в опухоль в человеческую неонатальную крайнюю плоть и препарате САМ, как это описано в примере 7Д1/ давали системе залечиваться в течение 4 недель На этом графике число сосудов нанесено на ось После залечивания прививки человеческую крайУ, как результат местного применения или CSAT нюю плоть инокулировали клетками человеческой /анти-рі/, LM609/анти-аурз или P3G2/, анти-аурз/ опухоли В течение следующих 4 недель проявляФиг 13А - 13Д иллюстрируют сравнение между лась измеримая опухоль, которая состояла из весами мокрых опухолей через 7 дней после обчеловеческой опухоли с человеческой сосудистой работки и первоначальными весами, как описано в системой, проходящей из человеческой плоти в примере 9А1/а Каждая полоса представляет человеческую опухоль среднее ±S E 5-Ю опухолей на группу Используемые опухоли были производными человечеНа фиг 18 проиллюстрирован процент едиской меланомы /M21-L/ /ФиМЗА/, рака поджелуничных клеток, полученных от САМ обработанной дочной железы /Fq/ /Фиг 13В/, легочной т А В и пептидом и окрашенных Арор Tag, как ускарциномы /УСІ_АР-3//Фиг 13с/ и ларингеальной тановлено FACS анализом и описано в примере карциномы /НерЗ//Фигура 13Д/, САМ-препараты и 12А и 12В, соответственно Черные и полосатые внутривенно обработанные PBS , CSAT /анти-рі/ столбцы представляют собой клетки эмбрионов, или LM609 /анти- аурз/ Графики показывают вес обработанных за 24 и 48 часов до анализа, соотопухоли, значение которого нанесено на ось У в ветственно Каждый столбец представляет средрезультате внутривенного применения или CSAT нее ±S E трех измерений САМ обрабатывали /анти-рі/, LM609 /анти- аурз/ или PBS как показано mAb LM609 /анти- a v p 3 / или CSAT /анти-рі/ или на оси X PBS, как описано в Примере 12А2 САМ также обрабатывали циклическим пептидом 69203 На фиг14А и 14В показаны гистологические /цикло-RGDfy, обозначаемым, как пептид 203/ или разрезы опухолей, обработанных P3G2 /антиконтрольным циклическим пептидом 69601 /циклоa v p 5 / /фигю14А/ и LM609 /анти-аурз/ фигю14В, и RADfy, обозначаемым как пептид 601/, как это окрашенных гематоксилином и эозином, как это описано в примере 12В описано в примере 9А1/а Как показано на фиг 14А На фигЭА - 9С проиллюстрировано влияние внутривенной инъекции синтетического пептида 66203 на ангиогенез, индуцированный опухолью, как описано в примере 7Д2 На фигЭА показано отсутствие ингибиторного эффекта внутривенной обработки контрольным пептидом /контрольная пептидная опухоль/ на ангиогенез вызванный индукцией опухоли Ингибирование такого ангиогенеза путем внутривенной инъекции пептида 66203 /циклическая RGD опухоль/ представлено на фигЭВ Отсутствие ингибирующего эффекта или цитотоксичности на зрелые пресуществующие сосуды после внутривенного вливания пептида 66203 в область, примыкающую к опухольобработанной области показано на фиг 9С /циклический RGD соседствующий с САМ/ 11 44729 На фиг19А и 19В проиллюстрированы объединенные результаты суспензий отдельных клеток САМ из эмбриона обработанного либо CSAT /анти-рі/ /фиг19А/ или LM609 /анти-аурз/ /Фиг 19В/, окрашенных Арор Тао и йодистым пропидием и проанализированных методом FACS, как описано в Примере 12С По оси У отложены результаты окрашивания Арор Тао в числе клеток /Аполтоз/, по оси X отложены результаты соответствующие окрашиванию йодистым пропидием /содержание ДНК/ Горизонтальные линии представляют собой отрицательный вход для окрашивания Арор Тао Левая и правая панели показывают на клетки САМ, из эмбрионов, обработанных CSAT /анти-рі/ /Фиг19А/ и LM609 /анти-аурз/ /Фиг 19В/ Осуществляли анализ клеточного цикла, определяя примерно 8 000 событий на состояние Фиг20А - 20С Представляют собой изображения САМ ткани из CSAT /анти-рі/ обработанных эмбрионов, а фигуры 20Д - 20Р отображают САМ ткани из LM609 /анти-аурз/ обработанных эмбрионов полученных как описано в примере 12С Фиг20А и 20Д демонстрируют ткани, окрашенные Арор Таа и визуализированные методом флуоресценции /FITC/ суперналоженным на D I С изображение На фиг 20В и 20Е показаны те же ткани, окрашенные mAb LM609 /анти-аурз/ и визуализированные с помощью флуоресценции /родамин/ На фиг20С и 20F представлены изображения тех же тканей, окрашенных как Арор Tag, так и LM609, причем желтое окрашивание свидетельствует о солокализации Полосы в левой и правой панели составляют 15 и 50мкм, соответственно А Обозначения Аминокислотные остатки Аминокислота образуется в ходе химического переваривания /гидролиз/ полипептида по его пептидной связи Описанные в тексте аминокислотные остатки предпочтительно находятся в "L" изомерной форме Однако, остатки находящиеся в "D" изомерной форме могут быть заменены на любой Lаминокислотный остаток, если полипептид сохраняет желаемое функциональное свойство NH2 относится к свободной амино-группе на аминоконце полипептида СООН относится к свободной карбокси-группе, присутствующей на С-конце полипептида Придерживаясь стандартной полипептидной номенклатуры /описанной в J Boil Chem 243 3552-59 /1969/ и принятой 37 CFP §1 822/ь//2/, сокращенные названия аминокислотных остатков представлены в следующей Таблице Соответствия Таблица соответствия 1-буквенный У G F М А S I Символ 3-х буквенный Туг Gly Phe Met Ala Ser lie Аминокислота тирозин глицин фенилаланин метионин аланин серии изолейцин 12 L Т V р к н Leu Thr Val Pro Lys Q His Gin Е Glu Z W R Glx Trp Arg D Asp N В С Asn Asx Cys X Xaa лейцин треонин валин пролин лизин гистидин глутамин глутаминовая кислота Giu и/или Gin триптофан аргинин аспаргиновая кислота аспарагин Asn и/или Asp цистеин неизвестна/ другое Кроме этого в тексте используются следующие другие сокращения трет-бутилоксикарбонил дициклогексилкарбодиимид диметилформамид ОМе метокси HOBt і -гидроксибензотриазол Следует отметить, что все аминокислотные последовательности представлены в тексте формулами, левая и правая ориентация которых представлены в традиционном направлении от амино-конца к карбокси-концу Кроме этого следует также отметить, что штрих в начале или конце аминокислотной последовательности указывает на пептидную связь со следующей последовательностью одного или более аминокислотных остатков Полипептид относится к линейному ряду аминокислотных остатков, связанных друг с другом пептидными связями между алфа-амино группой и карбокси группой непрерывной аминокислотной последовательностью Пептид этот термин в контексте изобретения относится к линейным рядам не более примерно 50 аминокислотных остатков связанных друг с другом, как в полипептиде Циклический пептид является производным соответствующего линейного пептида, относится к пептиду, в котором не существуют N- или С-концы и в котором соответствующие линейные пептидные N-терминальные формы и амидная связь с Стерминальным карбоксилатом существуют, как часть указанного линейного пептида Термин белок /протеин/ относится к линейным сериям из более, чем 50 аминокислотных остатков, связанных друг с другом, как в полипептиде Синтетический пептид относится к химически полученной цепи аминокислотных остатков, связанных друг с другом пептидными связями, которые не содержат встречающиеся в природе белки и их фрагменты В Общие соображения Настоящее изобретение относится главным 13 44729 14 образом к тому открытию, что ангиогенез опосреin vivo с применением реагентов, являющихся андован специфическим витронектиновым рецептотагонистами биологической функции аурз, ром аурз и что ингибирование аурз функции ингиС Способы ингибирования ангиогенеза бирует ангиогенез Такое открытие является Настоящее изобретение обеспечивает способ важным из-за роли, которую играет ангиогенез в ингибирования ангиогенеза в ткани и в результате большом числе заболеваний В результате ингиингибируются события в ткани, которые зависят от бирования ангиогенеза можно вмешиваться в ход ангиогенеза Обычно такой способ включает призаболевания, улучшать симптомы и, в ряде слуменение на ткани композиции, включающей ангиочаев, излечивать заболевание генез-ингибирующее количество аурз-антагониста В том случае, когда рост новых кровеносных Как указывалось ранее, ангиогенез ответствесосудов вызывается или вносит вклад в патолонен за большое число процессов, включающих гию, связанную с заболеванием, ингибирование неоваскуляризацию ткани, включая "прорастание", ангиогенеза будет уменьшать вредные эффекты васкулогенез или расширение сосудов, причем такого заболевания Примеры таких заболеваний все такие ангиогенезные процессы опосредованы включают ревматоидный артрит, диабетическую и зависят от экспрессии аурз За исключением ретинопатию, воспалительные заболевания, ресслучаев заживления травматической раны, обратеноз и т п В том случае, когда рост новых кровезования corpus leuteum и эмбриогенеза, полагают, носных сосудов требуется для поддержки роста что большая часть ангиогенезных процессов свявредной ткани, ингибирование ангиогенеза привезана с заболеваниями и поэтому использование дет к понижению подачи крови в ткань и тем сатерапевтических методов настоящего изобретемым, внесет вклад в уменьшение образовавшейся ния является селективным для таких заболеваний тканевой массы, основанной на условиях подачи и не дает вредных побочных эффектов крови Примеры такого рода включают рост опуИмеется большое число заболеваний, в котохолей, в которых неоваскуляризация является рых предполагается, что важным их фактором постоянным требованием, с тем, чтобы размер является ангиогенез и в этом отношении можно опухоли достиг нескольких миллиметров в толщисослаться на ангиогенные заболевания, не ограну и для образования твердых опухолевых метаничиваясь только ими, такие как воспалительные стазов расстройства, например иммунные и неиммунные воспаления, хронический артикулярный ревмаСпособы настоящего изобретения эффективтизм и псориаз, нарушения связанные с непраны частично, поскольку такая терапия высоко севильной и несвоевременной инвазией сосудов, лективна в отношении ангиогенеза, а не для друтакие как диабетическая ретинопатия, неоваскугих биологических процессов Как показано в лярная глаукома, рестеноз, капилярная пролифепримерах, лишь рост новых сосудов содержит рация в атеросклеротических бляшках и остеоподостаточное количество аурз и поэтому терапевроз, а также нарушения связанные с развитием тические методы не оказывают вредного влияния рака, такие как твердые опухоли, метастазы тверна зрелые сосуды Кроме этого, аурз не является дых опухолей, ангиофибромы, ретролентальная широко распространенным в нормальных тканях и фиброплазия, гемангиома, саркома Капоши и пов основном обнаруживается селективно на новых добные раковые заболевания, которые требуют сосудах, что застраховывает тот факт, что такая неоваскуляризации для поддержки роста опухоли терапия может селективно избирать мишенью рост новых сосудов Таким образом, способы ингибирующие ангиогенез в заболевших тканях облегчают симптомы Открытие того факта, что ингибирование лишь заболевания и, в зависимости от типа заболевааурз эффективно ингибирует ангиогенез, позволяния, могут способствовать излечению заболевает создавать терапевтические композиции с пония Согласно одному из воплощений, настоящее тенциально высокой специфичностью и поэтому с изобретение охватывает ингибирование ангиогеотносительно низкой токсичностью Таким обранеза, perse, в тканях Степень ангиогенеза в ткани зом, хотя настоящее изобретение раскрывает иси поэтому степень ингибирования достигаемая пользование реагентов на базе пептидов, обланастоящими методами, может быть оценена дающих способностью ингибировать один или большим числом способов, например, теми, что более интегринов, можно применять и другие реаописаны в Примерах детекции аурзгенты, которые более селективно ингибируют иммуноположительной зрелости и структуры зааурз, и поэтому не оказывают побочных эффектов родившихся сосудов с помощью иммуногистохиингибирования других биологических процессов, мии кроме опосредуемых аурз Так, например, как показано в настоящем изобретении, существует возможность получения моноклональных антител, высоко селективных в отношении имунной реакции с аурз, которые аналогичным образом, селективны в ингибировании аурз функции Кроме этого, RGD-содержащие пептиды могут применяться в качестве селективных агентов в ингибировании аурз, как будет описано ниже Перед открытием настоящего изобретения не было известно, что ангиогенез и любые процессы, зависящие от ангиогенеза, могут ингибироваться Следует иметь в виду, что большое число тканей или органов, состоящих из организованной ткани, могут поддерживать ангиогенез в болезненном состоянии, причем к таким тканям и органам могут относиться кожа, мышца, кишки, соединительная ткань, суставы, кости и т д , то есть те случаи, когда кровеносные сосуды способны вторгаться в систему в результате ангиогенного стимулирования Таким образом, в одном из случаев ткань, подвергаемая лечению, представляет собой воспаленную ткань и ангиогенез, подвергаемый инги 15 44729 16 бированию, представляет собой ангиогенез восклетки рака могли бы входить в первичную опупаленной ткани, когда реализуется неоваскулярихоль и зация воспаленной ткани В случае таких наруше121 их образование на второй стадии требует ний способ изобретения предусматривает неоваскуляризации для поддержки роста метастаингибирование ангиогенеза в артритных тканях, зов как это имеет место у пациентов с хроническим Согласно родственному воплощению, наартикулярным ревматизмом, в иммунных или нестоящее изобретение охватывает практическую иммунных воспаленных тканях, в псориатических реализацию способа, связанного с другими тератканях и т п пиями, например, с традиционной химиотерапией, направленной против твердых опухолей, и для Пациент, подвергаемый лечению с помощью контроля образования метастазов Применение метода настоящего изобретения, согласно больингибитора ангиогенеза обычно проводится в ходе шинству решений, желательно представляет соили после химиотерапии, хотя иногда предпочтибой человека, хотя следует иметь в виду, что тельно ингибировать ангиогенез после режима принципы изобретения показывают, что оно эфхимиотерапии, когда опухолевая ткань будет отфективно в отношении всех млекопитающих, коветственна за токсичный "штурм" индукцией анторые подпадают под термин "пациент" В этом гиогенеза для регенерации при условии подачи к контексте под млекопитающим понимается любая опухолевой ткани крови и питательных веществ его разновидность для которого желательно лечеКроме этого, предпочтительно применять методы ние заболевания, связанного с ангиогенезом, осоингибирования ангиогенеза после хирургических бенно это относится к разновидностям сельскохоопераций, в которых твердые опухоли были удазяйственных и домашних млекопитающих лены в качестве профилактики метастазов Согласно другому родственному решению, ткань подлежащая лечению представляет собой ткань сетчатки пациента больного диабетической ретинопатией, пятнистой дегенерацией или неоваскулярной глаукомой и ангиогенез, подлежащий ингибированию, представляет ангиогенез ткани сетчатки, когда реализуется неоваскуляризация ткани сетчатки Согласно другому воплощению, ткань, подлежащая лечению, представляет опухолевую ткань пациента с твердой опухолью, метастазами, раком кожи, раком молочной железы, больного гемангиомой или ангиофибромой и другими видами рака, и ангиогенез, подлежащий ингибированию представляет собой ангиогенез опухолевой ткани, в которой реализуется неоваскуляризация опухолевой ткани Типичными твердыми опухолевыми тканями, обрабатываемыми методами изобретения, могут быть ткани легких, поджелудочной железы, молочной железы, толстой кишки, гортани, яичников и аналогичные ткани Примеры ангиогенеза опухолевых тканей и его ингибирование описано в Примерах Ингибирование ангиогенеза опухолевой ткани является особенно предпочтительным воплощением изобретения в связи с важной ролью неоваскуляризации в росте опухоли В отсутствие неоваскуляризации опухолевой ткани, такая ткань не получает требуемых питательных веществ, снижается ее рост, прекращается дополнительный рост, она регрессирует и в конечном счете становится некротической тканью, приводя к гибели опухоли Говоря другими словами, настоящее изобретение обеспечивает способ ингибирования опухолевой неоваскуляризации путем ингибирования ангиогенеза опухоли, в соответствии с методом настоящего изобретения Аналогичным образом, изобретение обеспечивает способ ингибирования роста опухоли в результате практической реализации методов ингибирования ангиогенеза Способы изобретения особенно эффективны при их применении против развития метастазов поскольку /1/ их образование требует васкуляризации первичной опухоли так, что метастазные Несмотря на то, что настоящие способы направлены на ингибирование опухолевой неоваскуляризации такие методы могут также применяться для ингибирования роста опухолевой ткани, ингибирования образования опухолевых метастазов и регрессии образовавшихся опухолей Представленные примеры демонстрируют регрессию образовавшихся опухолей после единичного внутривенного применения аурз антагониста настоящего изобретения Рестеноз представляет собой процесс миграции и пролиферации клеток гладкой мышцы /SMC/ в место подкожной транслюминальной коронарной ангиопластии, что затрудняет успех ангиопластики Миграция и пролиферация SMC в ходе рестеноза может рассматриваться, как процесс ангиогенеза, который ингибируется методами настоящего изобретения Поэтому, настоящее изобретение также предусматривает ингибирование рестеноза путем ингибирования ангиогенеза, согласно методу изобретения, у пациента после применения методов ангиопластики Для ингибирования рестеноза аурз -антагонист обычно применяют после ангиопластики через 2-28 дней и, как правило, в течение 14 дней после операции Настоящий метод ингибирования ангиогенеза в тканях и поэтому также предназначенный для практической реализации методов лечения, связанных с ангиогенезом заболеваний, заключается в контактировании ткани с развившимся аутогенезом, или при риске его появления, с композицией, включающей терапевтически эффективное количество антагониста, способного ингибировать аурз осуществляя связывание с его природным лигандом Таким образом, такой способ заключается в применении на пациенте терапевтически эффективного количества физиологически переносимой композиции, содержащей аурз-антагонист изобретения Дозированные интервалы для введения аурзантагониста зависят от формы антагониста, и его мощности, как это описано далее в тексте, и составляют достаточно большие количества для обеспечения желаемого эффекта, согласно кото 17 44729 18 рому ангиогенез и симптомы заболевания, опоингибировании связывания фибриногена с интегсредованные ангиогенезом, подвергаются улучрином описаны в Примерах изобретения шению Дозировка не должна быть столь высокой, Терапевтически эффективное количество аурз чтобы вызывать нежелательные побочные эфантагониста изобретения в виде монокпонального фекты, например, синдромы гипервязкости, леантитела обычно составляет такое количество, гочную эдему, сердечные нарушения, связанные с которое при применении в физиологически переперегрузкой, и т п Обычно, дозировка будет меносимой композиции достаточно для достижения няться в зависимости от возраста, состояния концентрации плазмы в диапазоне от 0,01 микробольного, пола и степени заболевания пациента и грамм /иг/ на миллилитр /мл/ до 1000мкг/мл, предона может быть определена специалистом Такая почтительно, 1мкг/мл - 5мкг/мл и обычно около дозировка также может регулироваться индивиду5мкг/мл Иначе говоря, дозировка может измеальным терапевтом в случае осложнений няться от 0,1 мг/кг до 300м г/кг, предпочтительно, от 0,2мг/кг до 200мг/кг, наиболее предпочтительно Терапевтически эффективное количество 0,5мг/кг до 20мг/кг, при применении одной или представляет собой такое количество аурзболее дозировки ежедневно в течение одного или антагониста, которое достаточно для обеспечения нескольких дней измеримого ингибирования ангиогенеза в обрабатываемой ткани, например, ангиогенезВ том случае, когда антагонист находится в ингибирующее количество Ингибирование ангиовиде фрагмента моноклонального антитела, такое генеза может быть измерено in situ методом имколичество может легко регулироваться на осномуногистохимии, как описано в настоящем докувании отношения массы фрагмента относительно менте или другими методами, известными массы всего антитела Предпочтительная конценспециалистам трация плазмы в молярном выражении составляет от приблизительно 2 микромолярной /иМ/ до 5 Поскольку аурз антагонист может принимать миллимолярной /тМ/ и, предпочтительно, от оковид мимикрирующего аурз, и RGD-содержащего ло ЮОмкм до 1тМ антительного антагониста пептида, анти-аурз моноклонального антитела или его фрагмента, следует убедиться что мощность и Терапевтически эффективное количество поэтому экспрессия "терапевтически эффективноаурз-антагониста изобретения в виде полипептида го" количества могут изменяться Однако, как поили другого молекулярного аурз миметика аналоказано методами анализа изобретения, специагичного малого размера, обычно составляет такое лист в данной области может легко оценить количество полипептида, которое при введении в мощность аурз-антагониста /кандидата настоящефизиологически толерантной композиции, достаго изобретения точно для достижения концентрации плазмы от около 0,1 микрограмма /иг/ на миллилитр /мл/ до Мощность аурз-антагониста может быть измеприблизительно 200мкг/мл, предпочтительно, от рена множеством способов, включая ингибироваоколо 1мкг/мл до приблизительно 150мкг/мл В ние ангиогенеза в анализе САМ, в in vivo анализе расчете на полипептид с массой около 500г/моль, на глазах кролика, в in vivo анализе с использовапредпочтительная концентрация плазмы в молярнием химерного мышь-человека и путем измереном выражении составляет от около 2 микромония ингибирования связывания природного лиганлярной /иМ/ до около 5 миллимолярной /тМ/ и да с аурз, причем все эти анализы описаны в предпочтительно около 100мкМ-1тМ полипептидтексте или с помощью аналогичных анализов ного антагониста Иначе говоря, дозировка в расПредпочтительный аурз антагонист обладает чете на вес тела может изменяться в интервале от способностью существенно ингибировать связыоколо 0,1 мг/кг до около 300мг/кг, предпочтительно, вание такого природного лиганда, как фибриноген от около 0,2мг/кг до около 200мг/кг при применеили витронектин, с аурз в растворе при конценнии одной или более доз ежедневно в течение от трациях антагониста менее 0,5 микромоля /мкм/, одного до нескольких дней предпочтительно, менее 0,1 мкм и более предпочтительно менее 0,05мкм Под термином "сущестМоноклональные антитела или полипептиды венно" подразумевается, что, по крайней мере, изобретения могут быть введены парентерально 50% снижение связывания фибриногена наблюпутем инъекции или постепенного вливания в тедается в результате ингибирования в присутствии чение времени Хотя ткань, подлежащая лечению, антагониста и на 50% ингибирование ссылаются, обычно доступна в организме в результате сискак на значение ІСзо темного применения и поэтому лечение, как правило, проводят путем внутривенных инъекций Более предпочтительный аурз-антагонист терапевтических композиций, подразумеваются и проявляет селективность в отношении аурз по другие ткани и распределяющие устройства в том сравнению с другими интегринами Так например, случае, когда существует вероятность того, что предпочтительный аурз антагонист существенно целевая ткань содержит молекулу-мишень Так, ингибирует связывание фибриногена с аурз, но не например, моноклональные антитела или полисущественно ингибирует связывание фибриногена пептиды изобретения могут применяться внутрис такими другими интегринами, как аурі, ayps или венно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожапьрз Особенно предпочтительным является аурз но, внутрь полости, трансдермально, и могут антагонист, проявляющий в 10 - 100 раз более вводиться с помощью перистальтических средств низкую активность по значению ICso при ингибировании связывания фибриногена с аурз по сравнеТерапевтические композиции, содержащие нию с IC50 активностью при ингибировании связымоноклональное антитело, или полипептид изования фибриногена с другим интегрином бретения обычно применяются внутривенно, наПримеры анализов измерения ICso активности при пример путем инъекции единичной дозировки 19 44729 20 Термин "единичная дозировка", в том случае, коД Терапевтические композиции гда он используется в отношении терапевтической Настоящее изобретение охватывает терапевкомпозиции настоящего изобретения, относится к тические композиции, используемые для практифизически дискретным единицам, используемым ческой реализации описанных терапевтических в качестве единичных дозировок для субъекта, способов Терапевтические композипричем каждая единичная дозировка содержит ции настоящего изобретения содержат физиолоопределенное количество активного материала, гически переносимый носитель совместно с аурзрассчитанное с целью достижения желаемого теанатагонистом, растворенный или диспергированрапевтического эффекта совместно с требуемым ный в нем в качестве активного ингредиента Соразбавителем, например носителем или связуюгласно предпочтительному воплощению, композищим Согласно одному из предпочтительных реция аурз-антагониста не является иммуногенной шений изобретения, как показано в Примерах, при применении на млекопитающих или людях в аурз-антагонист применяют внутривенно в виде терапевтических целях единичной дозы Используемые в тексте термины "фармацевтически применимый", "физиологически переноКомпозиции изобретения применяют спососимый" и их грамматические варианты, в той мебом, совместимым с формой дозировки, и в тераре, в которой они относятся к композициям, певтически эффективном количестве Количество, носителям, разбавителям и реагентам, являются подлежащее применению и длительность примевзаимозаменяемыми и означают, что такие матенения зависят от объекта применения, емкости риалы способны применяться на млекопитающих системы субъекта, способной утилизировать акбез нежелательных физиологических эффектов, тивный ингредиент, и степени желаемого терапевтаких как тошнота, головокружение, желудочные тического эффекта Точные количества активного расстройства и т п ингредиента требуемые для применения зависят от мнения практикующего врача и различны для Приготовление фармакологической композикаждого индивидуума Однако, подходящие дозиции, содержащей активные ингредиенты растворовочные интервалы для систематического приренные или диспергированные в ней, хорошо изменения указаны в описании и они зависят от типа вестно из литературы и не ограничивает типы применения Подходящие режимы применения рецептур Обычно, такие композиции готовят в тоже могут изменяться, но, как правило, произвовиде растворов для инъекций или жидких растводят начальное применение с последующими поров, либо суспензий, однако могут также готовитьвторяющимися дозами с интервалами в один или ся твердые формы пригодные для раствора или более часов с последующей инъекцией или друсуспензии непосредственно в жидкости перед гими применениями Однако, с другой стороны применением Такие препараты могут также предпредусматриваются также непрерывные внутриставлять собой эмульсии венные вливания, достаточные для поддержания Активный ингредиент может смешиватьея с концентрации в крови в интервалах, специфичных эксципиентами, являющимися фармацевтически для in vivo терапии приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом, в количествах, подходящих для испольКак продемонстрировано настоящими примезования в описанных терапевтических методах рами, ингибирование ангиогеназа и регрессия Подходящими эксципиентами могут служить, наопухоли происходят уже на 7 день после начальпример, вода, физиологический раствор, декстроного контактирования с антагонистом Дополниза, глицерин, этанол и т п или их комбинации тельное или пролонгированное воздействие антаКроме этого, если желательно, композиция может гониста предпочтительно в период от 7 дней до 6 содержать небольшие количества вспомогательнедель, предпочтительно в период 14-28 дней ных веществ, таких как смачивающие или эмульВ соответствии с родственным решением гирующие агенты, изменяющие рН буферные приведенные Примеры демонстрируют взаимоагенты и т п , которые повышают эффективность связь между ингибированием аурз и индуцироваактивного ингредиента нием апоптоза в неоваскуляторных клетках, несущих аурз Таким образом, настоящее, изобретение Терапевтическая композиция настоящего изотакже охватывает способы ингибирования апоптобретения может включать фармацевтически приза в неоваскуляторной ткани На практике осущеемлемые соли компонентов Фармацевтически ствлен способ изобретения, включающий ингибиприемлемые соли включают соли присоединения рование ангиогенеза во всех тканях и при кислот /образованные с участием свободных амиусловиях описанных в тексте Заметным различиногрупп полипептида/, которые готовят с помощью ем оказалось лишь начало эффекта, который в таких неорганических солей, как, например, хлослучае апоптоза проявляется быстро, обычно черистоводородная или фосфорная кислоты, или рез 48 часов после контактирования с антагонитаких органических кислот, как уксусная, винная, стом, тогда как ингибирование ангиогенеза и регминдальная и т п Соли приготовленные с участирессия опухоли проявляются более медленно, как ем свободных карбоксильных групп также могут это было указано выше Такое отличие оказывает быть производными таких неорганических основаэффект на терапевтический режим в плане врений, как гидроксиды натрия, калия, аммония, мени применения и желаемого эффекта Обычно, кальция или железа, или таких органических осноприменение в случае апоптоза неоваскулятора ваний, как изопропиламин, триметиламин, 2может проводиться в течение времени от 24 часов этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т п до 4 недель, хотя период от 48 часов до 7 дней Особенно предпочтительными при получении является предпочтительным циклических полипептидных аурз-антагонистов 21 44729 22 являются соли TFA и HCI Представители солей пептиды имеют последовательность, соответстпептидов описаны в Примерах вующую последовательности аминокислотных остатков RGD-содержащей области природного Физиологически переносимые носители хоролиганда аурз, такого как фибриноген, витронектин, шо известны в данной области Примерами жидфактор фон Виллебранда, ламинин, тромбоспонких носителей являются стерильные водные расдин и подобные лиганды Последовательность творы, несодержащие никаких материалов, кроме таких аурз лигандов хорошо известна активных ингредиентов и воды, или содержащие такой буфер, как натрий фосфатный при физиолоТак например, аурз -антагонист-пептид может гическом значении рН, физиологический раствор быть производным любого из природных лиганили то и другое, т е фосфатно-буферный физиодов, хотя предпочтительными являются фибринологический раствор Кроме этого, водные носитеген и витронектин ли могут содержать более одной буферной соли Особенно предпочтительные аурз или такие соли, как смешанные хлориды натрия и антагонисты-пептиды преимущественно ингибикалия, декстрозу, полиэтиленгликоль и другие руют аурз связывание с их природными лигандами растворенные вещества по сравнению с другими интегринами, описанными выше Эти аурз -специфичные пептиды особенно Жидкие композиции также могут содержать предпочтительны, по крайней мере, по причине жидкие фазы в присутствии или в отсутствии вотого, что специфичность на аурз уменьшает возды Примерами таких дополнительных жидких фаз можность нежелательных побочных эффектов, являются глицерин, такие растительные масла, таких как ингибирование других интегринов Иденкак хлопковое масло и эмульсии типа вода в мастификация предпочтительных аурз антагонистовле пептидов, обладающих селективностью на аурз Терапевтическая композиция содержит ангиоможет быть легко осуществлена типичным аналигенез-ингибирующее количество аурз антагониста зом на ингибирование связывания, например, с настоящего изобретения, причем она обычно помощью анализа ELISA, описанного в Примерах формируется так, что содержит, по крайней мере, 0,1%вес антагониста в расчете на общий вес теСогласно одному из воплощений, полипептид рапевтической композиции Весовой процент настоящего изобретения содержит не более 100 представляет собой весовое соотношение ингибиаминокислотных остатков, предпочтительно, не тора к общему весу композиции Так например, более 60 остатков, более предпочтительно, не 0,1%вес представляет собой 0,1 г ингибитора на более 30 остатков Пептиды могут быть линейныЮОг всей композиции ми или циклическими, хотя особенно предпочтительными являются циклические пептиды Е Антагонисты Интегрина аурз аурз-антагонисты используются в настоящих Предпочтительные циклические и линейные методах для ингибирования ангиогенеза в тканях пептиды и их обозначения приведены в Таблице 1 и можно упомянуть большое число форм, вклюи в Примерах чающих соединения, взаимодействующие с аурз Целевой полипептид включает аналог, фрагтаким образом, что они препятствуют функциомент или химическое производное полипептида, нальному взаимодействию с природными аурз чья последовательность остатков аминокислот, лигандами Примерами антагонистов могут слупредставленная в описании свидетельствует о жить аурз аналоги аурз, являющиеся производнытом, что такой полипептид представляет собой ми сайта связывания лиганда на аурз, миметики аурз антагонист Поэтому, полипептид изобретеаурз или природного лиганда аурз, который миния может быть объектом различных изменений, микрирует структурную область, принимающую замещений, вставок и делеций, если такие измеучастие во взаимодействиях связывания аурзнения обеспечивают некоторые улучшения его лиганда, полипептиды имеющие последовательприменения В этом отношении следует отметить, ность, соответствующую домену функционального что аурз антагонист-полипептид изобретения сосвязывания природного лиганда, специфичного к ответствует, а не идентичен последовательности аурз, особенно, соответствующую RGDописанного пептида, в котором произведено одно содержащему домену природного лиганда аурз, a или более изменений и он сохраняет способность также антитела, которые иммунореагируют с аурз функционировать как аурз антагонист в одном или или с природным лигандом, причем все эти вещеболее анализов, как это показано в тексте ства проявляют антагонистическую активность Таким образом, полипептид может присутствовать в любой из большого числа форм пептид1 Полипептиды ных производных, включающих амиды, конъюгаты В соответствии с одним из технических решес белками, циклические пептиды, полимеризованний настоящее изобретение охватывает аурзные пептиды, аналоги, фрагменты, химически моантагонисты в виде полипептидов Полипептиддифицированные пептиды, и аналогичные произный /пептидный/ аурз антагонист может иметь хаводные рактеристики последовательности природного лиганда аурз или самого аурз на участке, приниТермин "аналог" включает любой полипептид, мающем участие во взаимодействии аурз-лиганда имеющий последовательность аминокислотных и проявляет активность аурз-антагониста Предостатков идентичную последовательности специпочтительный аурз антагонист -пептид содержит ально показанной там, где один или более остатRGD трипептид и соответствует по последоваков консервативно заменены на функционально тельности природному лиганду в RGD аналогичный остаток и где проявляется аурз антасодержащей области гонистическая активность Примеры консервативных замен включают замену одного /не-полярного/ Предпочтительные RGD -содержащие поли 23 44729 24 гидрофобного остатка, такого как изолейцин, ваметке твердой матрицы или носителя лин, лейцин или метионин на другой, замену одноМетки, твердые матрицы и носители, которые го полярного /гидрофильного/ остатка на другой, могут использоваться с полипептидами настоящекак это имеет место при замене аргинина на лиго изобретения описаны ниже зин, глутамина на аспарагин, глицина на серии, Линкеры аминокислотных остатков обычно замену одного основного остатка такого, как липредставляют собой, по крайней мере, один остазин, аргинин или гистидин на другой, или замену ток и могут содержать 40 или более остатков, чаодного кислотного остатка, такого как аспарагиноще 1-10 остатков, но они не образуют эпитопов вая кислота или глутаминовая кислота на другой аурз лиганда Типичными аминокислотными остатками, используемыми для связывания являются Фраза "консервативное замещение" также тирозин, цистеин, лизин, глутаминовая и аспаргиподразумевает использование химически деривановая кислоты или другие остатки Кроме этого, тизированных остатков вместо нецелевой полипептид может отличаться, если не дереватизированного остатка при условии, что указано особо, от природной последовательности такой полипептид обладает достаточной ингибиаурз лиганда последовательностью, которая морующей активностью дифицирована ацилированием терминальной Термин "химическое производное" относится к ІЧНг-группьі, например, путем ацетилирования или целевому полипептиду содержащему один или амидированием тиогликолевой кислоты в резульболее остатков, химически дериватизированных тате терминального карбоксиламидирования, напо реакции функциональных боковых групп Такие пример, с помощью аммиака, метиламина, и анадериватизированные молекулы включают, наприлогичными терминальными модификациями мер, те молекулы, в которых свободные аминоТерминальные модификации, как хорошо известгруппы были преобразованы с образованием но, используются для снижения восприимчивости амингидрохлоридов, п-толуол сульфонильных к протеиназному перевариванию и поэтому они групп, карбобензокси групп, трет служат для пролонгирования периода полураспабутилоксикарбонильных групп, хлорацетильных да полипептидов в растворе, особенно в биологигрупп или формильных групп Свободные карбокческих жидкостях, где могут присутствовать просильные группы могут быть преобразованы с обтеазы В этом отношении циклизация полипептида разованием солей, метиловых или этиловых эфитакже является ценным методом терминальной ров, эфиров других типов или гидразидов модификации и она особенно предпочтительна изСвободные гидроксильные группы могут быть за устойчивости структур, полученных в результапреобразованы с образованием О-ацил или Оте циклизации, и из-за биологических активностей, алкильных производных Имидазольный азот гиснаблюдаемых для таких циклических пептидов, тидина может быть дериватизирован с образовакак это отмечается в описании нием N-имбензилгистидина Термином "химические производные" охватываются те пептиды, Любой пептид настоящего изобретения может которые содержат одно или более встречающихся использоваться в виде фармацевтически приемв природе аминокислотных производных двадцати лемой соли Подходящие кислоты, способные обстандартных аминокислот Так, например, пролин разовывать соли пептидов настоящего изобретеможет быть заменен на 4-гидроксипролин, лизин ния, включают такие неорганические кислоты, как на 5-гидроксилизин, гистидин может быть заменен трифторуксусную кислоту /TFA/ хлористоводородна 3-метилгистидин, серии может быть заменен на ную кислоту /HCI/, бромистоводородную кислоту, гомосерин, а лизин может быть заменен на орниперхлорную кислоту, азотную кислоту, тиоцианотин вую кислоту, серную кислоту, фосфоруксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоПолипептиды настоящего изобретения также ту, молочную кислоту, пировиноградную кислоту, включают любой полипептид, имеющий одну или оксалиновую кислоту, малоновую кислоту, янтарболее вставок и/или делеций или остатков с родную кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую ственной полипептиду последовательностью, покислоту, антраниловую кислоту, коричную кислоту, казанной в тексте при условии, что сохраняется нафталинсульфокислоту, сульфанилиновую кинеобходимая активность слоту и т п Особенно предпочтительными являТермин "фрагмент" относится к любому целеются соли НСІ и TFA вому полипептиду, имеющему последовательность аминокислотных остатков более короткую, чем у полипептида, аминокислотная последовательность которого показана в тексте В том случае, когда полипептид настоящего изобретения имеет последовательность, не идентичную последовательности аурз природного лиганда, это означает, что были произведены одна или более консервативных или неконсервативных замещений, обычно в этом случае заменяют не более 30% и, предпочтительно, не более 10% аминокислотных остатков Дополнительные остатки также могут добавляться к любому окончанию полипептида в целях обеспечения "линкера", с помощью которого полипептиды изобретения могли бы соответствующим образом прикрепляться к Подходящие основания, способные образовывать соли с пептидами настоящего изобретения, включают такие неорганические основания, как гидроксид натрия, гидроксид аммония, гидроксид калия и т п , и такие органические основания, как моно-, ди- и три-алкил и ариламины /например, триэтиламин, диизопропиламин, метиламин, диметиламин и т п / и, необязательно, замещенные этаноламины /например, этаноламин, диэтаноламин и т п / Пептид настоящего изобретения, на который также ссылаются, как на целевой пептид может быть синтезирован любым методом, известным специалисту в области полипептидов, например, методами рекомбинантной ДНК Синтетические 25 44729 26 химические методы, например, твердофазные щих циклических пептидов Один из примеров синтезы типа Меррифилда являются предпочтиметодов циклизации пептидов описан Zimmer с тельными по причинам чистоты продукты, антисотр, Пептиды 1992, стр 393-394, ES СОМ Сайгенной специфичности, отсутствия нежелательных енс Паблишере, В У 1993 Обычно защищенный побочных продуктов, простоты выполнения и т п тетрабутоксикарбонилом пептидный метиловый Отличное резюме большинства доступных спосоэфир растворяют в метаноле и добавляют расбов содержится в книге Steward с сотр "Твердотвор гидроксида натрия и смеси дают реагировать фазные пептидные синтезы", W Н Ffeeman, Санпри 20°С с целью гидролитического удаления меФранциско, 1969, работе Bodansky с сотр, "Пептилэфирной защитной группы После выпариватидные синтезы" Джон Вилей энд сане, второе ния растворителя, тетрабутоксикарбонилизд , 1976, J Meienhofter "Гормональные протеины защищенный пептид экстрагируют этилацетатом и пептиды", т 2, стр 46, Академик Пресс /Ньюиз подкисленного водного растворителя Затем Йорк/, 1983, в статье Mernfield Adv Enzymol , тетрабутоксикарбонильную защитную группу уда32 221-96, 1969, Fiels с сотр , Int J Pertide Protein ляют в мягких кислых условиях в диоксановом Res 35 161-214, 1990 и патенте США №4 244 946, Ко растворителе Полученный таким образом нев том, что касается твердофазных пептидных синзащищенный линейный пептид со свободными тезов, и в книге Schroder с сотр , "Пептиды", т 1, амино- и карбокси-концами превращают в соотАкадемик Пресс /Нью-Йорк, 1965, в том что касаветствующий циклический пептид в результате ется классических синтезов в растворе, причем на реакции разбавленного раствора линейного пепвсе эти работы ссылаются в данном описании тида в смеси дихлорметана и диметилформамиПодходящие защитные группы, используемые в да, с дициклогексилкарбодиимидом в присутствии таких синтезах, описаны в приведенных выше ра1-гидроксибензотриазола и N-метилморфолина ботах и в работе J F М McOmie "Защитные группы Полученный в результате циклический пептид в органической химии", Пленум Пресс, Нью-Йорк, затем очищают хроматографией 1973, причем на эти работы также ссылаются в Особенно предпочтительный способ синтеза настоящем описании циклического пептида описан Gurrath с сотр , Eur J Biochem , 210 911-921 /1922/ и упомянут в приКак правило, используемые методы твердомерах Особенно предпочтительными пептидами фазного синтеза включают последовательное для способов изобретения являются o/GrCflFY/ добавление одного или более аминокислотных /последовательность SEQ ІД №4/, c-/RGflfW остатков или подходящим образом защищенных /последовательность SEQ ІД №5/, c-/RAflfV/ аминокислотных остатков к растущей пептидной /последовательность SEO ІД №6/, c-/RGflFy/ цепи Обычно, каждая амино или карбоксильная /последовательность, SEQ ІД №7 и линейный пепгруппа первого аминокислотного остатка защищетид yTAECKPOYTRCflyF /последовательность ны подходящей, селективно удаляемой защитной SEO ІД №8/, где символ "с-" обозначает цикличегруппой ский пептид, заглавные буквы в скобках соответРазличные, селективно удаляемые защитные ствуют однобуквенному коду для L-аминокислоты, группы используются для аминокислот, содержаа строчные буквы в скобках соответствуют однощих реакционноспособную боковую группу, набуквенному коду для D -аминокислот Последовапример для лизина тельности аминокислотных остатков таких пептиС использованием твердофазного синтеза в дов также показаны последовательностями SEO качестве примера, защищенная или дериватизиІД №№ 4,5,6,7 и 8, соответственно рованная аминокислота присоединяется к инертному твердому носителю через незащищенные карбоксильную или аминогруппу Защитную группу амино- или карбоксильной группы затем селективно удаляют и следующую аминокислоту в последовательности с комплиментарной /амино или карбоксильной/ группой, соответствующим образом защищенной смешивают с системой и проводят реакцию в условиях подходящих для образования амидной связи с остатком уже присоединенным к твердой подложке Затем защитную группу амино или карбоксильной группы удаляют из вновь добавленного аминокислотного остатка и следующую аминокислоту /соответствующим образом/ защищенную добавляют к системе и т д После того, как все желаемые аминокислоты связаны в надлежащей последовательности, любые оставшиеся терминальные и побочные группы, а также защитные группы /и твердый носитель/ последовательно или параллельно удаляют с образованием целевого линейного полипептида Полученные в результате линейные полипептиды полученны, например, как описано выше могут реагировать с образованием соответствую 2 Моноклональные антитела Согласно одному из воплощений, в настоящем изобретении описывается аурз антагонист в виде моноклональных антител, которые иммунореагируют с аурз и ингибируют аурз связывание с его природным лигандом, как это показано в тексте В настоящем изобретении также описываются линии клеток, продуцирующие такие антитела, способы продуцирования клеточных линий и способы получения моноклональных антител Моноклональное антитело настоящего изобретения включает молекулы антитела, которые 1/ иммунореагируют с выделенным аурз и 2/ ингибируют связывание фибриногена с аурз Предпочтительные моноклональные антитела, которые преимущественно связываются с аурз включают моноклональное антитело, обладающее иммунореакционноспособными характеристиками т А В LM609, секретированные гибридомной клеточной линией АТСС НВ 9537 Гибридомная клеточная линия АТСС НВ 9537 депонирована в соответствии с требованиями Будапештского договора в Американской коллегии типовых культур /АТСС/, 1301 Паркпаун Драйв, Рокквилл, МД, США, 15 27 44729 28 сентября 1987г ного эпитопа, например биспецифичное моноклональное антитело Термин "антитело" или "молекула антитела" в различных грамматических формах используется Моноклональное антитело обычно состоит из в тексте в качестве коллективного значения, отноантител, продуцированных клонами одной клетки, сящегося к популяции иммуноглобулиновых моленазываемой гибридомой, которая секретирует кул , и/или иммунологических активных частей /производит/ лишь один вид молекулы антитела иммуноглобулиновых молекул, т е молекул, соГибридомная клетка формируется слиянием антидержащих сайт, объединяющий антитело или патело-продуцирующей клетки и миеломы или друрато п гой бессмертной клеточной линии Получение таких антител вначале было описано Kohler и Под термином "сайт объединяющий антитело" Milsten, Nature 256 495-497 /1975/, причем на эту подразумевается, что структурная часть молекулы работу ссылаются в описании Дополнительные антитела, состоит из вариабельных или гиперваспособы описаны Zola моноклональные антитела риабельных участков тяжелых и легких цепей справочник по методам, CRC Пресс, Инк /1987/ специфически связывающих антиген Гибридомный супернатант, полученный таким Примерами антител, используемых в настояобразом, может быть подвергнут отбору на прищем изобретении, могут служить интактные молесутствие молекул антител, иммунореагирующих с кулы иммуноглобулина, частично интактные молеаурз и на ингибирование аурз связывания с прикулы иммуноглобулина и те части молекулы родными лигандами иммуноглобулина, которые содержат паратоп, включая части известные в литературе, как Fab, Короче говоря, для получения гибридомы, из Fab', F/ab'/2 и F/y/ и также относящиеся к фрагменкоторой продуцируют композицию моноклональтам антитела ного антитела, миелому или другую бессмертную клеточную линию сливают с лимфоцитами, полуСогласно другому предпочтительному воплоченными из селезенки млекопитающего, гиперимщению, настоящее изобретение охватывает укомунизированного источника аурз, например, аурз роченную молекулу иммуноглобулина, включаювыделенным из М21 человеческих мелономных щую Fab фрагмент, являющийся производным клеток, как это описано Cheresh с сотр , J Biol моноклонального антитела изобретения Fab Спет 262 17703-17711/1987/ фрагмент, в котором отсутствует Fc рецептор, является растворимым и обладает терапевтичеПредпочтительно, чтобы миеломная клеточскими преимуществами в отношении полураспада ная линия, используемая для получения гибридосыворотки и диагностическими преимуществами в мы, была той же разновидности, что лимфоциты отношении способа применения растворимого Fab Обычно предпочтительным млекопитающим явфрагмента Приготовление растворимого Fab ляются мыши штамма 129 GIX Подходящие для фрагмента обычно известно в области иммунолоцелей изобретения мышиные миеломы включают гии и может осуществляться большим числом мегипоксантин-аминоптерин-тимидинтодов чувствительные /HAT/ клеточные линии РЗХ63Aq8 653 и Sp2 /O-Ag14, которые получены из АмеТак например, Fab и F/аь'/ части /фрагменты/ риканской коллекции типовых культур, Роквилл, антител получают протеолитической реакцией МД под обозначениями CRL 1580 и CRL 1581, сопапаина и пепсина, соответственно, на сущестответственно венно интактных антителах с помощью способов хорошо известных из литературы См например, Спленоциты обычно сливают с миеломными патент США №4342566, выданный на имя клетками с использованием полиэтиленгликоля Theofilopolus и Dixon Части Fab' антитела также /ПЭГ/1500 Слитые гибриды подвергают селекции хорошо известны и могут быть получены из фрагна их чувствительность к HAT Гибридомы, произментов F/ab'/2 с последующим восстановлением водящие моноклональное антитело изобретения, дисульфидных связей, связывающих участки тяидентифицируют с использованием энзимжелых цепей, меркаптоэтанолом, после чего просвязанного иммуносорбентного анализа /ELISA/, водят алкилирование полученного в результате описанного в примерах изобретения протеин-меркаптана таким реагентом, как иодоМоноклональное антитело настоящего изоацетамид Антитела, содержащие целые иммубретения также может быть получено инициироноглобулиновые молекулы являются предпочтиванием моноклональной гидридомной культуры, тельными и их используют, как включающей питательную среду, содержащую проиллюстрировано в тексте гибридому, секретирующую молекулы антитела соответствующей специфичности Культуру выФраза "моноклональное антитело" в различдерживают в таких условиях и в течение такого ных грамматических формах относится к популяпериода времени, которые достаточны для того, ции молекул антител, которые содержат только чтобы гибридома секретировала молекулы антиодну разновидность сайта, объединяющего антитела в среду Затем собирают антителотело, способную иммунореагировать с конкретным содержащую среду Далее, молекулы антитела эпитопом могут быть дополнительно выделены хорошо изТаким образом, моноклональное антитело вестными способами обычно проявляет единое связывающее сродство к любому эпитопу, с которым оно иммунореагируСреды, используемые для получения таких ет Поэтому моноклональное антитело может сокомпозиций, хорошо известны из литературы, выдержать молекулу антитела, имеющую множество пускаются промышленностью и включают синтеантительных комбинирующих сайтов, каждый из тические культурные среды, инбредных мышей и которых иммуноспецифичен в отношении различт п Примерами синтетических сред являются ми 29 44729 30 нимально необходимая среда Дулбекко /ДМЕМ, тел Молекулы антитела, обладающие идентичной Dublbecco с сотр , Virol 8 396, 1959/ дополненная функционально-эквивалентной последовательно4,5гм/л глюкозы, 20мМ глутамина, и 20% сыворотстью аминокислотных остатков в их CflR обласки телячьего плода Примером инбредного мышитях, обладают одинаковой связующей специфичного штамма может служить Ваіь/с ностью Способы установления последовательностей полипептидов хорошо изДругие способы продуцирования монокловестны из литературы нального антитела, гибридомной клетки или гибридомной клеточной культуры также хорошо изИммуноспецифичность антитела, его связуювестны См , например, способ выделения щая емкость в отношении молекулы-мишени, афмоноклональных антител из иммунологического финность антитела в отношении эпитопа, опредерепертуара, описанный Sastry с сотр , Proc Natl ляются эпитопом с которым иммунореагирует Acad Sci USA 86, 5728-5732 /1989/, и Huse с сотр антитело Эпитопная специфичность определяетScience 2461275-1281/1989/ ся, по крайней мере, частично последовательностью аминокислотных остатков вариабельного Настоящее изобретение также охватывает участка тяжелой цепи иммуноглобулинового антигибридомную клетку, и культуры, содержащие тела и частично вариабельным участком легкой гибридомную клетку, вырабатывающую моноклоцепи последовательности аминокислотных остатнальное тело настоящего изобретения Особенно ков предпочтительной является гибридомная клеточная линия, секретирующая моноклональное антиИспользование термина "обладающий специтело тАь LM609, обозначенное как АТСС НВ фичностью связывания" указывает на то, что эк9537 т А ь LM609 было получено как описано вивалентные моноклональные антитела обладают Cheresf) с сотр, J Biol Chem , 262 17703одинаковыми или похожими иммунореакционными 17711/1987/ и это получение также отражено в /связующими/ характеристиками и конкурируют за Примерах изобретения связывание с предварительно отобранной молекулой мишенью Согласно одному из воплощений, настоящее изобретение охватывает моноклональное антитеГуманизированные моноклональные антитела ло, имеющее иммунореакционные характеристики предполагают особые преимущества над мышит А ь LM609 ными моноклональными антителами особенно в том плане, что они могут терапевтически примеМожно также определить без ненужного эксняться на людях Говоря конкретно, человеческие периментирования обладает ли моноклональное антитела не так быстро подвергаются циркуляции, антитело такой же /т е эквивалентной/ специфичкак "инородные" антигены и не активируют иммунностью /иммунореакционными характеристиками/, ную систему тем же образом, что инородные антикак моноклональное антитело изобретения путем гены и инородные антитела Способы получения выяснения того факта, имеет ли место предот"гуманизированных" антител обычно хорошо извращение первым объектом последнего объекта вестных из литературы и могут быть легко примеот связывания с предварительно выбранной монимы к антителам настоящим изобретением лекулой-мишенью Если испытуемое моноклональное антитело конкурирует с моноклональным Таким образом, изобретение предусматриваантителом изобретения, о чем может свидетельет, согласно одному из воплощений, моноклоствовать уменьшение степени связывания монональное антитело, которое гуманизируется трансклональным антителом изобретения в стандартплантацией с целью введения компонентов ных условиях сравнительного анализа на человеческой иммунной системы без существенсвязывание с мишенью-молекулой при реализаных препятствий в отношении способности антиции твердофазного варианта, то существует веротела связывать антиген ятность того, что два этих моноклональных анти3 аурз -Специфичные миметики тела связаны с одним, или близко родственным Настоящее изобретение демонстрирует тот ему, эпитопом факт, что аурз-антагонисты обычно могут использоваться в изобретении, причем такие антагониЕще один путь определения того, обладает ли сты могут включать полипептиды, антитела и друмоноклональное антитело, специфичностью могие молекулы обозначенные, как "миметики", ноклонального антитела изобретения, состоит в которые обладают способностью препятствовать предварительной инкубации моноклонального аурз функции Особенно предпочтительными явантитела изобретения с молекулой-мишенью, с ляются антагонисты, которые специфически прекоторой оно реагирует в обычных условиях с попятствуют аурз функционированию и не являются следующим добавлением испытуемого моноклопомехой функции других интегринов нального антитела для определения факта ингибирования способности испытуемого антитела В этом контексте следует отметить, что больсвязывания молекулы-мишени Если такое ингишое количество реагентов может подходить для бирование имеет место, то по всей вероятности использования в способах изобретения при услооно идентично, или функционально эквивалентно вии, что такие реагенты обладают требуемой биоэпитопной специфичности моноклонального антилогической активностью На такие реагенты ссытела изобретения лаются, как на миметики, поскольку они обладают способностью "подражать" связыванию домена на Еще одним путем определения одинаковой аурз или аурз лиганде, принимающем участие в специфичности моноклонального антитела и мофункциональном взаимодействии рецептора и ноклонального антитела изобретения является лиганда и вследствие этого препятствовать определение последовательности аминокислот/например, ингибировать/ нормальное функциониных остатков CflR -участков сравниваемых анти 31 44729 32 рование других источниках и позже этот анализ был использован для измерения ангиогенеза и неовааурз миметик представляет собой любую москуляризации опухолевых тканей См Ausprunk с лекулу, отличную от антитела или лигандсотр , Am J Panhol, 79 597-618/1975/и Ossonski с производного пептида, которая обладает описансотр , CanserRes 40 2300-2309/1980/ ными выше свойствами Это может быть синтетический аналог пептида, соединение, имеющее Анализ САМ является хорошо известным меформу связующего кармана, указанного выше тодом анализа для in vivo ангиогенеза, поскольку домена, или другая молекула неоваскуляризация ткани имеет место в этом случае и действительные кровеносные сосуды куриСоздание аурз миметиков может осуществного эмбриона прорастают в САМ либо в ткань , ляться любым из большого числа структурнорастущую на САМ аналитических методов создания лекарственных препаратов, известных из литературы, включаюКак продемонстрировано в описании, САМ щих молекулярное моделирование, двумерный анализ иллюстрирует ингибирование неоваскуляядерный магнитный резонанс /2-Д ЯМР/, рентгеризации, основанной на количестве и степени новскую кристаллографию, случайный скрининг роста новых сосудов Кроме этого, легко следить пептида , пептидного аналога или других химичеза ростом любой ткани, трансплантированной на ских полимерных библиотек и другие методы созСАМ, например, опухолевой ткани Наконец, такой дания лекарств анализ особенно ценен поскольку осуществляется внутренний контроль токсичности анализируемой На основании широких структурных данных, системы Куриный эмбрион подвергается воздейпредставленных в настоящем описании, которое ствию любого испытуемого реагента и поэтому показывает, что аурз-антагонист может быть несостояние здоровья эмбриона является указанием большим полипептидом или моноклональным антоксичности тителом, был сделан вывод о наличии двух взаимно различных химических структурах, которые Третий анализ измерения ангиогенеза предразделяют функциональные свойства селективноставляет собой in vivo модель на глазах кроликов го ингибирования аурз, причем структура аурзи на него ссылаются, как на анализ на глазах кроантагониста, используемого в настоящем способе, ликов Такой анализ на глазах кролика подробно не требует такого ограничения, а включает любой описан в других источниках и он дополнительно аурз миметик, упомянутый в описании используется для измерения как ангиогенеза, так и неоваскуляризации в присутствии таких ангиоF Способы идентификации антагонистов аурз генных ингибиторов, какталидомид См D'Amatoc В изобретении также описываются аналитичесотр, Proc Natl Acad Sci 91 4082-4085/1994/ ские способы идентификации кандидатов в аурз антагонисты, предназначенные для использоваКролично-глазной анализ представляет собой ния в методах изобретения В таких способах хорошо известную аналитическую модель in vivo анализа молекулы-кандидаты оцениваются на их ангиогенеза, поскольку процесс неоваскуляризамощность в ингибировании аурз связывания с ции, примером которого является рост кровеноснейтральными лигандами и, кроме этого, оцениных сосудов кролика от края роговой оболочки ваются на мощность в ингибировании ангиогенеза глаза в роговую оболочку легко визуализируется в тканях через обычно прозрачную роговую оболочку глаза В первом анализе измеряется ингибирование прямого связывания природного лиганда с аурз, a Кроме этого, степень и количество стимуляпредпочтительное техническое решение подробно ции или ингибирования неоваскуляризации или описана в Примерах регрессии неоваскуляризации легко может регистрироваться во времени В анализе обычно измеряется степень ингибирования связывания природного лиганда, наКроме этого, кролик может быть подвержен пример, фибриногена с изолированным аурз в действию любого испытуемого реагента, и поэтотвердой фазе методом ELISA му состояние здоровья кролика является свидетельством токсичности испытуемого реагента Такой анализ может также использоваться для идентификации соединений, обладающих В четвертом анализе измеряется ангиогенез в специфичностью на аурз и не ингибирующих прихимерной модели мышь человек и на этот анализ родные лиганды от связывания с другими интегссылаются, как на химерный мышиный анализ ринами Специфичность анализа проверяется Этот анализ подробно описан в других источниках параллельным проведением анализов ELISA, кои этот анализ дополнительно описывается в текгда оба аурз и другие интегрины отбираются консте, как средство для измерения ангиогенеза, некурентно в отдельные аналитические камеры с оваскуляризации и регрессии опухолевой ткани целью определения соответствующих способноСм Jan с сотр J Clin Invest 91 986-996 /1993/ стей к связыванию с природным лигандом, а соХимерный мышиный анализ является ценной единение-кандидат оценивается на способность аналитической моделью для in vivo ангиогенеза, ингибировать соответствующие способности инпоскольку трансплантированная кожа плотно притегринов к соединению с предварительно отовитая в ходе операции напоминает нормальную бранным лигандом Предпочтительные форматы человеческую кожу в гистологическом отношении скринирующего анализа описаны в Примерах и неоваскуляризация ткани, происходящая в системе, включает проращивание действительных Согласно второму методу анализа измеряется человеческих кровеносных сосудов от привитой ангиогенез в куриной хориоаллантоисной мембрачеловеческой кожи в человеческую опухолевую не /САМ/ и на этот анализ ссылаются как на анаткань на поверхности привитой человеческой колиз САМ САМ анализ был описан подробно в 33 44729 34 жи Происхождение неоваскуляризации в человеэтилацетатом Экстракт сушили над Na2SO4, сноческую прививку может быть продемонстрировано ва выпаривали и полученную в результате послеиммуногистохимическим окрашиванием неоваскудовательность BOC-Gly-fl-Afg-Gly-Asp-PheValлятуры человеко-специфичными эндотелиальныОН /SEQ ІД №2/ перемешивали при 20°С в течеми клеточными маркерами ние 2 часов в присутствии 20мл 2N НСІ в диоксане Полученную смесь выпаривали с получением Как продемонстрировано в тексте, химерный последовательности E-Gly-fl-Afg-Gly-ASp-Pheмышиный анализ демонстрирует регрессию неVal-OH /SEQ ІД №3/, которую далее растворяли в оваскуляризации на основе количества и степени смеси 1800мл дихлорметана и 200мл диметилрегрессии роста новых сосудов Кроме этого, легформамида /flMF/ с последующим охлаждением ко осуществлять наблюдение за эффектами в до 0°С После этого, последовательно при переходе роста любой ткани, трансплантированной на мешивании добавляли 0,5г дициклогексилкарбопривитую кожу, например опухолевой ткани Надиимида /ДССІ/, 0,Зг 1-гидроксибензотриазола конец, такой анализ является ценным средством /HOBt/ и 0,23мл N-метилморфолина Полученную поскольку позволяет осуществлять внешний конв результате смесь перемешивали в течение 24 троль токсичности аналитической системы Хичасов при 0°С и затем при 20°С в течение еще 48 мерная мышь подвергается любому испытуемому часов Раствор концентрировали и обрабатывали реагенту и поэтому состояние ее здоровья являсмешанным слоем ионообменника для освобожется индикатором токсичности дения от солей После удаления полученной в Примеры результате смолы фильтрацией, осветленный Следующие ниже примеры, относящиеся к раствор выпаривали и остаток очищали методом изобретению носят иллюстративный характер и, хроматографии, получая циклоЛЗІу-Д-Arg-Gly-Aspразумеется, не ограничивают изобретение Кроме Phe-Val /последовательность SEQ ID №4/ Слеэтого, варианты изобретения, известные в надующие пептиды, перечисленные в Таблице 1 с стоящее время или те, что будут разработаны использованием однобуквенного кода сокращений позже в рамках компетенции специалиста в данаминокислотных остатков и идентифицированные ной области, рассматриваются, как входящие в обозначениями номера пептида, получали аналосферу настоящего изобретения гичным образом цикло/Агд-СІу-АБр-Д-Ргіе- Val/ 1 Получение синтетических пептидов /SEQ ID №5/, цикло/Агд-АІа-АБр-Д-Рпе- Val/ /SEQ Линейные и циклические полипептиды, переID №6/, цикло/Агд-Д-Ala-Asp-Phe-Val/ /SEQ ID №9/, численные в Таблице 1 синтезировали с испольцикло/Агд-СІу-АБр-Ргіе-ДЛ/аІ/ /SEQ ID №7/ Пепзованием стандартных методов твердофазного тид, обозначенный как 66203, имеющий последосинтеза, как это, например, описано Mernfield Adv вательность идентичную последовательности Enzymol , 32 221-96, /1969/ и Pields G B и Noble пептида 62184, отличается от последнего лишь RZ Int J Pertido Protein Res, 35161-214/1990/ тем, что содержит соль НСІ, а не соль TFA, приДва грамма /г/ BOG-Clyy-fl-Arg-Gly-Asp-Pheсутствующую в 62184 В анализе по ингибироваVal-OMe /последовательность SEQ ID №1/ вначанию ангиогенеза в соответствии с примером 7, в ле растворяли в 60 миллилитрах /мл/ метанола, к котором использовали синтетические пептиды, которому добавляли 1,5мл 2N раствор гидроксидй 66203 пептид, содержащий НСІ, оказался нескольнатрия с образованием смеси Такую смесь затем ко более эффективным в ингибировании ангиогеперемешивали в течение 3 часов при 20°С После неза, чем идентичный пептид в TFA выпаривания остаток переносили в воду, подкисляли до рН 3 разбавленной HCI и экстрагировали Таблица 1 № пептида Аминокислотная последовательность SEQ ID № 62181 цикло/GrGDFV/ 4 62184 цикло/RGDfV/ 5 62185 цикло/RADfV/ 6 62187 цикло/RGDFfV/ 7 62880 yTAECKPQVTRGDVF 8 62186 цикло/RaDFV/ 9 62175 цикло/ARGDfL/ 10 62179 цикло/CRGDfL/ 11 62411 TRQVVCDLGNPM 12 62503 GWRNNEALARLS 13 62502 TDVNGDGRHDL 14 * Строчные буквы обозначают D-аминокислоту, Заглавные буквы обознчают L-аминокислоту 35 44729 Пептид, обозначенный номером 69601, имеющий идентичную последовательность последовательности пептида 62185, отличается от последнего тем, что содержит соль HCI, а не соль TFA, присутствующую в 62184 Циклический пептид c-RADfV/69601/, как было показано, ингибирует связывание фибриногена с интегрином аурз и не ингибирует связывание фибриногена с интегринами апьрз и л и Q5pi /Pfaff с сотр J ВюІ Спет 269 20233-20238/1994/ Таким образом, пептид c-RADFV специфичен на аурз 2 Моноклональные антитела М о но тональное антитело LM609, секретированное гибридомой АТСС НВ 9537, было получено с использованием стандартных гибридомных методов, в результате иммунизации выделенной аурз адсорбированного на Сефароза-лентиллектиновых шариках аурз выделяли из человеческих меланомных клеток, обозначены, как М21, и антитело получали в соответствии со способом Cheresh с сотр J ВюІ Спет, 26217703-17711/1987/ М21 клетки были получены д-ром D L Morton /Калифорнийский университет Лос-Анжелеса, Ка/ и выращены в суспензионной культуре в RPMI 1640 культуральной среде, содержащей 2 т М L-глутамина, 50мг/мл гентамицинсульфата и 10% фетальной телячьей сыворотки Было показано, что моноклональное антитело LM609 специфически иммунореагирует с аурз комплексом и не иммунореагирует с ау субъединицей, с рз субъединицей или с другими интегринами 3 Характеристика тканевого распределения аурз экспрессии А Иммунофлуоресцения с анти-интегрин рецепторными антителами В ходе заживления ран основные мембраны кровеносных сосудов экспрессируют несколько адгезивных протеинов, включающих фактор фон Виллебранда, фибронектин и фибрин Кроме этого, некоторые члены интегринового семейства адгезионных рецепторов экспрессируются на поверхности культивированных гладких мышц и эндотелиальных клеток См Cheresh Proc Natl Acad Sci USA 84 6471 /1987/, Janat с сотр, J Cell Physiol 151 588 /1992/, а также Chend J Cell Physiol, 139 275 /1989/ Среди этих интегринов присутствуютаурз эндотелиальный клеточный рецептор фактора фон Виллебранда, фибриноген /фибрин/ и фибронектин согласно Cheresh Proc Natl Acad Sci USA 846471/1987/ Эти интегрины инициируют кальцийзависимый сигнальный путь, ведущий к миграции эндотелиальных клеток, и, поэтому, по-видимому они играют фундаментальную роль в биологии сосудисных клеток в соответствии с Zeavelsey с сотр , J Cell ВюІ, 121 163/1993/ Для исследования экспрессии аурз в ходе ангиогенеза, человеческую раневую грануляционную ткань или соседнюю нормальную кожу получали от пациентов-добровольцев, промывали 1мл фосфатного буфферного раствора и вводили в О Т С среду /Ткань Тек/ Внедренные ткани замораживали в жидком азоте на 30-45 секунд Секции толщиной шесть микрон вырезали из замороженных блоков на криостатном микротоме для последующего иммунопе 36 роксидазного окрашивания с антителами, специфичными к рз интегринам / аурз или апьрз/ или pi подсемейству интегринов Результаты окрашивания нормальной человеческой кожи и раневой грануляционной ткани представлены на фиг1А - 1Д Моноклональные антитела АРЗ и LM534, направленные к рз и pi интегринам, соответственно, использовали для иммуногистохимического анализа замороженных секций Эксперименты с тканью от четырех различных человеческих доноров дали идентичные результаты Фотомикрографии приведены при увеличении в ЗООраз аурз интегрин обильно экспрессировался на кровеносных сосудах в грануляционной ткани /фиг1В/, но не детектировался в дермисе и эпителии нормальной кожи того же донора /фиг1А/ В отличие от этого, аурз интегрины обильно экспрессируются на кровеносных сосудах и стромальных клетках как на нормальной коже /фиг 1С/, так и на грануляционной ткани /фиг 1Д/ и, как предварительно показано и описано Adams с сотр, Cell, 63 425/1991/, на базальных клетках внутри эпителия В Иммунофлуоресценция в присутствии антилигандных антител Дополнительные участки человеческой нормальной кожи и грануляционных тканей, полученных выше подвергали также исследованию на присутствие лигандов рз и pi интегринов, фактора фон Виллебранда и ламинина, соответственно Фактор фон Виллебранда оказался локализованным на кровеносных сосудах нормальной кожи /фиг 2А/ и грануляционной кожи, /фиг2В/, тогда как ламинин был локализован на всех кровеносных сосудах, а также эпителиальной основной мембраны в обоих препаратах ткани /фиг 2С и 2Д/ С Распределение анти аурз антител на раковых тканях Помимо проведенных выше анализов, биопсии раковой ткани человека также исследовали на присутствие и распределение аурз Ткани получали, как описано в Примере 1А за исключением того, что их окрашивали моноклональным телом LM609, полученным в Примере 2, специфичным на интегриновый рецепторный комплекс аурз Кроме этого, также, получали опухоли для микроскопического гистологического анализа путем фиксации представителей опухолей в Bulms Fixative в течение 8 часов и серийные секции вырезали и окрашивали Н Результаты иммунопероксидазного окрашивания пузырьков, а также раковых тканей толстой кишки, грудной железы и легких представлены на фиг ЗА - ЗД, соответственно аурз обильно экспрессировались лишь на кровеносных сосудах, присутствующих в четырех раковых биопсиях, подвергнутых анализу, и ни на каких-либо других клетках присутствующих в ткани Таким образом, описанные результаты показывают, что аурз интегриновый рецептор селективно экспрессируется на тканях специфических типов, а именно, грануляционных, метастатических тканях и других тканях, в которых имеет место ангиогенез и в нормальных тканях, в которых образование новых кровеносных сосудов прекращено Поэтому такие ткани представляют собой 37 44729 38 идеальную мишень для терапевтических ассвязующие сайты на пластине блокируются пектов изобретения 10мг/мл альбумина бычьей сыворотки /BSA/ в Трис-буферном растворе Для изучения ингибиро4 Идентификация аурз -специфических синтевания различные концентрации пептидов, указантических пептидов, детектируемых лигандных в Таблице 1, испытывали на способность блорецепторным связыванием кировать связывание 125| витронектина или 125|Синтетические пептиды, полученные в Примефибриногена с интегриновыми рецепторами аурз ре 1, подвергали скринингу, измеряя их способи а-иьрз Хотя такие лиганды демонстрируют оптиность антагонизировать аурз и а-иьрз рецепторную мальное связывание с конкретным интегрином, связующую активность в анализах на связывание витронектином в случае аурз и фибриногеном в между очищенным лигандом и рецептором Метод случае а-иьрз исследования ингибирования связытакого изучения связывания описан Barbas с сотр , вания с использованием пептидов с целью блокив Proc Natl Acad Sci , USA 90 10003-10007 ровки связывания фибриногена с любым рецепто/1993/, Smith с сотр J Biol Chem , 265 11008ром позволяют точно определить количество 11013 /1990/ и Pfaff с сотр, J Biol Chem, микромолей пептида, необходимое для половин269 20233-20238 /1994/, причем на содержание ного ингибирования связывания рецептора с лиэтих работ ссылаются в настоящем изобретении гандом Радиомеченные лиганды использовали в В настоящем описании описывается способ концентрациях порядка 1нМ и связывание вызыидентификации антагонистов в анализе лигандвалось отдельно немеченными синтетическими рецепторного связывания, в котором рецептор пептидами иммобилизован на твердой подложке, а лиганд и антагонист находятся в растворенном состоянии Через три часа инкубации свободный лиганд Описывается также анализ на лигандудаляли промывкой, а связанный лиганд детектирецепторное связывание, в котором лиганд имморовали гамма подсчетом Данные анализов, в кобилизован на твердой подложке, а рецептор и торых отобранные циклические пептиды перечисантагонисты находятся в растворенном состояленные в Таблице 1, использовали для нии ингибирования связывания рецепторов и радиомеченного фибриногена с отдельно иммобилизоВкратце, отобранные очищенные интегрины ванными аурз и а-иьрз рецепторами были высоко по отдельности иммобилизуют в лунках для миквоспроизводимыми при ошибке между полученротитрования Titertek, при концентрации покрытия ными значениями обычно ниже 11% Данные ICso 50 нанограммов /г|г/ на ампулу Метод очистки в микромолях ЛСбомкМ выражали , как среднее рецепторов, используемых в анализах на лигандзначение из двух измерений ± стандартное отклорецепторное связывание, хорошо известен из линение, как это показано в Таблице 2 тературы и может быть легко осуществлен специалистами в данной области После инкубирования в течение 18 часов при 4°С, неспецифичные Таблица 2 № пептида аурз ЛС5оМкМ/ ацЬрз/1С5оМкМ/ 62181 1 96 + 0,62 14 95 + 7 84 62184 0 05 + 0,001 0,525 + 0,10 62185 0,885 + 0,16 100 + 0,001 62187 0 05 + 0,001 0,26 + 0,056 62186 57,45 + 7 84 100 + 0,001 62175 1,05 + 0,07 0,63 + 0,18 62179 0,395 + 0 21 0 055 + 0,007 Таким образом, RGD -содержащие или RGD дереватизированные циклические пептиды 62181, 62184, 62185 и 62187, каждый из которых содержит один D-аминокислотный остаток, демонстрируют преимущественное ингибирование фибриногенного связывания с аурз рецептором, как измерено низкой концентрацией пептида, требуемой для полумаксимального ингибирования, по сравнению с этой величиной для а-иьрз рецептора В отличие от этого RGD -содержащие или RGDдериватизированные пептиды 62186, 62175 и 62179 либо не столь эффективны в блокировании фибриногенного связывания с аурз или демонстрируют преимущественное ингибирование фибриногенного связывания с а-иьрз по сравнению с аурз Эти результаты находятся в соответствии с недавно опубликованными Pfaff с сотр J/ Biol Chem , 2690233-20238 /1994/, в которых циклический пептид RGDFV / где F обозначает D аминокислотный остаток/ специфически ингибировали связывание фибриногена с интегрином аурз, а не с а-иьрз или aspi интегринами Аналогичные анализы по ингибированию связывания проводились с линеаризованными пептидами, имеющими или не имеющими RGD мотив, последовательности которых являются производными ay рецепторной субъединицы, апь рецепторной субъединицы или последовательностей аминокислотных остатков витронектинового лиганда Последовательности линейных пептидов, 62880 /V N-производные аминокислотные остатки 3549/, 62411 /ay-производные аминокислотные ос 39 44729 40 татки 676-687/, 62503 /ay-производные аминокиссвязывания либо витронектина /V N/, или фибрилотные остатки 655-667/ и 62502 /ау-производные ногена /FG/ с а-иьрз и л и Qvp3 Значения ICso, ырааминокислотные остатки 296-306/ перечислены в женные в микромолях /ICso мкМ/ индивидуального Таблице 1 Каждый из таких пептидов использоанализа каждого эксперимента представлены в вали в отдельных анализах для ингибирований Таблице 3 Таблица 3 № пептида ацЬрз/1С5оМкМ/ аурз /IC50MKM/ FG V N FG V N 62880 4,2 0,98 01 0,5 62411 100 100 100 100 62503 100 100 100 100 62502 90 5 100 100 Результаты анализов по ингибированию лигандного связывания выбранных интегриновых рецепторов с линеаризованными пептидами показывают, что лишь пептид 62880 эффективен при ингибирований полу-максимального связывания FG или V N с аурз, что измерено низкой концентрацией пептида, требуемого для полумаксимального ингибирования по сравнению с апьрз рецептором Никакой другой из линеаризованных пептидов не был эффективен в блокировке лигандного связывания с аурз хотя пептид 62502 оказался эффективным в блокировке V N связывания с апьрз Таким образом, описанный в тексте лигандрецепторный анализ может использоваться для скрининга как кольцевых, так и линеаризованных синтетических пептидов, проявляющих селективную специфичность в отношении конкретного интегринового рецептора, особенно аурз при их использовании в качестве витронектиновых рецепторных /аурз/ антагонистов при практической реализации изобретения 5 Характеристики необработанной хориоаллантоисной мембраны цыпленка/САМ/ А Получение САМ Ангиогенез может индуцироваться на хориоаллантоисной мембране цыпленка /САМ/ после нормального эмбрионального ангионенеза, приводящего к образованию зрелых кровеносных сосудов Было показано, что ангиогенез индуцируется в ответ на специфический цитокинез фрагментов опухоли, как описано Zeibovich с сотр , Nature, 329 630/1987/и Ausprunkc сотр Am J Pathol, 79 597/1975/ САМ получали из цыплячьих эмбрионов с целью последующего индуцирования ангиогенеза и его ингибирования, как описано в примерах 6 и 7 Десятидневные куриные эмбрионы получали с птицеводческой фермы МакИнтайр /Лэйксайд, КА/ и инкубировали при 37°С при 60% влажности Небольшое отверстие проделывали в оболочке на конце яйца непосредственно над воздушным мешочком с использованием небольшой дрели /Дремел, Отделение Эмерсон электрик Ко , Расайн WI/ Второе отверстие просверливали на широкой стороне яйца в области, лишенной эмбрионных кровеносных сосудов, что было установлено предварительной проверкой яйца на свет К исходному отверстию прилагали отрицательное давление, что приводило к вытягиванию САМ /хориоаллантоисная мембрана/ из мембраны оболочки и созданию ложного воздушного мешочка над САМ Квадратное окно размером 1,0 х 1,0см вырезали в оболочке над САМ с использованием размалывающего колеса небольшой модели /Дремел/ Небольшое окошко позволяло осуществлять непосредственный доступ к находящемуся внизу САМ Полученный в результате препарат САМ использовали либо через 6 дней эмбриогенеза, стадии отличающейся активной неоваскуляризацией без дополнительной обработки с образованием САМ отражающей модель используемую для оценки эффектов эмбрионнои неоваскуляризации, или использовали через 10 дней эмбриогенезиса, когда ангиогенез начинал убывать Последний препарат таким образом использовали в изобретении для индуцирования нового ангиогенеза в ответ на цитокиновую обработку или контакт с опухолью, как это описано в Примере 6 В Гистология САМ Для анализа микроскопической структуры САМ куриных эмбрионов и/или человеческих опухолей, которые подвергали резекции из куриного эмбриона, как описано в примере 8, САМ и опухоли получали для изготовления срезов в замороженном состоянии, как описано в Примере ЗА Шестимикроновые срезы /по толщине/ вырезали из замороженных блоков на криостатном микротоме для иммунофлуоресцентного анализа На фиг 4 представлена типичная фотомикрография площади, лишенной кровеносных сосудов в необработанном САМ через 10 дней Ангиогенез в САМ-системе уменьшался на этой стадии эмбриогенеза, систему использовали в изобретении для стимуляции продуцирования новой сосудистой системы из существующих сосудов от соседних участков в участки, где САМ лишен каких-либо сосудов С Профили интегринов в САМ, детектируемой методом иммунофлуоресценции Для определения распределения ткани интегриновых рецепторов присутствующих в САМ тканях, б-микронные замороженные срезы опухолевой ткани и тканей САМ куриного эмбриона фиксировали в течение 30 секунд в ацетоне и окрашивали методом иммунофлуоресценции 10 41 44729 42 микрограмм/миллилитр /мкг/мл/ mAB CSAT, монозамораживали и бмкм криостатные срезы фиксиклональным антителом специфичным к рі интегровали ацетоном и окрашивали методом иммуриновой субъединице в соответствии с описанным нофлуоресценции, как описано в примере 5С, Buck с сотр , J Cell Biol, 107 2351/1988/ и таким 10мкг/мл анти-рі моноклонального антитела CSAT образом использовали для контрольных образцов или LM609 или LM609 в соответствии с методикой примера 2 Иммунофлуоресцентная фотомикрография на Первичное окрашивание сопровождалось окрашифиг5С показывает усиленную экспрессию аурз в ванием 1 250 разбавлением меченного вторичного ходе pFGF-индуцированного ангиогенеза на куриантитела козьего анти-мышиного родамина /Тадо/ ной САМ в контрасте с отсутствием аурз экспресс целью детекции первичного иммунореактивного сии в необработанных куриных САМ, как это покапродукта Затем такие срезы анализировали на зано на фиг5В аурз легко детектируется на микроскопе Цейса в присутствии иммунофлуоресбольшинстве /75 - 80%/ сосудов pFGFцирующего соединения обработанных САМ Кроме этого, экспрессия интегрина pi не изменяется относительно экспресРезультаты иммунофлуоресцентного анализа сии, наблюдаемой в необработанных САМ, попоказывают, что зрелые кровеносные сосуды прискольку pi также легко детектируется на сутствуют в необработанном 10-дневном курином стимулированных кровеносных сосудах эмбрионе, экспрессирующем субъединицу интегрина [Зі /фиг5А/ В отличие от этого, в серийном Относительную экспрессию аурз и рі интегрисрезе ткани, показанном на фиг 5А не обнаружено нов далее определяли количественно в ходе иммунореактивности в присутствии LM609 pFGF-индуцированного ангиогенеза с помощью /фиг5В/ Таким образом, интегрин аурз детектианализа лазерного конфокального изображения руемый LM609 антителом активно не экспрессиСАМ криостатных срезов Затем окрашенные среруется зрелыми кровеносными сосудами, присутзы анализировали на лазерном конфокальном ствующими в 10-дневном необработанном микроскопе Цейса Двадцать пять сосудов, окракурином эмбрионе Как показано в модели САМ и шенных LM609, и 15, окрашенных CSAT, /средний следующих примерах, хотя кровеносные сосуды размер - 1200мм2, интервал размеров - 350 подвергаются новому росту в ходе нормального 3500мм2/ выбирали из случайной партии и средэмбриогенеза или индуцируются цитокинами или нюю родаминовую флуоресценцию для каждого опухолью, кровеносные сосуды экспрессируют сосуда в расчете на единицу площади измеряли в аурз Однако, после активного процесса неоваскупроизвольных единицах методом анализа лазерляризации, развитие сосудов прекращается и эксного конфокального изображения Полученные прессия аурз уменьшается до уровней, не детекданные выражали, как среднюю интенсивность тируемых иммунофлуоресцентным анализом флуоресценции в произвольных единицах сосудов Такая регуляция аурз экспрессии в кровеносных ± стандартная ошибка /SE/ сосудах, подвергаемых ангиогенезу, контрастиРезультаты, представленные на фиг 6 покарующая с отсутствием экспрессии в зрелых сосузывают, что окрашивание аурз, существенно усидах, обеспечивает уникальную способность налено /примерно в 4 раза/ на САМ, обработанных стоящего изобретения контролировать и pFGF в соответствии с определением методом ингибировать ангиогенез, как это показано в слеWilcoxon Rank Sum test /P 50% уменьшение инфильтрации кровеносных сосудов САМ непосредственно под дисM21L человеческаая меланомная клеточная ком Эксперименты повторяли четыре раза в раслиния, UCLAP-3 человеческая легочная карцичете на антитело в присутствии 6 - 7 эмбрионов в номная клеточная линия, FG клеточная линия зависимости от условий карциномы поджелудочной железы или НерЗ человеческая ларингеальная карциномная клеточная линия, все аурз отрицательные, использовали для выращивания твердых человеческих опухолей на САМ куриного эмбриона Суспензию в виде отдельных клеток 8 х 106М21-1 UCLAP-3 и FB или 5 х 105 НЕрЗ клеток вначале применяли на САМ в общем объеме 30 микролитров стерильной Результаты влияния mAB обрабатывали на / pFGF-индуцированный ангиогенез представлены на фиг8А - 8В Необработанный САМ-препарат, лишенный кровеносных сосудов, показан на фиг8А с целью сравнения с pFGF-кровеноснососудистой индукцией, показанной на фиг 8В, а на фиг8С - 8Е показано влияние действия мАь Око 45 44729 46 ло 75% таких САМ обработанных т А ь LM609 проблюдается вредной цитотоксичности в отношении являли > 50% ингибирование ангиогенеза, как это окружающей площади показано на фиг8Е, и во многих образцах не наАналогичные анализы были осуществлены с блюдалась инфильтрация сосудов В отличие от использованием других синтетических пептидов, этого, буферный контроль /фиг8А/ и диски, обраполученных в Примере 1 и перечисленных в Табботанные мАь CSAT /фиг 8С/ и P3G2 /фиг 8Д/ полице 1 казали обширную васкуляризацию В Ингибирование ангиогенеза, индуцированИдентичные результаты были получены при ного фактором роста в результате внутривенного индуцировании ангиогеназа с помощью TNFa Для применения ингибиторов изучения эффектов тех же антител на предвари1/ Обработка моноклональными антителами тельно существующие зрелые кровеносные сосуЭффект на ангиогенез, индуцированный факды, присутствующие в результате нормального их тором роста, моноклональных антител, внутриразвития по соседству с участками, лишенными венно инъектированных в САМ препараты, также сосудов, фильтровальные диски, насыщенные оценивался в отношении использования в намАь, помещали на сосудистые участки САМ 10стоящем изобретении дневных эмбрионов, на которых не проводили Получение куриных эмбрионных САМ для местное применение цитокина Ни один из трех внутривенных инъекций проводилось практически мАь не воздействовал на преварительно сущестаналогично методике Примера 7А при некоторых вующие сосуды о чем свидетельствовало визумодификациях В ходе проверки яиц на свет рельальное наблюдение с помощью стереомикроскоефные кровеносные сосуды подвергали отбору и па Так мАь LM609 селективно ингибирует только на оболочке яйца ставили метки для указания их рост новых кровеносных сосудов и не влияет на положения В скорлупе просверливали отверстия зрелые кровеносные сосуды присутствующие на и в них загружали САМ, а pFGF-насыщенные соседних площадях Тот же эффект наблюдался фильтровальные бумаги помещали на САМ, как при применении синтетических пептидов локально описано выше Окна закрывали стерильной ленили внутривенно, как это описано в примерах 7А2/ той и эмбрионы помещали в инкубатор Через 24 и 7Е2/, соответственно часа второе небольшое окошко тщательно вырезали в боковой стороне яичной скорлупы непо2/ Обработка синтетическими пептидами средственно над выступающими кровеносными САМ-анализы также осуществлялись с помососудами, отобранными ранее Тщательно удалящью синтетических пептидов изобретения с целью ли внешнюю яичную скорлупу, оставляя незатроопределения влияния циклических и линеаризонутыми эмбрионные мембраны Мембранную ванных пептидов на ангиогенез, индуцированный оболочку делали прозрачной с помощью небольфактором роста Такие пептиды готовили как опишой капли минерального масла /Перкин-Элмер сано в Примере 1 и 80мкг пептида помещали в Корп , Норволк, СТ/, что позволяет легко визуалиобщий объем в 25мкл стерильного HBSS Пептидзировать кровеносные сосуды Очищенные стеный раствор применяли на САМ-препарате нерильные мАь, или синтетические пептиды, помедленно и затем снова через 24 и 48 часов Чеследние из которых описаны ниже, инокулировали рез 72 часа фильтровальную бумагу и непосредственно в кровеносные сосуды с помоокружающую САМ ткань отсекали и наблюдали, щью иглы 30 калибра при дозе 200мкг IgG- на эмкак описано выше брион в общем объеме в ЮОмкл стерильной PBS Результаты такого анализа были аналогичны Окна заклеивали лентой и эмбрионам давали интем, что показаны на фигЭА - 9С, как описано в кубироваться в течение 72 часов ФильтровальПримере 7Е2/ где синтетические пептиды внутриные диски и окружающие САМ ткани анализировенно вводили в кровеносные сосуды, индуцировали, как описано выше ванные опухолью В присутствии контрольного пептида 62186, pFGF-индуцированные кровеносДля определения локализации LM609 в САМ ные сосуды оставались незатронутыми, как покатканях или в опухолевых тканях, как показано в зано на фигЭА В отличие от этого, при применетексте и следующих примерах, которые предваринии на фильтре циклического RGD пептида, тельно инокулировали внутривенно LM609, фик62814, образование кровеносных сосудов ингибисированные срезы блокировали 2,5% BSA в HBSS ровалось, оставляя площадь, лишенную новой в течение 1 часа при комнатной температуре с сосудистой системы Этот эффект по внешним последующим окрашиванием 1 250 разбавлением признакам аналогичен эффекту, показанному на козьего анти-мышиного родамин-меченого втофигЭВ, как это описано в примере 7Е2/, ниже ричного антитела /Тадо/ Затем срезы анализироКроме этого, также, как показано на фигЭС, для вали с помощью иммунофлуоресцентного микрослучая внутривенно инъецированных пептидов, на скопа Цейса площадях, где зрелые кровеносные сосуды нахоРезультаты внутривенной обработки антитедились достаточно далеко от расположения лом индуцированных pFGF кровеносных сосудов фильтра, насыщенного фактором роста, эффект САМ препаратов представлены на фиг 10А - ЮС от местного применения синтетических пептидов На фиг 10А показан ангиогенез, индуцированный в не наблюдался на таких основных сосудах Таким результате обработки pFGF Как видно из фиг 10В образом, ингибиторная активность пептидов в не наблюдается изменений относительно присутотношении ангиогенеза ограничена участками ствия pFGF индуцированной сосудистой системы ангиогенеза, индуцированными факторами роста, при внутривенном воздействии на мАь P3G2, ани при этом не затрагиваются соседние предварити- аурз-антитело В отличие от этого, обработка тельно существующие зрелые сосуды и не наСАМ препарата ангиогенезиндуцированного pFGF 47 44729 48 с помощью LM609, анти- аурз антителом, привоментах при концентрациях 25мкг в 25мкл HBSS и дит в результате к полному ингибированию роста затем окна заклеивали лентой Снова добавляли новых сосудов в фильтровальную область, как это мАь тем же способом через 24 и 48 часов Через показано на фиг ЮС Ингибирующее влияние на 72 часа опухоли и окружающие САМ ткани аналиангиогенез, таким образом, является результатом зировали в соответствии с методикой примера ингибирования аурз рецепторной активности под 7А1 воздействием LM609 анти-аурз-специфичного анКак описано в примере 6С, опухоли начально титела Поскольку блокировка аурз не ингибирует получали трансплантацией культивированных образование сосудистой системы в САМ фильтM21-L клеток, которые не экспрессировали интегрующем сайте, аурз не является существенным рин аурз как это описано Feldmg-Habermann с компонентом по сравнению с аурз в отношении сотр, J Clm Invest, 89 2018 /1992/ на САМ 10роста новых сосудов дневного куриного эмбриона Такие аурз негативные фрагменты индуцировали обширную неова2/ Обработка синтетическими пептидами скуляризацию в присутствии только буфера, или Синтетические пептиды, полученные в ПримАь CSAT /анти-р/, либо P3G2 /анти- a v p 5 / В отмере 1, по отдельности внутривенно инъецироваличие от этого мАь LM609 /анти-аурз/ снимали ли в кровеносные сосуды, индуцированные факинфильтрацию большинства сосудов в опухолетором роста в САМ препаратах, как описано выше вой массе и окружающей САМ Влияние пептидов на жизнеспособность сосудов оценивали аналогичным образом С целью количественного определения влияС Ингибирование эмбрионного ангиогенеза ния мАь на ангиогенез, индуцированный опухопутем местного применения лью, кровеносные сосуды, входящие в опухоль в рамках фокусной плоскости САМ подсчитывали с 1/ Обработка моноклональными антителами помощью стереомикроскопа двумя наблюдателяДля определения факта участия аурз в эмбрими двойным слепым /double-blind/ методом Кажонном ангиогенезе влияния LM609 на de novo рост дая полоса данных на фиг 12 представлят собой кровеносных сосудов на САМ изучали на 6среднее число сосудов +SE от 12 САМ в каждой дневных эмбрионах, т е на стадии, отмеченной группе дублированных экспериментов активной неоваскуляризацией, в соответствии с описанным в Примере 5А САМ анализ проводили Такой количественный анализ обнаруживает в соответствии с методикой примера 6С с послетрех-кратное понижение числа сосудов, входящих дующим местным применением дисков, насыщенв опухоль, обработанную мАь LM609 по сравненых мАь, помещенных на САМ 6-дневных эмбрионию с опухолями, обработанными буфером или нов в отсутствие цитокинов Через 3 дня САМ другими мАь, P3G2 или CSAT /P < 0,0001/ в соотподвергали резекции и фотографировали Каждый ветствии с разрядным суммарным тестом Вилкокэксперимент включал 6 эмбрионов на группу и сона Тот факт, что М21-1 опухоли не экспрессиповторяли 2 раза руют аурз указывает на то, что mAB LM609 ингибирует ангиогенез - непосредственным возВ таких условиях антититело LM609 /фиг 11 С/, действием на кровеносные сосуды, а не на опухоно не CSAT/фигИА/ или РЗС2/фиг11В/, предотлевые клетки Эти результаты согласуются с гисвращали сосудистый рост, это указывает на то, тологическим распределением аурз в раковой что аурз играет существенную роль в эмбрионной тканевой биопсии, представленной на фиг ЗА - ЗД, неоваскуляризации, которая не зависит от добавгде распределение аурз ограничено кровеносными ленного фактора роста для индукции ангиогенеза сосудами в опухоли, а не самими клетками опухо2/ Обработка синтетическими пептидами ли Синтетические пептиды, полученные в примере 1, по отдельности добавляли в эмбрионный САМ препарат, полученный выше, в соответствии с описанным в Примере 5А2/, путем местного применения на САМ или внутривенного применения на кровеносных сосудах Влияние пептидов на жизнеспособность сосудов оценивали аналогичным образом Д Ингибирование ангиогенеза индуцированного опухолью в результате местного применения 1/ Обработка моноклинальными антителами Помимо описанного выше анализа на ангиогенез, в котором оценивали влияние анти-аурзантагонистов, LM609 и пептидов 62181, 62184, 62185, 62187 и 62880 на эмбрионный ангиогенез, исследовали также роль аурз в ангиогенезе, индуцированном опухолью В качестве индуктора использовали аурз негативные человеческие M21-L меланомные фрагменты, предварительно выращенные и выделенные из САМ 17-дневного куриного эмбриона Эти фрагменты получали в соответствии с методикой примера 6С Как описано выше в Примере 7А1, мАь раздельно локально применяли на опухолевых фраг 2/ Обработка синтетическими пептидами Синтетические пептиды, полученные в примере 1, локально применяли на опухольиндуцированной ангиогенной САМ аналитической системе в соответствии с описанным выше Аналогичным образом оценивали влияние пептидов на жизнеспособность сосудов Е Ингибирование ангиогенеза, индуцированного опухолью с помощью внутривенного применения 1/ Обработка моноклональными антителами Опухоль-индуцированные кровеносные сосуды, полученные согласно методике примера 7Д1, также обрабатывали мАь, применяемой путем внутривенной инъекции Опухоли помещали на САМ, как описано в Примере 7Д1, и окна заклеивали лентой и спустя 24 часа 200мкг очищенного mAB инокулировали внутривенно в кровеносные сосуды куриного эмбриона, как это описано выше Затем куриные эмбрионы инкубировали в течение 7 дней Затем степень ангиогенеза наблюдали, как описано выше Как описано в примере 8, ниже, после этого периода времени, опухоли подверга 49 44729 50 ли резекции и анализировали их вес для опредеангиогенез, индуцированный фактором роста или ления влияния воздействия антитела на рост или опухолью, эффект антагонистов также оценивали подавление опухоли измерением любых изменений опухолевой массы после воздействия Для такого анализа САМ ана2/ Обработка синтетическими пептидами литическая система ангиогенеза, индуцированноОценивали также влияние воздействия пептиго опухолью, была получена как описано в Примеда на сосудистую систему, индуцированную опуре 6С и 7Д К концу 7-го дня инкубационного холью в САМ аналитической системе Опухолевопериода полученные в результате опухоли подСАМ препарат использовали, как описано выше за вергали резекции от САМ и обрезали от любой исключением того, что вместо внутривенной инъоставшейся САМ ткани, промывали 1мл фосфатекции мАь синтетические пептиды, полученные в ного буферного физиологического раствора и для соответствии с методиками примера 1 и примера каждой опухоли определяли вес во влажном со7А2, по отдельности внутривенно инъецировали в стоянии видимые кровеносные сосуды Результаты САМ анализа в присутствии циклического пептида 66203, содержащего НСІ-соль, и контрольного пептида 62186 представлены на фигЭА - 9С Из фигЭА видно, что обработка контрольным пептидом не оказывает влияния на обильное образование крупных кровеносных сосудов, которые индуцируются обработкой опухолью с ростом в области первоначально лишенной кровеносных сосудов САМ В отличие от этого в том случае,когда циклический RGD пептид, 66203, антагонист на аурз применяли на фильтре, образование кровеносных сосудов ингибировалось, оставляя площадь, лишенную новой сосудистой системы, как это показано на фигЭВ Ингибирующий эффект RGD-содержащего пептида был специфичным и локализованным, о чем свидетельствует отсутствие каких-либо нежелательных эффектов, касающихся сосудов, расположенных по соседству с расположением опухоли Так, согласно фигЭС, в том случае, когда ингибиторные пептиды внутривенно инъецируются в САМ аналитическую систему, не наблюдается эффекта на ранее существовавшие зрелые сосуды, присутствующие в САМ на площадях дистанцированных от положения опухоли Предварительно существующие сосуды при таком расположении не подвергают влиянию ингибирующего пептида, который протекает внутри таких сосудов, хотя генерация новых сосудов из предварительно существующих сосудов в опухолевую массу подвергается ингибированию Так, синтетические пептиды, включающие пептиды 66203 и 62184, предварительно описанные в лиганд-рецепторном анализе в Примере 4, являющиеся антагонистами, как было продемонстрировано в настоящее время, ингибируют ангиогенез, который ограничен сосудами подверженными развитию, а не зрелыми и предварительно существующими сосудами Кроме этого, внутривенное вливание пептидов не приводит в результате к какому-либо вредному цитотоксическому воздействию на окружающую область, о чем свидетельствует интактная сосудистая система, показанная на фиг 9С Аналогичные анализы осуществляли с другими синтетическими пептидами, полученными в примере 1 и перечисленными в Таблице 1 8 Ингибирование роста опухолевой ткани с помощью аурз-антагонистов, измеренное в САМ анализе Как показано в примере 7Д1, помимо визуальной оценки влияния анти-аурз-антагонистов на Кроме этого, получение опухоли для микроскопического гистологического анализа включает фиксацию представителей опухолей в Bulins Fixative в течение 8 часов и погружение в парафин Серийные секции вырезали и окрашивали гематоксилином и эозином /Н & Е/ для микроскопического анализа Гладсон с сотр, J Clm Invest, 88 1924 /1991/ Секции фотографировали с помощью микроскопа Олимпус при 250-кратном увеличении А Местное применение Результаты полученные при взвешивании типичной человеческой меланомной опухоли /M21L/ в результате местного применения контрольного буфера /HBSS/, P3C2 /анти- a v p 3 / или LM609 /анти- аурз/ представлены в Таблице 4 Число эмбрионов оценивали для каждой обработки средним весом опухоли в миллиграммах /мг/, причем каждое значение рассчитывалось с учетом стандартного отклонения среднего значения, как это указано в конце таблицы Таблица 4 № эмбриона /мг/ 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 мАь обработка Вес опухоли HBSS 108 152 216 270 109 174 134 144 408 157 198 102 124 99 24 135 17 27 35 68 48 59 P3G2 LM609 44729 51 Обработка мАь HBSS контроль P3G2 LM609 Продолжение таблицы 4 Средний вес опухоли /мг/ 172 ±26 171 ±36 52 ±13 Экспозиция аурз негативной человеческой меланомной опухолевой массы в САМ аналитической системе к LM609 вызывает уменьшение среднего веса необработанной опухоли от значения 172мг ±26 до 52мг ± 13 P3G2 антитело не оказывает влияния на массу опухоли Так, блокировка аурз рецептора местным применением аурз-специфичного LM609 антитела приводит в результате к регрессии опухолевой массы, а также к ингибированию ангиогенеза, как это показано в предыдущих примерах Измеренный диаметр опухолевой массы, полученной в результате воздействия P3G2, составлял в среднем величину от 8 миллиметров до 1 сантиметра В отличие от этого, LM609обработанные опухоли имели диаметр 2 - Змм Замороженные срезы таких опухолей обнаруживали незатронутую цитоархитектуру опухоли, подвергшейся воздействию P3G2 в отличие от потери организованной клеточной структуры в опухоли подвергшейся воздействию LM609 Поэтому аурз рецепторная активность существенна для того, чтобы аурз негативная опухоль сохраняла свое питание для поддержания массы в результате развития аурз-экспрессирующей сосудистой системы Блокировка аурз с помощью аурз антагонистов изобретения приводит в результате к ингибированию ангиогенеза в опухоль, что в конечном счете приводит к уменьшению массы опухоли В Внутривенное применение Результаты взвешивания типичной карциномной опухоли /UCLAP-3/ в результате внутривенного применения контрольного буфера /PBS, фосфатный буферный физиологический раствор/, CSAT /анти-рі/ или LM609 /анти- аурз/ представлены в таблице 5 Число эмбрионов оценивали для каждой обработки средним весом опухоли с учетом стандартного отклонения среднего значения, как это показано в конце таблицы Таблица 5 № эмбриона /мг/ 1 2 3 4 1 2 3 4 5 1 2 3 4 мАь обработка Вес опухоли PBS 101 80 67 90 151 92 168 61 70 16 54 30 20 CSAT LM609 5 6 7 52 Продолжение таблицы 5 37 39 12 Обработка мАь Средний вес опухоли /мг/ PBS контроль 85 ± 7 CSAT 108 ±22 LM609 30 ± 6 Экспозиция аурз-негативной человеческой карциномной опухолевой массы в САМ аналитической системе к LM609 вызывало уменьшение среднего веса необработанной опухоли от значения 85мг ± 7 до 30мг ± 6 CSAT антитело не оказывает существенного влияния на вес опухолевой массы Таким образом, блокировка аурз рецептора в результате внутривенного применения аурзспецфичного LM609 антитела приводит к регрессии карциномы, как это имеет место и в случае меланомной опухолевой массы описанной выше, а также к ингибированию ангиогенеза, как это продемонстрировано в предыдущих примерах Кроме этого, рост человеческой меланомной опухоли аналогичным образом ингибируется внутривенной инъекцией LM609 9 Регрессия роста опухолевой ткани в присутствии аурз антагонистов, измеренная в САМ анализе Для оценки влияния аурз антагонистов на рост опухоли и ее выживание, фрагменты человеческой меланомы и фрагменты карциномы легких, поджелудочной железы и гортани помешали на САМ 10-дневных эмбрионов в соответствии с описанным в примере 5А А Внутривенное применение 1/ Обработка моноклональными антителами а Обработка LM609 /анти-аур3/ и CSAT /антиPi/ Через 24 часа после имплантации САМ фрагментами карциномы аурз -негативной человеческой меланомы M21-L карциномы поджелудочной железы FG, человеческой легкочной карциномы UCLAP-3, или человеческой ларингеальной карциномы НЕрЗ, эмбрионы внутривенно инъецировали только PBS или однократной дозой /ЗООмкг/ЮОмкл/ мАь LM609 /анти-аур3/ или CSAT /анти-рі/ Опухолям давали возможность размножаться еще в течение 6 дней К концу периода инкубации опухоли подвергали тщательной резекции и освобождали от окружающей САМ ткани Резекцию опухоли проводили два независимых исследователя, удаляющих только легко определяемую твердую опухолевую массу Опухоли имели хорошо обозначенные края и таким образом тонкая полу-прозрачная мембрана /САМ/, которая легко различима с твердой опухолевой массой удалялась без нарушения, самой опухолевой массы Подвергнутые резекции опухоли взвешивали и подвергали морфологическому и гистологическому изучению Как показано на фиг 13 веса влажных опухолей к концу 7-го дня определяли и сравнивали с исходным весом опухоли до обработки Каждая полоса представляет собой среднее значение ± < SE для 5-10 опухолей на группу мАь LM609 зна 53 44729 54 чительно ингибирует рост опухоли /р < 0,001/ по ли морфологическому изучению и фотографиросравнению с контрольными образцами для всех вали стереомикроскопом, как описано в примере испытуемых опухолей Во всех случаях имела 9А1/ место пролиферация опухолей обработанных PBS Увеличенные фотографии, показанные на или CSAT В отличие от этого, мАь LM609 не фиг 15А - 15Е соответствуют следующему на только предотвращает рост таких опухолей, но фиг15А изображены дубликатные образцы, обраиндуцирует обширную регресию в большинстве ботанные цикло-РАДА/ пептидом /69601/, на случаев Важно отметить, что клетки таких опухофиг 15В - дубликатные образцы обработанные лей не экспрессируют интегрин аурз демонстрируя цикло-РСДА/ пептидом /66203/, на фиг15С покатот факт, что ингибирование роста обязано антизана соседняя ткань, взятая с некоторых эмбриоангиогенным эффектам такого анти-тела на сосунов, обработанных цикло-РСДА/ пептидом /66203/ дистую систему, а не на непосредственно опухона фиг 15Д и 15Е изображено сильное увеличение левые клетки /13-кратное/ опухоли, обработанной пептидом На фиг 15Д изображены нормальные кровеносные ь Обработка LM609 /анти-аур3/ P3G2 /антисосуды опухоли, обработанной контрольным пепcivps/ тидом /69601/ На фиг15Е изображены примеры Человеческие M21-L меланомные опухолевые разрушенных кровеносных сосудов опухолей обфрагменты /50мг/ имплантировали на САМ 10работанных цикло-РСДА/ пептидом /66203/ дневных эмбрионах, как описано в примере 5А /стрелки/ Через 24 часа эмбрионы внутривенно инъецировали только PBS или однократной дозой Полученные результаты иллюстрируют тот /ЗООмкг/ЮОмкл / мАь LM609 /анти-аур3/ или P3G2 факт, что лишь пептид 66203 ингибирует образо/анти-аурб/ Опухолям давали размножаться, как вание сосудов, а также что сосуды в САМ ткани описано в примере 9А1/а, и подвергали морфолососедней с опухолью не затрагиваются гическому и гистологическому изучению 10 Регрессия роста опухолевой ткани в присутствии аурз антагонистов, измеренная in vivo Представители M21-L опухолей, обработанмодельным анализом на кроличьем глазу ных мАь P3G2 /анти-аурб/ или LM609 /анти-аур3/ подвергались морфологическому исследованию Влияние анти-аурз антагонистов на ангиогеОбработанные P3G2 опухоли были крупными /8мм нез, индуцированный фактором роста, может нав диаметре/ и имели хорошо выраженную сосудиблюдаться в природных прозрачных структурах стую систему, тогда как обработанные мАь LM609 примерами которых может служить роговая обобыли значительно мельче /Змм в диаметре/ и не лочка глаза Новые кровеносные сосуды растут от содержали детектируемых кровеносных сосудов края роговой оболочки глаза, который хорошо снабжается кровью, в направлении центра рогоДалее опухоли дополнительно исследовали вой оболочки, которая в нормальном состоянии не приготовлением гистологических срезов и окраснабжается кровью Такие стимуляторы ангиогешиванием гематоксилином и эозином, как описано неза, как pFGF при применении на роговой обов примере 9А1/а Как показано на фиг 14 / верхняя лочке глаза индуцируют рост новых кровеносных часть/, опухоли, обработанные мАь P3G2 /антисосудов от края оболочки Антагонисты ангиогенеаурз/ демонстрировали многочисленные жизнеза, применяемые на роговой оболочке глаза ингиспособные и активно делящиеся опухолевые бируют рост новых кровеносных сосудов от края клетки, как показано митотическими значениями оболочки Так, роговая оболочка подвергается /острие стрелки/ и множеством кровеносных сосуангиогенезу в результате инвазии эндотелиальдов /стрелки/ по всех опухолевой строме В отлиных клеток от края роговой оболочки в жесткую чие от этого, небольшое количество или отсутстколлаген-упакованную ткань роговой оболочки, вие жизнеспособных опухолевых клеток или что можно легко наблюдать визуально Поэтому кровеносных сосудов детектировалось в опухолях, модельный анализ на кроличьем глазе обеспечиобработанных мАь LM609 /анти-аурз/ /фиг 14, вает in vivo модель для непосредственного нанижняя часть/ Эти результаты демонстрируют тот блюдения стимуляции и ингибирования ангиогефакт, что антагонисты интегрина аурз ингибируют неза после имплантации соединений индуцированный опухолью ангиогенез, что привонепосредственно в роговую оболочку глаза дит к остановке роста и регрессии большого числа человеческих опухолей in vivo Важно отметить, A In vivo модельный анализ на кроличьем что эмбрионы, изученные через 7 дней роста опуглазе холи /эмбрионный 17-ый день/ оказались нор1/ Ангиогенез, индуцированный факторами мальными в ходе тщательного изучения в незавироста симости от того были ли они обработаны аурз Ангиогенез индуцированный в in vivo модельантагонистом Эти открытия указывают на то, что ном анализе на кроличьем глазе в присутствии антагонисты такого интегрина нетоксичны в отнофактора роста pFGF, причем подробности такого шении развивающихся эмбрионов метода описаны ниже 2/ Обработка синтетическими пептидами а Приготовление гидроновых гранул, содерЧеловеческие M21-L меланомные опухолевые жащих фактор роста и моноклональные антитела фрагменты /50мг/ имплантировали на САМ 10Гидроновые полимерные гранулы, содержадневных эмбрионов, как описано в Примере 5А щие фактор роста и мАь получали как описано Через 24 часа эмбрионам делали однократную D'Amato с сотр , в Proc Natl Acad Sci , 91 4082внутривенную инъекцию ЗООмкг/ЮОмкл цикло 4085 /1994/ Индивидуальные гранулы, содержаRADfV /69601/ или цикло RGDfV /66203/ Через 72 щие 650нг фактора роста pFGF, связывали с сучаса общего времени опухоли удаляли, подвергакралфатом /Карафет, Марион Меррелл Доу кор 55 44729 56 порейшн/ с целью стабилизации pFGF и обеспечески с использованием шпателя для радужной чения его медленного выделения в окружающую оболочки глаза и гранулу имплантировали по ее ткань Кроме этого, гидроновые гранулы готовили периферическим краям на 2мм от лимбуса таким образом, чтобы они содержали 40мкг мАь В течение последующих 14 дней / pFGF и мАь LM609 /анти- av(33/ или мАь P1F6 /анти- av(35/ в диффундировали из имплантированной гранулы в PBS Гранулы отливали в специально приготовокружающую ткань и в результате этого оказываленные Тефлоновые втулки, которые имели 2,5мм ли влияние на ангиогенез от края роговой оболочсердцевину, просверленную в их поверхностях ки глаза Примерно12 мкл отлитого материала помеПредставительные результаты каждой обращали в каждую втулку и полимеризовали в течеботки изображены на фиг16А - 16Е Число приние ночи в стерильном колпаке Затем гранулы сутствующих сосудов рассчитывали количественстерилизовали облучением ультрафиолетовым но и выражали в терминах часов, которые светом определяли следующим образом Глаз делили на 12 равных секторов также, как это имеет место на ь Обработка моноклональными антителами циферблате часов "Один циферблатный час соВ каждом эксперименте использовали по три судов" относится к такому количеству сосудов, кролика, в один глаз которых помещали гранулу, которое заполняет площадь глаза эквивалентную содержащую pFGM и LM609, а в другой глаз заодному часу на циферблате Пять кроликов полугружали гранулу, содержащую pFGF и мышиный чивших лишь pFGF демонстрировали свежий анмАь P1F6 /анти- avps/ Использование спаренного гиогенез, в котором новые кровеносные сосуды глазного тестирования для сравнения LM609 росли от края роговой оболочки в направлении ее /анти-аурз/ с другими мАь и PBS контрольными центра, который в нормальном состоянии не имеобразцами обеспечивает средство точного тестиет кровеносных сосудов Один из таких кроликов рования для демонстрации значительных разлиимел лишь 1 циферблатный час сосудов в расчечий между испытанными мАь те на гранулу Два кролика, получивших как pFGF, P1F6 мАь иммунореагирует с интегрином аурз, так и LM609 абсолютно не проявляли ангиогенеза который обнаружен на поверхности сосудистых вплоть до 14 дня после хирургического вмешаэндотелиальных клеток но, по-видимому, не учательства Один из таких кроликов имел 3 фокуса ствует в ангиогенезе Для определения факта кровоизлияния и почечные сосуды к 14 дню Два участия тАь P1F6 в ангиогенезе готовили гранулы, кролика, получивших pFGF и мАь P3G2 /анти-avps/ содержащие только мАь и анализировали их, как и демонстрировали обширную васкуляризацию, в описано ниже, на факт того, что мАь не индуцирукоторой новые кровеносные сосуды росли от края ет ангиогенез роговой оболочки глаза в нее Один из таких кроВсе испытуемые мАь очищали от асцитной ликов имел 1-2 часа сосудов в расчете на гранулу жидкости с использованием Протеин-А Сефароза С1-4В аффинной колоночной хроматографии соКак следует из модельного анализа на крогласно хорошо известным способам Элюированличьем глазу, ангиогенный эффект не наблюдаетный иммуноглобулин затем диализировали против ся на нормальных паралимбальных сосудах в PBS и обрабатывали Детокси-гелем /Пьерсе Кэприсутствии фактора роста pFGF у кроликов, помикалс/ с целью удаления эндотоксина Как было лучивших мАь LM609 /анти-аурз/ В отличие от показано, эндотоксин является мощным ангиогенэтого, ангиогенез наблюдался на паралимбальных ным и противовоспалительным стимулянтом Пососудах в присутствии фактора роста pFGF у кроэтому мАь тестировали на присутствие эндотокликов, получивших мАь P3G2 /анти-avps/ Полное сина с помощью Хромогенного лимулус ингибирование ангиогенеза роговой оболочки глаамебоцитного лизатного анализа (Chromogemc за при воздействии мАь LM609 значительно выше, Limilus Amebocyte Lysate Assay) /Био-Виттакер/ и чем в присутствии анти-ангиогенных реагентов, о лишь те мАь, которые не содержали детектириуекоторых сообщалось ранее мых количеств эндотоксина использовали в мо11 In vivo регрессия роста опухолевой ткани в дельном анализе на кроличьем глазу присутствии антагонистов, измеренная химерным анализом мышь-человек Гидроновую гранулу, содержащую pFGF и мАь LM609 /анти-аурз/или P1F6 /анти- civps/ вставляли In Vivo химерную модель человек-мышь генев карман роговой оболочки глаза, образованный рировали заменой части кожи мыши линии SC1fl на глазах кролика Гидроновая гранула также сочеловеческой неонатальной крайней плотью держала сукралфат для стабилизации pFGF в /фиг 17/ После укоренения кожного трансплантаходе анализа Индивидуальные гранулы импланта человеческую крайнюю плоть инокулировали тировали в созданные хирургическим путем "карклетками карциномы После образования способманы", сформированные в мид-строме роговой ной к изменению опухоли мАь LM609 /анти-аурз/ оболочки глаз кролика Хирургические операции или PBS инъецировали в хвостовую вену мыши проводили в стерильных условиях с использоваЧерез 2-3 недели опухоль вырезали а анализиронием операционного микроскопа Вилд модели вали путем взвешивания и гистологии М691, снабженного пучковым дробителем, с котоA In vivo анализ химерной системы мышь черым была смонтирована камера для фотографиловек ческой регистрации индивидуальных роговых In vivo химерную модель мышь-человек готооболочек глаза "Карман" размером 3 х 5мм созвили в соответствии с описанным Yan с сотр , J давали в строме роговой оболочки делая Змм Clin Invest, 91986-996 /1993/ Если говорить разрез на половину толщины роговой оболочки вкратце, то 2см 2 квадратной площади кожи хирурлезвием 69 Биавер Строму рассекали периферигически удаляли у мышей разновидности SC1fl /в 57 44729 58 возрасте 6-8 недель/ и заменяли человеческой аналитической системе мышь-человек на LM609 крайней плотью Мышей анестезировалии с пло/анти-аурз/ вызывало уменьшение среднего веса щади 5см2 удаляли волосы с каждой стороны лаопухоли, обработанной PBS от 198мг до 213мг терального абдоминального участка путем выбриПредставители опухолей М211L, обработанвания Два круглых трансплантанта площадью ных мАь LM609 /анти-аурз/ и PBS были подвергну2см 2 готовили путем удаления полной толщины ты морфологическому исследованию PBSкожи ниже фасции Полную толщину человеческих обработанные опухоли были крупными /с диаметкожных трансплантантов того же размера, произром 8 - 10мм/ и хорошо васкуляризованными, товодных человеческой неонатальной крайней плогда как опухоли, обработанные мАь LM609 /антити, помещали на раневые слои и зашивали на аурз были значительно более мелкими /с диаметместо Трансплантант покрывали Band-Aid, котором 3 - 4мм/ и не содержали детектируемых крорый пришивали к коже Для покрытия раны также веносных сосудов применяли микропористую тканевую ленту Опухоли, полученные в кожных трансплантантах, которые инъецировали МДА 231 клетками М21L человеческую клеточную линию или были детектируемыми и измеряемыми МорфолоМДА 23 1 клеточную линию карциномы грудной гическое исследование полученных опухолей обжелезы /АТСС НТВ 26, аурз негативная в соответнаружило, что имеет место неоваскуляризация от ствии с иммунореактивностью тканевых срезов в трансплантированных человеческих тканей в МДА присутствии мАь LM609/ использовали для обра23 1 опухолевые клетки зования твердых человеческих опухолей на трансплантатах человеческой кожи на мышах лиТаким образом, блокировка аурз рецептора нии SC1fl Одноклеточную суспензию 5 х 106 М21внутривенным введением аурз специфичного L или МДА 23 1 клеток инъецировали интрадерLM609 антитела приводит в результате к регресмально в трансплантант человеческой кожи Засии карциномы в такой модельной системе тем же тем мышей наблюдали в течение 2-4 недель с образом, что и в случае САМ и модельных систем целью оценки роста измеряемой человеческой на кроличьих глазах, как это описано в примерах 9 опухоли и 10, соответственно В Внутривенное применение 12 Стимуляция сосудистых клеток с целью 1/ Обработка моноклональными антителами вхождения в клеточный цикл и их вовлечения в апоптоз в присутствии антагонистов интегрина После роста измеряемых опухолей, мышей аурз при измерении с помощью САМ-анализа линии SC1fl, которым делали инъекции M21L опухолевыми клетками, внутривенно инъецировали в Ангиогенный процесс явно зависит от способхвостовую вену 250мкг мАь LM609 /анти-аурз/ или ности цитокинов, таких как pFGF и VEGF стимулиPBS дважды в неделю в течение 2-3 недель Поровать пролиферацию сосудистых клеток Mignatti сле этого, опухоли подвергали резекции с кожи и с сотр J Cell, Biochem , 471 201/1991/, Takeshita с обрезали окружающую ткань Нескольких мышей сотр J Clin Invest, 93 6 62/1994/, и Koyma с сотр оценивали на каждую из обработок, определяя J Cell, Physiol , 158 1 /1994/ Однако, также следусредний вес опухоли при каждой обработке, приет отметить, что передача сигнала может регуличем результаты такого определения представлеровать дифферециацию таких сосудистых клеток ны в конце Таблицы 6 в зрелые кровеносные сосуды Так, возможно, что интерференция с сигналами, относящимися к росту или дифферециации сосудистых клеток, подТаблица 6 вергающихся новому росту или ангиогенезу, может в результате приводить к расстройству Номер опухоли ангиогенеза Обработка Вес опухоли /мг/ M21L Лигирование интегрина, как было показано, 1 PBS 158 принимает участие как в пролиферации клеток, так и в апоптозе или программированной клеточ2 192 ной смерти in vitro См Schwartz, Cancer Res , 3 216 51 1503 /1993/, Meredith с сотр, Мої Biol Cell, 4 227 4 953 /1993/, Fnsch с сотр, J Cell Biol , 124 619 5 LM609 195 /1994/, и Ruoslahti с сотр , Cell, 77 477 /1994/ Ана6 42 логичное исследование влияния аурз антагонистов на ангиогенез обнаружило присутствие пре7 82 рванных и разрушенных связанных с опухолью 8 48 кровеносных сосудов Поэтому, возможно, что 9 37 потеря непрерывности кровеносных сосудов мо10 100 жет быть следствием селективного некроза или 11 172 апоптоза сосудистых клеток Обработка Средний вес опухоли /мг/ PBS 198 LM609 113 Воздействие M21L аурз-негативной человеческой карциномной опухолевой массы в химерной Для исследования такой возможности САМ изучали после индуцирования ангиогенеза в присутствии фактора роста pFGF и обработки мАь и циклическими пептидами настоящего изобретения А Обработка моноклональными антителами Апоптоз может детектироваться большим числом методов, которые включают непосредст 59 44729 60 венное изучение дНК, выделенной из ткани для ловиям проницаемости и окрашивались с помоопределения фрагментации ДНК, и детекцию З'ОН щью детекционного набора Арор Tag in situ сов интактной ткани с помощью антитела, которое гласно инструкциям производителя /Онкор, специфически определяет свободную З'ОН группу Гайтерсбург, МД/ Арор Tag представляет собой фрагментированной дНК антитело, которое специфически определяет З'ОН группы фрагментированной дНК Детекция таких 1/ Анализ фрагментации дНК свободных З'ОН групп представляет собой устаАнгиогенез индуцировали помещением новленный способ определения апоптотических фильтровальных дисков, насыщенных pFGF на клеток См Gavneh с сотр, J Cell Biol , САМ 10-дневных эмбрионов, как это описано в 119 493/1992/ Примере 6А Иммуногистологический анализ САМ в присутствии LM609 /анти-аурз/ позволил обнаОкрашенные Арор Tag клетки затем промываружить пик экспрессии аурз на кровеносных сосули в 0,1% /об/об/ Тритона Х-100 в PBS и ресусдах через 12-24 часа после инициирования ангиопендировали в FAGS буфере, содержащем 0,5% генеза с помощью pFGF Так, через 24 часа после /вес /об BSA, 0,02% /вес /об / азида натрия и стимуляции pFGF, эмбрионы инокулировали внут200мкг/мл RNa3bi А в PBS Клетки инкубировали в ривенно ЮОмкл только PBS или PBS, содержатечение 1,5 часа, промывали и анализировали щим ЗООмкг CSAT /анти-рі/ или LM609 /анти-аурз/ флуоресцентной сортировкой активированных клеток Флуоресценцию клеток измеряли с исФрагментацию ДНК детектировали путем репользованием PACScan проточного цитометра и зекции САМ ткани непосредственно ниже аурз полученные данные анализировали, как описано насыщенных фильтровальных дисков через 24 ниже или 48 часов после внутривенной инокуляции с помощью мАь LM609 /анти-аурз/, CSAT /анти-рі/ Клеточную флуоресценцию измеряли с помоили PBS Подвергнутые резекции ткани САМ трищью PACScan /сканирующего клеточного сортера жды промывали стерильной PBS и мелко крошис возбуждением флуоресценции прим пер, ли, ресуспендировали в 0,25% бактериальной /проточного цитометра/ /Бектон Дикинсон, Маунколлагеназе/ /Ворсингтон Биокемикал, Фрихолд, тэйн Вью Боковое рассеяние //SSC/ и переднее Нью-Йорк/ и инкубировали 90 минут при 37°С при рассеяние /FSc/ определяли одновременно и все периодическом вихревом перемешиании ДНК полученные данные собирали в компьютере Хьюэкстрагировали из равного числа САМ клеток из лет-Пакард /НР9000, снабженным FACScan исодноклеточной суспензии, как описано выше, см , следовательским програмным обеспечением Bissonette с сотр Nature 359 552/1992/ Вкратце, /Бектон Дикинсон, Маунтэйн Вью, КА/ Данные равное число клеток САМ лизировали в ЮмМ анализировали с помощью программы Р С Лизис, трис-СІ, рН 8 0, ЮмМ ЕДТА в 0,5% /об /об / Тритоверсия 1 /Бектон Дикинсон, Маунтэйн Вью, КА/ на Х-100 /Сигма, Сент-Льюис, МО/ Клеточный Негативные контрольные входы устанавливали с лизат центрифугировали со скоростью 16,000 хд в использованием клеточной суспензии без добавтечение 15 минут при 4°С для отделения растволения первичных антител из набора Арор Tag римых фрагментов ДНК от интактной хроматиноАналогичное открытие мембранного канала привой гранулы Фрагментированную ДНК промываменяли на обеих клеточных популяциях в резульли, осаждали и анализировали на 1,2% /вес об / тате анализа примерно 8 000 клеток в расчете на а га роза геле различные обработки клеток Растворимую Фрагментированную ДНК выделяли из равного числа клеток САМ при каждой обработке, разделяли с помощью электрофореза на агарозном геле и визуализировали путем окрашивания этидиум бромидом Никаких отличий не наблюдалось в относительной степени ДНК фрагментации в результате трех различных обработок через 24 часа после обработки Однако, через 48 часов после обработки мАь LM609 /анти аурз/, наблюдалось значительное повышение фрагментации ДНК по сравнению с эмбрионами, обработанными либо мАь CSAT /анти-рі/ или только PBS 2/ Стимуляция сосудистых клеток для вхождения в клеточный цикл С целью экспериментального изучения роли аурз в этих процессах, клетки произведенные из САМ, обработанных или не обработанных pFGF, окрашивали йодистым пропидиумом и проводили иммунную реакцию с мАь LM609 /анти- аурз/ САм, изолированные из эмбрионов через 24 и 48 часов после обработки мАь LM609 /анти-аурз/ CSAT /анти-рі/ или PBS, диссоциировали в одноклеточную суспензию путем инкубации в присутствии бактериальной коллагеназы, как описано выше Единичные клетки затем подвергались ус Процент одиночных клеток производных от САМ обработанных мАь и окрашенных Арор Tag в соответствии с определением методом FACS анализа изображен на фиг 18 Черная полоса представляет собой клетки из эмбрионов обработанных за 24 часа до анализа Пунктирная полоса представляет собой клетки эмбрионов обработанные за 48 часов до анализа Каждая полоса представляет собой среднее значение ± SE при трех параллельных измерениях Как следует из фиг 18, САМ обработанные за 2 дня до воздействия мАь LM609 /анти-аурз/ демонстрируют 3-4-кратное увеличение окрашивания Арор Tag по сравнению с САМ обработанными только PBS или CSAT /анти-аурі/ В Обработка синтетическими пептидами САМ-анализы с использованием ангиогенеза, индуцированного фактором роста, как это описано в примере 6А, проводили также с использованием синтетических пептидов изобретения с целью определения влияния циклических пептидов на апоптоз Пептиды цикло-РСДА/ /66203/ и циклоRAflfV /69601/ получали как описано в примере 1 Пептидные растворы или PBS инъектировали в САМ препарат с концентрацией 300мкг/мл Через 24 и 48 часов фильтровальную бумагу и окру