Продукування високоманозних білків у рослинних культурах

1. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка має нуклеотидну послідовність, що кодує лізосомальний білок глюкоцереброзидазу людини, неперервно зв'язаний із С-кінцевим вакуолярним націлювальним сигналом і N-кінцевим сигнальним пептидом ендоплазматичного ретикулуму. 2 (19) 1 3 14. Рослинна клітина, що містить конструкцію нуклеїнової кислоти за п.13 для продукування вказаної глюкоцереброзидази людини. 15. Рослинна клітина за п.14, що рекомбінантно продукує вказаний лізосомальний фермент людини. 16. Рослинна клітина за п.14, де вказана рослинна клітина являє собою клітину кореню рослини, вибрану із групи, що складається із трансформованої Agrobacterium rihzogenes клітини кореню, клітини селери, клітини імбиру, клітини хрону і клітини моркви. 17. Рослинна клітина за п.16, де вказана рослинна клітина являє собою клітину моркви. 18. Клітина Agrobacterium tumefaciens, що містить конструкцію нуклеїнової кислоти за п.13. 19. Молекула, яка продукується в рослинній клітині за п.15, що містить лізосомальний білок глюкоцереброзидазу людини. 20. Молекула за п.19, яка містить щонайменше один незахищений манозний залишок. 21. Молекула за п.20, яка додатково містить щонайменше один фукозний залишок, що має альфа (1-3) глікозидний зв'язок. 22. Молекула за п.20, яка додатково містить щонайменше один ксилозний залишок. 23. Молекула за будь-яким з пп.19-22, де вказаний лізосомальний білок глюкоцереброзидаза людини неперервно зв'язаний із С-кінцевим вакуолярним націлювальним сигналом. 24. Молекула за будь-яким з пп.19-23, де вказаний лізосомальний білок глюкоцереброзидаза людини неперервно зв'язаний із С-кінцевим вакуолярним націлювальним сигналом і N-кінцевим сигнальним пептидом ендоплазматичного ретикулуму. 25. Молекула за п.23 або 24, де вказаний вакуолярний націлювальний сигнал являє собою вакуолярний націлювальний сигнал основного гена хітинази А тютюну. 26. Молекула за п.25, де вказаний вакуолярний націлювальний сигнал є таким, як представлено в SEQ ID NO: 2. 27. Молекула за будь-яким з пп.24-26, де вказаний сигнальний пептид ендоплазматичного ретикулуму є таким, як представлено в SEQ ID NO: 1. 28. Молекула за будь-яким з пп.19-27, де вказана глюкоцереброзидаза людини включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:8. 29. Молекула за будь-яким з пп.19-28, де вказаний лізосомальний білок має біологічну активність. 30. Молекула за п.29, де вказана біологічна активність являє собою захоплення в макрофаги. 31. Молекула за п.29, де вказана біологічна активність являє собою ферментативну активність. 32. Молекула за п.31, де вказаний лізосомальний білок глюкоцереброзидаза людини має збільшене захоплення у вказані макрофаги в порівнянні з відповідною спорідненістю природного лізосомального білка до вказаних макрофагів. 33. Фармацевтична композиція для лікування або профілактики хвороби Гоше, яка містить молекулу за будьяким з пп.20-32 і фармацевтично прийнятний носій. 34. Препарат рослинних клітин для одержання фармацевтичної композиції для лікування або профілактики хвороби Гоше, що містить молекулу за будь-яким з пп.20-32. 89944 4 35. Препарат рослинних клітин за п.34, де вказана молекула, яка має щонайменше один незахищений манозний залишок, містить домінантну фракцію вказаного лізосомального білка глюкоцереброзидази, що вимірюється за допомогою аналізу зв'язування. 36. Фармацевтична композиція, яка містить препарат рослинних клітин за будь-яким з пп.34 або 35 і фармацевтично прийнятний носій. 37. Спосіб одержання лізосомального білка глюкоцереброзидази, який включає: одержання культури рекомбінантних клітин, трансформованих або трансфікованих конструкцією нуклеїнової кислоти за п.13; і культивування вказаної культури клітин в умовах, що забезпечують експресію вказаного білка. 38. Спосіб за п.37, де вказану культуру клітин культивують у суспензії. 39. Спосіб за п.38, який додатково включає: очищення вказаного білка. 40. Спосіб за п.37, де вказана клітина є такою, як визначено в одному із пп.14-17. 41. Спосіб за п.37, де вказаний лізосомальний білок глюкоцереброзидаза зв'язується з рецептором манози на макрофазі. 42. Спосіб за п.41, де вказаний лізосомальний білок глюкоцереброзидаза має збільшене захоплення у вказаний макрофаг в порівнянні з відповідним захопленням лізосомального білка глюкоцереброзидази, експресованого клітиною ссавців, у вказаний макрофаг. 43. Застосування біологічно активного лізосомального ферменту глюкоцереброзидази, визначеного в одному із пп.29-32, для виготовлення лікарського засобу для лікування або профілактики хвороби Гоше. 44. Застосування за п.43, де вказаний лізосомальний фермент глюкоцереброзидаза має збільшене захоплення у вказані макрофагові клітини в порівнянні з відповідним захопленням лізосомального ферменту глюкоцереброзидази, експресованого клітиною ссавців, у вказані макрофагові клітини. 45. Фармацевтична композиція, яка містить глюкоцереброзидазу людини, що включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 14, і фармацевтично прийнятний носій. 46. Лізосомальний білок людини, який містить глюкоцереброзидазу людини, яка містить амінокислотну послідовність, кодовану полінуклеотидом, представленим в SEQ ID NO: 7, де вказана глюкоцереброзидаза людини містить щонайменше один ксилозний залишок і щонайменше один незахищений манозний залишок, і зв'язана на її С-кінці з вакуолярним сигнальним націлювальним пептидом. 47. Лізосомальний білок людини за п.46, який має активність глюкоцереброзидгідролази. 48. Лізосомальний білок людини за п.46, який має захоплення в макрофаги. 49. Фармацевтична композиція, яка містить лізосомальний білок людини за п.46 і фармацевтично прийнятний носій. 50. Лізосомальний білок людини, який містить глюкоцереброзидазу людини, що містить амінокислотну послідовність, кодовану полінуклеотидом, представленим в SEQ ID NO: 7, де вказана глюкоцереброзидаза людини зв'я 5 89944 6 зана на її С-кінці з вакуолярним сигнальним націлювальним пептидом. 51. Лізосомальний білок людини, який містить глюкоцереброзидазу людини, що містить амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:8, де вказана глюкоцереброзидаза людини зв'язана на її С-кінці з вакуолярним сигнальним націлювальним пептидом, і де вказана глюкоцереброзидаза людини містить щонайменше один ксилозний залишок і щонайменше один незахищений манозний залишок. 52. Лізосомальний білок людини за п.51, де вказаний Cкінцевий вакуолярний сигнальний націлювальний пептид містить амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 2. Даний винахід відноситься до трансформованих клітин-хазяїнів для продукування білків з високим вмістом манози і способу га системи продукування таких білків, зокрема у рослинній культурі. Хвороба Гоше являє собою найбільш поширену лізосомальну хворобу накопичення. Вона викликана рецесивним генетичним порушенням (хромосома 1 q21-q31), що приводить до дефіциту глюкоцереброзидази, також відомої як глюкозилкерамідаза, яка являє собою мембраннозв'язаний лізосомальний фермент, який каталізує гідроліз глюкозфінголіпідного глюкоцереброзиду (глюкозилкерамід, GlcCer) до глюкози і кераміду. Хвороба Гоше викликається точковими мутаціями у гені (GBA) hGCD (глюкоцереброзидази людини), що приводить до накопичення GlcCer у лізосомах макрофагів. Характерні клітини накопичення, що називаються клітинами Гоше, знаходяться у печінці, селезінці і кістковому мозку. Пов'язані з цим клінічні симптоми включають серйозну гепатоспленомегалію, анемію, тромбоцитопенію і ушкодження скелета. Ген, що кодує GCD людини, був вперше секвенований у 1985р. [6]. Білок, що складається з 497 амінокислот, одержаний з 536-mer пробілка. Зрілий GCD містить п'ять N-глікозильованих узгоджених послідовностей амінокислот (Asn-XSer/Thr). Чотири з цих сайтів глікозильовані звичайним чином. Глікозилювання п'ятого сайту є необхідним для продукування активного білка. Були ідентифіковані як високоманозні, так і комплексні олігосахаридні ланцюги [7]. HGCD плаценти містить 7% вуглеводу, 20% якого відноситься до високоманозного типу [8]. Біохімічні дослідження і дослідження сайт-направленого мутагенезу забезпечили вихідну карту областей і залишків, важливих для складчастості, активаторної взаємодії і розташування активного сайту. Обробка плацентарної hGCD нейрамінідазою (що приводить до азіало-ферменту) приводить до підвищених швидкостей виведення і поглинання у клітинах печінки щура з супутнім збільшенням гепатичної ферментативної активності (Furbish et al., 1981, Biochim.Biophys. Acta 673:425-434). Така глікан-модифікована плацентарна hGC звичайно використовується як терапевтичний агент при лікуванні хвороби Гоше. Біохімічні дослідження і дослідження сайт-направленого мутагенезу забезпечили вихідну карту областей і залишків, важливих для складчастості, активаторної взаємодії і розташування активного сайту [Grace et al, J.Biol.Chem., 269:228302291 (1994)]. Існує три різних типи хвороби Гоше, кожний з яких визначається рівнем активності hGC. Основними клітинами, що уражаються захворюванням, є макрофаги, які є сильно збільшеними завдяки накопиченню GlcCer, і, відповідно, згадуються як «клітини Гоше». Ідентифікація дефекту у GCD як первинної причини хвороби Гоше привела до розвитку ферментативної замісної терапії як терапевтичної стратегії для даного захворювання. De Duve першим припустив, що заміщення відсутнього лізосомального ферменту екзогенним біологічно активним ферментом могло б виявитися підходом, що приносить хороші результати при лікуванні лізосомальних хвороб накопичення. [Fed Proc. 23:1045 (1964)]. З цього часу у різних дослідженнях припускалося, що ферментативна замісна терапія може виявитися виграшною для лікування різних лізосомальних хвороб накопичення. Максимальний успіх був досягнутий у випадку індивідуумів, які мають хворобу Гоше типу І, яких лікували екзогенним ферментом ( -глюкоцереброзидазою), одержаним з плаценти (Цередаза (Ceredase )), або, пізніше, одержаним рекомбінантним чином (Церезим (Cerezyme )). Немодифікована глюкоцереброзидаза, одержана з природних джерел, являє собою глікопротеїн з чотирма вуглеводними ланцюгами. Даний білок не направлений на фагоцитні клітини тіла і, отже, має обмежене терапевтичне значення. При розвитку сучасної терапії хвороби Гоше, кінцеві цукри на вуглеводних ланцюгах глюкоцереброзидази послідовно видаляли за допомогою обробки трьома різними глікозидазами. Така обробка глікозидазами приводить до глікопротеїну, кінцеві цукри якого складаються із залишків манози. Оскільки фагоцити мають рецептори манози, які розпізнають глікопротеїни і глікопептиди з олігосахаридними ланцюгами на кінці яких розташовані залишки манози, вуглеводне модифікування глюкоцереброзидази поліпшило націлювання ферменту надані клітини [Furbish et al., Biochim.Biophys. Acta 673: 425, (1981)]. Як вказано у даному описі, глікозилювання грає вирішальну роль в активності hGCD, отже, деглікозилювання hGCD, що експресується клітинними лініями, з використанням або тунікаміцину (клітини Sf9), або точкових мутацій, що руйнує всі сайти глікозилювання (як клітини Sf9, так і COS-1), приводить до повної втрати ферментативної активності. Крім того, було встановлено, що hGCD, який експресується в Е.соlі, не є активним. Додаткове дослідження вказало на значимість різних сайтів глікозилювання в активності білка. На додаток до ролі глікозилювання у фактичній активності білка, фермент, що комерційно одержують, містить модифікації послідовності глікану, які по 7 легшують специфічну доставку лікарського засобу. Глікозильовані білки модифікують після екстракції так, щоб вони включали тільки послідовності глікану, що містять манозу. Фермент GCD людини містить 4 сайти глікозилювання і 22 лізини. Фермент (Церезим ), що одержують рекомбінантним чином, відрізняється від плацентарного ферменту (Цередаза ) у положенні 495, де аргінін був заміщений на гістидин. Крім того, олігосахаридний склад відрізняється у рекомбінантної і плацентарної GCD, оскільки перший містить більше фукозних і Nацетилглюкозамінних залишків, тоді як останній зберігає тільки один ланцюг з високим вмістом манози. Як зазначено вище, обидва типи GCD обробляють трьома різними глікозидазами (нейрамінідазою, галактозидазою і P-N ацетилглюкозамінідазою), щоб залишити незахищеними кінцеві манози, які дають можливість цілеуказання відносно фагоцитних клітин. Фармацевтичний препарат, що містить одержаний рекомбінантним чином фермент, описаний у патенті США 5549892. Слід відмітити, що всі зазначені у даному описі публікації включені за допомогою посилання у всій своїй повноті. Один з недоліків, пов'язаних з існуючою у наш час лізосомальною замісною терапією, полягає у тому, що біоактивність ферменту in vivo є небажано низькою, наприклад, внаслідок низького поглинання, зниженого цілеуказання на лізосоми специфічних клітин, де акумулюється субстрат, і короткого функціонального часу напіврозпаду у лізосомах in vivo. Іншим основним недоліком існуючих рекомбінантних ферментів GCD є їх вартість, яка може лягти тяжким економічним тягарем на системи охорони здоров'я. Висока вартість даних рекомбінантних ферментів пов'язана зі складним протоколом їх очищення і відносно великими кількостями лікарських засобів, необхідних для існуючого у наш час лікування. Отже, існує невідкладна необхідність у зниженні вартості GCD так, щоб дане лікування, що зберігає життя людей, могло бути більш доступним за вартістю для всіх, хто у ньому має потребу. Білки для фармацевтичного застосування традиційно продукуються у системах експресії ссавців і бактерій. В останнє десятиріччя була розроблена нова система експресії у рослинах. У даній методології використовується Agrobacterium, бактерія, здатна вбудовувати молекули окремих ланцюгів ДНК (Т-ДНК) у рослинний геном. Внаслідок відносної простоти введення генів для масового продукування білків і пептидів, дана методологія стає все більш популярною як альтернативна система експресії білка [1]. Хоча пост-трансляційні модифікації не існують у бактеріальних системах експресії, системи експресії, одержані з рослин, дійсно полегшують дані модифікації, відомі як вирішальні для експресії і активності білка. Однією з основних відмінностей між системою експресії ссавців і рослин є зміна бічних ланцюгів цукрів білка, викликана різницею у біосинтетичних шляхах. Показано, що глікозилювання впливає надзвичайним чином на активність, 89944 8 складчастість, стабільність, розчинність, сприйнятливість до протеаз, швидкість виведення з крові і антигенний потенціал білків. Отже, при будь-якому продукуванні білка у рослинах потрібно брати до уваги потенційні розгалуження рослинного глікозилювання. Глікозилювання білка поділяють на дві категорії: N-зв'язані і О-зв'язані модифікації [2]. Ці два типи відрізняються амінокислотою, до якої приєднаний глікановий фрагмент: N-зв'язаний приєднаний до залишків Asn, тоді як О-зв'язаний приєднаний до залишків Ser або Thr. Крім того, послідовність гліканів кожного типу містить унікальні відмітні особливості. Серед цих двох типів Nзв'язане глікозилювання є більш частим, і його вплив на функцію білка інтенсивно досліджувався. О-зв'язані глікани, з іншого боку, є відносно рідкими, і відносно їх впливу на білки доступна менша кількість інформації. У попередньому рівні розвитку даної галузі не вказані або не запропоновані пристрій, система або спосіб селективного продукування глікозильованих білків у рослинній культурі. Також у попередньому рівні даної галузі не вказуються або не пропонуються такі пристрій, система або спосіб продукування високоманозних білків у рослинній культурі. Крім того, у попередньому рівні даної галузі не вказуються або не пропонуються пристрій, система або спосіб продукування білків у рослинній культурі за допомогою ендоплазматичної сітки (ER). Також у попередньому рівні даної галузі не вказуються або не пропонуються пристрій, система або спосіб продукування білків у рослинній культурі за допомогою ендоплазматичної сітки (ER), при цьому в обхід апарату Гольджі. Також у попередньому рівні даної галузі не вказуються або не пропонуються пристрій, система або спосіб продукування білків у рослинній культурі з використанням ER-сигналу для обходу апарату Гольджі. У даному винаході подолані дані недоліки попереднього рівня техніки за допомогою розробки пристрою, системи або способу продукування глікозильованих білків у рослинній культурі, зокрема білків, що мають високоманозне глікозилювання, у той час як необов'язково і переважно для таких білків проводять цілеуказання (і/або в інших обставинах маніпулюють їх переробкою) за допомогою ER-сигналу. Не бажаючи обмежуватися якоюнебудь однією гіпотезою, автори даного винаходу вважають, що таке цілеуказання викликає обхід білками апарату Гольджі і, отже, зберігає бажане глікозилювання, зокрема високоманозне глікозилювання. Потрібно зазначити, що термін «рослинна культура», як він використаний у даному описі, включає будь-який тип трансгенних і/або інакше генетично сконструйованих клітин рослин, які вирощують у культурі. Генна інженерія може бути постійною або тимчасовою. Переважно, відмітною особливістю культури є те, що клітини не групуються, утворюючи повну рослину, так що, принаймні, не присутня одна біологічна структура рослини. Необов'язково і переважно культура може відрізнятися множиною різних типів рослинних клітин, але переважно у культурі використовують 9 конкретний тип рослинної клітини. Потрібно зазначити, що необов'язково рослинні культури, відмітною особливістю яких є визначений тип рослинної клітини, можуть спочатку походити з множини різних типів таких рослинних клітин. Рослинні клітини можна вирощувати відповідно до будь-якого типу придатного способу культивування, включаючи, але не обмежуючись вказаним, культивування на твердій поверхні (такій як пластикові посудини для культивування або, наприклад, чашки Петрі) або у суспензії. Крім того, відмітною особливістю винаходу є вектори і способи експресії і продукування ферментативно активних високоманозних лізосомальних ферментів з використанням коренів трансгенних рослин, зокрема клітин моркви. Більш конкретно, відмітною особливістю винаходу є клітини-хазяїни, зокрема трансгенні суспендовані клітини моркви, вектори і способи експресії і продукування з високим виходом біологічно активної високоманозної глюкоцереброзидази (GCD). Крім того, винахід відноситься до композицій і способів лікування лізосомальних хвороб накопичення. Даний винахід також відноситься до пристрою, системи і способу забезпечення дефіцитних клітин достатніми кількостями біологічно активних лізосомальних ферментів і, зокрема, GCD людини. Даний винахід також відноситься до клітинхазяїнів, що включають композиції нових векторів, які дають можливість ефективного продукування генів, що кодують лізосомальні ферменти, такі як GCD. Таким чином, даний винахід вирішує тривалу необхідність в економічно життєздатній технології одержання білків, що відповідають визначеним вимогам у відношенні глікозилювання, таким як високоманозне глікозилювання лізосомальних ферментів, таких, наприклад, як GCD. Даний винахід здатний вирішити цю тривалу необхідність за допомогою використання культури клітин рослин. Для подальшого пояснення даного винаходу буде наведене коротке пояснення біосинтетичного шляху для білків з високим вмістом манози. Основний шлях біосинтезу високоманозних і комплексних N-зв'язаних гліканів є високо консервативним для всіх еукаріотів. Біосинтез починається в ендоплазматичній сітці (ER) з перенесенням попередника глікану від довгого ліпідного носія до специфічного залишку Asn на білку за допомогою олігосахаридтрансферази. Попередник згодом модифікується в ER глікозидазами І і II і передбачуваною манозидазою, даючи високоманозні структури, аналогічно до процесу, що відбувається у ссавців. Подальші модифікації послідовності глікану у комплексні і гібридні структури відбувається в апараті Гольджі. Такі модифікації включають видалення одного з чотирьох манозних залишків за допомогою -манозидази І, приєднання залишку N-ацетилглюкозаміну, видалення двох додаткових залишків манози за допомогою -манозидази II, приєднання N-ацетилглюкозаміну і, необов'язково, на даній стадії можуть приєднуватися залишки ксилози і фукози, даючи рослинно-специфічні Nзв'язані глікани. Після перенесення ксилози і фу 89944 10 кози в ядро, Ν-глікани комплексного типу можуть надалі перероблятися шляхом приєднання кінцевої фукози і галактози. Подальші модифікації також можуть відбуватися під час транспорту глікопротеїну. У даній галузі у наш час використовується декілька підходів для контролю і пристосування для визначених цілей глікозилювання білків у рослинах, всі з яких мають помітні недоліки, зокрема у порівнянні з даним винаходом. Модифікації Гроса, такі як повне інгібування глікозилювання або видалення сайтів глікозилювання з пептидного ланцюга, являють собою одну зі стратегій. Однак даний підхід може привести до структурних дефектів. Додатковий підхід включає сильний удар і введення специфічних ферментів переробки вуглеводів. Знову ж, даний підхід важкий і також може вплинути шкідливим чином на самі клітини рослин. Даний винахід долає такі недоліки цих підходів попереднього рівня техніки за допомогою використання ER-сигналу і/або шляхом блокування секреції з ендоплазматичної сітки в апарат Гольджі. Не бажаючи обмежуватися однією гіпотезою, оскільки переважною є високоманозна структура лізосомальних ферментів, якщо секреція може бути блокована, і білок може зберігатися в ендоплазматичній сітці, природні високоманозні структури одержують без необхідності у подальшій трансформації. Як вказано вище, білки, що транспортуються через ендомембранну систему, спочатку проходять в ендоплазматичну сітку. Необхідний транспортний сигнал для даної стадії представлений сигнальною послідовністю на N-кінці молекули так званим сигнальним пептидом. Як тільки даний сигнальний пептид виконав свою функцію, яка полягає у введенні приєднаного до нього білкапопередника в ендоплазматичну сітку, він протеолітично відщеплюється від білка-попередника. На основі його специфічної функції, послідовність даного типу сигнального пептиду залишалася у високій мірі консервативною під час еволюції у всіх живих клітинах, незалежно від того, чи є вони бактеріями, дріжджами, грибами, тваринами або рослинами. Багато рослинних білків, які вводяться в ендоплазматичну сітку за допомогою сигнального пептиду, не знаходяться в ER, а транспортуються з ендоплазматичної сітки в апарат Гольджі і продовжують рух з апарату Гольджі у вакуолі. Одним з класів таких сортувальних сигналів для даного переміщення є сигнали, які знаходяться на Скінцевій частині білка-попередника [Neuhas and Rogers, (1998) Plant Моl. Biol. 38: 127-144]. Передбачається, що білки, які містять як N-кінцевий сигнальний пептид для введення в ендоплазматичну сітку, так і С-вакуолярний націлюючий сигнал, містять комплексні глікани, які приєднуються до них в апараті Гольджі [Lerouge et al., (1998) Plant Mol. Biol., 38: 31-48]. Природа таких С-кінцевих сортувальних сигналів може варіюватися дуже широко. У патенті США 6054637 описані пептидні фрагменти, одержані з області основної хітинази тютюну, яка являє собою вакуолярний білок, які діють як вакуолярні націлюючі пептиди. Прикладом вакуолярного білка, що містить С-кінцевий націлюючий 11 сигнал і комплексні глікани, є фазеолінзберігаючий білок насіння бобів [Frigerio et al., (1998) Plant Cell, 10:1031-1042; Frigerio et al., (2001) Plant Cell 13:1109-1126]. Принципово те, що у всіх еукаріотичних клітинах вакуолярні білки проходять через ER і апарат Гольджі перед ізолюванням у вакуолі як їх кінцевому місці призначення. Несподівано трансформовані клітини кореня рослин за даним винаходом продукували GCD з незвичайно високим вмістом манози. Було встановлено, що переважно такий високоманозний продукт є біологічно активним і, отже, немає необхідності у додаткових стадіях для його активації. Не бажаючи обмежуватися єдиною гіпотезою, буде очевидно, що застосування ERсигналу разом з рекомбінантним білком, що продукується у культурі рослинних клітин, здатне подолати транспортування через апарат Гольджі і, отже, зберігати бажане високоманозне глікозилювання. Необов'язково, будь-який тип механізму, який здатний продукувати високоманозне глікозилювання, включаючи будь-який тип механізму обходу апарату Гольджі, можна використовувати відповідно до даного винаходу. У першому аспекті даний винахід відноситься до клітини-хазяїна, що продукує високоманозний рекомбінантний білок, який представляє інтерес. Дана клітина може бути трансформована або трансфікована молекулою рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує білок, який представляє інтерес, або вектором експресії, що включає молекулу нуклеїнової кислоти. Така молекула нуклеїнової кислоти включає першу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує цільовий білок, функціонально зв'язану з другою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує вакуолярний націлюючий сигнальний пептид. Перша послідовність нуклеїнової кислоти може бути необов'язково додатково функціонально зв'язана з третьою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує ЕR(ендоплазматична сітка)-націлюючий сигнальний пептид. Клітина-хазяїн за винаходом відрізняється тим, що білок, який представляє інтерес, продукується клітиною у високо манозильованій формі. Клітина-хазяїн за винаходом може являти собою еукаріотичну або прокаріотичну клітину. В одному варіанті здійснення клітина-хазяїн за винаходом являє собою прокаріотичну клітину, переважно бактеріальну клітину, найбільш переважно, клітину Agrobacterium tumefaciens. Дані клітини використовуються для інфікування переважних рослинних клітин-хазяїнів, описаних далі. В іншому переважному варіанті здійснення клітина-хазяїн за винаходом може являти собою еукаріотичну клітину, переважно, рослинну клітину, і, найбільш переважно, клітину кореня рослин, вибрану з групи, що включає трансформовану Agrobacterium rihzogenes клітину кореня, клітину селери, клітину імбиру, клітину хрону і клітину моркви. У переважному варіанті здійснення клітина кореня рослини являє собою клітину моркви. Потрібно зазначити, що трансформовані клітини моркви за винаходом вирощують у суспензії. Як зазначено 89944 12 вище і описано у прикладах, дані клітини були трансформовані з використанням клітин Agrobacterium tumefaciens. В іншому варіанті здійснення молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти, включена у клітинухазяїна за винаходом, включає першу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує лізосомальний фермент, яка функціонально зв'язана з другою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує вакуолярний націлюючий сигнальний пептид, одержаний з основного гена хітинази А тютюну. Даний вакуолярний сигнальний пептид має послідовність амінокислот, представлену у SEQ ID NO:2. Перша послідовність нуклеїнової кислоти необов'язково може бути додатково зв'язана з третьою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує націлюючий сигнальний пептид ER (ендоплазматичної сітки), позначений як SEQ ID NO:1. В одному варіанті здійснення рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти, включена у клітину-хазяїна за винаходом, додатково включає промотор, який є функціональним у клітинах рослин. Даний промотор повинен бути функціонально зв'язаним з рекомбінантною молекулою за винаходом. В іншому варіанті здійснення дана рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти необов'язково додатково може включати функціонально зв'язаний термінатор, який переважно є функціональним у клітинах рослин. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за винаходом необов'язково може додатково включати додаткові контрольні, промотуючі і регулюючі елементи і/або маркери, що селектуються. Потрібно зазначити, що дані регуляторні елементи є функціонально зв'язаними з рекомбінантною молекулою. У переважному варіанті здійснення високоманозний білок, що представляє інтерес, який продукується клітиною-хазяїном за винаходом, може являти собою високоманозний глікопротеїн, що має незахищені кінцеві залишки манози. Такий високоманозний білок може відповідно до іншого переважного варіанту здійснення являти собою лізосомальний фермент, вибраний з групи, яка складається з глюкоцереброзидази (GCD), кислотної сфінгомієлінази, гексозамінідази, -Νацетилгалактозамінідизи, кислотної ліпази, галактозидази, глюкоцереброзидази, -Lідуронідази, ідуронатсульфатази, -манозидази або зіалідази. У переважному варіанті здійснення лізосомальний фермент може являти собою глюкоцереброзидазу людини (GCD). Далі рекомбінантний GCD, rGCD, rhGCD всі згадуються як різні форми рекомбінантної GCD людини, якщо не вказано іншого. Як описано раніше, хвороба Гоше, найбільш поширена лізосомальна хвороба накопичення, викликана точковими мутаціями гена (GBA) hGCD (глюкоцереброзидаза людини, що приводить до накопичення GlcCer у лізосомах макрофагів). Ідентифікація дефіциту GCD як первинна причина хвороби Гоше привела до розвитку ферментозамісної терапії як терапевтичної стратегії для даного захворювання. Однак глікозилювання грає вирішальну роль в активності hGCD і поглинанні цільовими клітинами. 13 Отже, відповідно до інших переважних варіантів даного винаходу переважно розроблений відповідним чином глікозильований hGCD за допомогою контролювання експресії hGCD у клітинах рослинної культури і більш переважно шляхом забезпечення сигналу ER і/або в інших обставинах, за допомогою, необов'язково і більш переважно, блокування транспортування в апарат Гольджі. Необов'язково і переважно, hGCD має принаймні один олігосахаридний ланцюг, який включає незахищений залишок манози для лікування або профілактики хвороби Гоше. Надалі, у конкретному варіанті здійснення дану переважну клітину-хазяїна трансформують або трансфікують молекулою рекомбінантної нуклеї35 нової кислоти, яка додатково включає S промотор вірусу мозаїки цвітної капусти, термінатор октопінсинтази Agrobacterium tumefaciens і регуляторний елемент являє собою омегатрансляційний елемент-енхансер TMV (вірусу мозаїки тютюну). Відповідно до переважного варіанту здійснення дана рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти включає послідовність нуклеїнової кислоти по суті таку, як представлено у SEQ ID NO:13, і кодує високоманозну GCD, що має послідовність амінокислот по суті таку, як представлено у SEQ ID NO:14. Потрібно розуміти, що даний винахід додатково забезпечує вектор експресії, який включає молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує біологічно активний лізосомальний фермент. В одному переважному варіанті здійснення вектор експресії за винаходом включає молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує біологічно активну високоманозну глюкоцереброзидазу людини (GCD). Переважно, переважний вектор експресії включає нуклеїнову рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, яка має послідовність нуклеїнової кислоти по суті таку, як представлено у SEQ ID NO:13. У другому аспекті, даний винахід відноситься до рекомбінантного високоманозного білка, що продукується клітиною-хазяїном за винаходом. У переважному варіанті здійснення даний високоманозний білок може являти собою біологічно активний високоманозний лізосомальний фермент, вибраний з групи, яка складається з глюкоцереброзидази (GCD), кислотної сфінгомієлінази, гексозамінідази, -Ν-ацетилгалактозамінідизи, кислотної ліпази, -галактозидази, глюкоцереброзидази, -L-ідуронідази, ідуронатсульфатази, манозидази або зіалідази. Найбільш переважно, даний лізосомальний фермент може являти собою глюкоцереброзидазу людини (GCD). Надалі винахід відноситься до рекомбінантного біологічно активного високоманозного лізосомального ферменту, що має принаймні один олігосахаридний ланцюг, який включає незахищений залишок манози. Відповідно до переважного варіанту здійснення рекомбінантний лізосомальний фермент за винаходом може зв'язуватися з рецептором манози на клітині-мішені у сайті-мішені. Переважно, даний сайт може знаходитися в організмі пацієнта, 89944 14 який страждає від лізосомальної хвороби накопичення. Потрібно зазначити, що рекомбінантний лізосомальний фермент володіє підвищеною афінністю по відношенню до клітини-мішені у порівнянні з відповідною афінністю природного лізосомального ферменту по відношенню до клітини-мішені. У конкретному варіанті здійснення клітина-мішень з сайтом-мішенню може являти собою клітину Купфера печінки пацієнта. У переважному варіанті здійснення рекомбінантний лізосомальний фермент може бути вибраний з групи, яка складається з глюкоцереброзидази (GCD), кислотної сфінгомієлінази, гексозамінідази, -Ν-ацетилгалактозамінідизи, кислотної ліпази, -галактозидази, глюкоцереброзидази, -L-ідуронідази, ідуронатсульфатази, манозидази або зіалідази. Найбільш переважно, рекомбінантний лізосомальний фермент являє собою глюкоцереброзидазу (GCD). У третьому аспекті винахід відноситься до способу продукування високоманозного білка. Відповідно, спосіб винаходу включає стадії: (а) одержання культури рекомбінантних клітин-хазяїнів, трансформованих або трансфікованих рекомбінатними молекулами нуклеїнових кислот, що кодують цільовий рекомбінантний білок, або вектором експресії, що включає рекомбінантні молекули нуклеїнових кислот; (b) культивування даних культур клітин-хазяїнів, одержаних на стадії (а) в умовах, що допускають експресію білка, де клітинихазяїни продукують даний білок у високо манозильованій формі; (с) виділення · білка з клітин і збір клітин з культури, забезпеченої на стадії (а); і (d) очищення білка зі стадії (с) за допомогою придатного способу очищення білків. Відповідно до переважного варіанту здійснення клітина-хазяїн, що використовується у даному способі, являє собою клітину-хазяїна за винаходом. В іншому переважному варіанті здійснення високоманозний білок, що продукується способом за винаходом може являти собою біологічно активний високоманозний лізосомальний фермент, що має принаймні один олігосахаридний ланцюг, який включає незахищений залишок манози. Даний рекомбінантний фермент може зв'язуватися з рецептором манози на клітині-мішені у сайті-мішені. Більш конкретно, рекомбінантний фермент, що продукується способом за винаходом, володіє підвищеною афінністю по відношенню до клітини-мішені у порівнянні з відповідною афінністю природного лізосомального ферменту по відношенню до клітини-мішені. Відповідно клітина-мішень у сайті-мішені може являти собою клітину Купфера печінки пацієнта. У конкретному варіанті здійснення лізосомальний фермент може бути вибраний з групи, яка складається з глюкоцереброзидази (GCD), кислотної сфінгомієлінази, гексозамінідази, -Νацетилгалактозамінідизи, кислотної ліпази, галактозидази, глюкоцереброзидази, -Lідуронідази, ідуронатсульфатази, -манозидази або зіалідази. Найбільш переважно, даний лізосо 15 мальний фермент може являти собою глюкоцереброзидазу (GCD). В іншому переважному варіанті здійснення клітина-хазяїн, що використовується у способі за винаходом, може являти собою клітину коренів рослин, вибрану з трансформованої Agrobacterium rihzogenes клітини кореня, клітини селери, клітини імбиру, клітини хрону і клітин моркви. Найбільш переважно, клітина кореня рослин являє собою клітину моркви. Потрібно особливо зазначити, що у способі за винаходом трансформовані клітинихазяїни моркви вирощують у суспензії. У наступному аспекті даний винахід відноситься до способу лікування пацієнта, який має лізосомальну хворобу накопичення з використанням екзогенного рекомбінантного лізосомального ферменту, що включає: (а) одержання біологічно активної форми рекомбінантного лізосомального ферменту, одержаного очищенням з трансформованих клітин коренів рослин і здатного ефективно направлятися до клітин з аномальним дефіцитом лізосомального ферменту. Даний рекомбінантний лізосомальний фермент має незахищені кінцеві залишки манози на приєднаних олігосахаридах; і (b) введення пацієнту терапевтично ефективної кількості рекомбінантного біологічно активного лізосомального ферменту. У переважному варіанті здійснення рекомбінантний високоманозний фермент, що використовується у способі за винаходом, може продукуватися клітинами-хазяїнами за винаходом. Переважно, дана клітина-хазяїн являє собою клітину моркви. В іншому переважному варіанті здійснення лізосомальний фермент, що використовується у способі за винаходом, може являти собою високоманозний фермент, що включає принаймні один олігосахаридний ланцюг, що має незахищений залишок манози. Даний рекомбінантний фермент може зв'язуватися з рецептором манози на клітинімішені у сайті-мішені в організмі пацієнта. Більш переважно, даний рекомбінантний лізосомальний фермент володіє підвищеною афінністю до даних клітин-мішеней у порівнянні з відповідною афінністю по відношенню до клітини-мішені природного лізосомального ферменту. Більш конкретно, лізосомальний фермент, що використовується у способі за винаходом, може бути вибраний з групи, яка складається з глюкоцереброзидази (GCD), кислотної сфінгомієлінази, гексозамінідази, -Ν-ацетилгалактозамінідизи, кислотної ліпази, -галактозидази, глюкоцереброзидази, -L-ідуронідази, ідуронатсульфатази, манозидази або зіалідази. Переважно, даний лізосомальний фермент являє собою глюкоцереброзидазу (GCD). Відповідно до переважного варіанту здійснення спосіб за винаходом, отже, призначений для лікування лізосомальної хвороби накопичення, зокрема хвороби Гоше. У такому випадку клітина-мішень у сайтімішені може являти собою клітину Купфера печінки пацієнта. Винахід крім того відноситься до фармацевтичної композиції для лікування лізосомальної хвороби накопичення, що включає як активний інгре 89944 16 дієнт рекомбінантний біологічно активний високоманозний лізосомальний фермент, як визначено у даному винаході. Композиція за винаходом необов'язково може включати фармацевтично прийнятний розріджувач, носій або ексципієнт. У конкретному варіанті здійснення композиція за винаходом призначена для лікування хвороби Гоше. Така композиція, переважно, може включати як ефективний інгредієнт біологічно активну високоманозу глюкоцереброзидазу людини (GCD), як визначено у винаході. Винахід додатково відноситься до застосування рекомбінантного біологічно активного високоманозного лізосомального ферменту за винаходом для одержання лікарського засобу для лікування або профілактики лізосомальної хвороби накопичення. Більш конкретно, дане захворювання може являти собою хворобу Гоше. Відповідно даний біологічно активний лізосомальний фермент являє собою біологічно активну високоманозну глюкоцереброзидазу людини (GCD), як визначено у винаході. Відповідно до даного винаходу розроблена клітина-хазяїн, що продукує високоманозний рекомбінантний білок, який включає полінуклеотид, що кодує рекомбінантний білок, і сигнал, що викликає продукування рекомбінантного білка у вигляді високоманозного білка. Переважно, полінуклеотид включає першу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує цільовий білок, функціонально зв'язану з другою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує сигнальний пептид. Необов'язково сигнальний пептид включає націлюючий сигнальний пептид ER (ендоплазматичної сітки). Переважно, полінуклеотид додатково включає третю послідовність нуклеїнової кислоти для кодування вакуолярного націлюючого сигнального пептиду. Переважно, сигнал викликає націлювання рекомбінантного білка в ER. Більш переважно, сигнал включає сигнальний пептид, що викликає націлювання рекомбінантного білка в ER. Найбільш переважно, полінуклеотид включає сегмент нуклеїнової кислоти для кодування сигнального пептиду. Необов'язково і переважно, сигнал викликає обхід рекомбінантним пептидом апарату Гольджі. Переважно, сигнал включає сигнальний пептид, який викликає те, що рекомбінантний білок не направляється в апарат Гольджі. Більш переважно, полінуклеотид включає сегмент нуклеїнової кислоти для кодування сигнального пептиду. Необов'язково і переважно, клітина-хазяїн є будь-якою еукаріотичною і прокаріотичною клітиною. Необов'язково, прокаріотична клітина являє собою бактеріальну клітину, переважно, клітину Agrobacterium tumefaciens. Переважно, еукаріотична клітина являє собою рослинну клітину. Більш переважно, рослинна клітина являє собою клітину кореня рослин, вибрану з групи, яка складається з трансформованої Agrobacterium rihzogenes клітини кореня, клітини селери, клітини імбиру, клітини хрону і клітини моркви. Найбільш переважно, клітина кореня рослини являє собою клітину моркви. Переважно, рекомбінантний полінуклеотид включає першу послідовність нуклеїнових кислот, 17 що кодує цільовий білок, яка функціонально зв'язана з другою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує вакуолярний сигнальний пептид, одержаний з основного гена хітинази А тютюну, при цьому вакуолярний сигнальний пептид має послідовність амінокислот, позначену як SEQ ID NO:2, де перша послідовність нуклеїнової кислоти необов'язково додатково функціонально зв'язана з третьою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує націлюючий сигнальний пептид ER (ендоплазматичної сітки), позначений як SEQ ID NO: 1. Більш переважно, рекомбінантний полінуклеотид додатково включає промотор, який є функціональним у рослинних клітинах, де промотор функціонально зв'язаний з рекомбінантною молекулою. Найбільш переважно, рекомбінантний полінуклеотид додатково включає термінатор, який є функціональним у рослинних клітинах, де термінатор функціонально зв'язаний з рекомбінантною молекулою. Також найбільш переважно, рекомбінантний полінуклеотид додатково включає додаткові контрольні, промотуючі і регулюючі елементи і/або маркери, що селектуються, де регулюючі елементи функціонально зв'язані з рекомбінантною молекулою. Переважно, високоманозний білок являє собою високоманозний глікопротеїн, глікозильований принаймні одним незахищеним залишком манози. Більш переважно, високоманозний білок являє собою біологічно активний високоманозний лізосомальний фермент, вибраний з групи, яка складається з глюкоцереброзидази (GCD), кислотної сфінгомієлінази, гексозамінідази, -Νацетилгалактозамінідизи, кислотної ліпази, галактозидази, глюкоцереброзидази, -Lідуронідази, ідуронатсульфатази, -манозидази або зіалідази. Найбільш переважно, даний лізосомальний фермент являє собою глюкоцереброзидазу людини (GCD). Переважно, GCD включає послідовність амінокислот по суті таку, як послідовність, позначена як SEQ ID NO:8, що кодується послідовністю нуклеїнової кислоти, позначеною як SEQ ID NO:7. Більш переважно, клітину трансформують або трансфікують рекомбінантним полінуклеотидом або вектором експресії, що включає молекулу, при цьому рекомбінантний полінуклеотид додатково 35 включає S промотор вірусу мозаїки цвітної капусти, термінатор октопінсинтази Agrobacterium tumefaciens і регуляторний елемент являє собою омега-трансляційний елемент-енхансер TMV (вірусу мозаїки тютюну), і має послідовність нуклеїнової кислоти по суті таку, як послідовність, позначена SEQ ID NO:13, і кодує GCD, що має послідовність амінокислот по суті таку, як представлено у SEQ ID NO:14. Відповідно до переважних варіантів здійснення, розроблений рекомбінантний високоманозний білок, що продукується описаною вище клітиноюхазяїном. Переважно, високоманозний білок являє собою біологічно активний високоманозний лізосомальний фермент, вибраний з групи, яка склада 89944 18 ється з глюкоцереброзидази (GCD), кислотної сфінгомієлінази, гексозамінідази, -Νацетилгалактозамінідизи, кислотної ліпази, галактозидази, глюкоцереброзидази, -Lідуронідази, ідуронатсульфатази, -манозидази або зіалідази. Більш переважно, лізосомальний фермент являє собою глюкоцереброзидазу людини (GCD). Відповідно до інших переважних варіантів здійснення даного винаходу розроблений рекомбінантний біологічно активний високоманозний фермент, що має принаймні один олігосахаридний ланцюг, який включає незахищений залишок манози. Відповідно до наступних переважних варіантів здійснення, розроблений рекомбінантний білок, що включає першу частину, яка володіє активністю сигнального пептиду, і другу частину, яка володіє активністю лізосомального ферменту, при цьому перша частина викликає переробку другої частини у рослинній клітині так, щоб вона включала принаймні один олігосахаридний ланцюг, який включає незахищений залишок манози. Переважно, лізосомальний фермент включає білок для лікування або профілактики хвороби Гоше. Більш переважно, білок включає hGCD. Переважно, перша частина включає націлюючий сигнальний пептид ER рослинної клітини. Більш переважно, рекомбінантний фермент може зв'язуватися з рецептором манози на клітинімішені у сайті-мішені в організмі пацієнта, який страждає від лізосомальної хвороби накопичення. Найбільш переважно, рекомбінантний лізосомальний фермент володіє підвищеною афінністю по відношенню до клітини-мішені у порівнянні з відповідною афінністю природного лізосомального ферменту по відношенню до клітини-мішені. Також найбільш переважно, рекомбінантний лізосомальний фермент вибирають з групи, яка складається з глюкоцереброзидази (GCD), кислотної сфінгомієлінази, гексозамінідази, -Νацетилгалактозамінідизи, кислотної ліпази, галактозидази, глюкоцереброзидази, -Lідуронідази, ідуронатсульфатази, -манозидази або зіалідази. Переважно, рекомбінантний лізосомальний фермент являє собою глюкоцереброзидазу (GCD). Також переважно, клітина-мішень при сайтімішені являє собою клітину Купфера печінки пацієнта. Відповідно до інших переважних варіантів розроблений рекомбінантний високоманозний білок, що продукується культурою рослинних клітин. Переважно, відмітною особливістю білка є наявність рослинного сигнального пептиду для націлювання білка в ендоплазматичну сітку. Більш переважно, рослинний сигнальний пептид включає пептид для націлювання білка в ендоплазматичну сітку у культурі клітин кореня рослин. Найбільш переважно, культура клітин коренів рослини включає клітини моркви. Ще відповідно до інших переважних варіантів здійснення розроблений рекомбінантний високо 19 манозий білок hGCD, що продукується у культурі рослинних клітин. Відповідно до наступних переважних варіантів здійснення розроблене застосування культури рослинних клітин для продукування високоманозного білка. Відповідно до інших переважних варіантів здійснення розроблений спосіб продукування високоманозного білка, що включає: одержання культури рекомбінантних клітин-хазяїнів, трансформованих або трансфікованих рекомбінантним полінуклеотидом, що кодує рекомбінантний білок; культивування культури клітин-хазяїнів в умовах, що дають можливість експресії білка, де клітинихазяїни продукують білок у високоманозній формі. Переважно, культуру клітин-хазяїнів культивують у суспензії. Найбільш переважно, спосіб додатково включає очищення білка. Відповідно до інших переважних варіантів здійснення, спосіб здійснюють з використанням клітин-хазяїнів, як описано раніше. Переважно високоманозний білок являє собою біологічно активний високоманозний лізосомальний фермент, що має принаймні один олігосахаридний ланцюг, який включає незахищений залишок манози. Більш переважно рекомбінантний фермент зв'язується з рецептором манози на клітині-мішені у сайті-мішені. Найбільш переважно, рекомбінантний фермент володіє підвищеною афінністю по відношенню до клітини-мішені у порівнянні з відповідною афінністю природного лізосомального ферменту по відношенню до клітини-мішені. Переважно лізосомальний фермент вибирають з групи, яка складається з глюкоцереброзидази (GCD), кислотної сфінгомієлінази, гексозамінідази, -Ν-ацетилгалактозамінідизи, кислотної ліпази, -галактозидази, глюкоцереброзидази, -Lідуронідази, ідуронатсульфатази, -манозидази або зіалідази. Більш переважно, лізосомальний фермент являє собою глюкоцереброзидазу (GCD). Найбільш переважно, клітина-мішень при сайті-мішені являє собою клітину Купфера печінки пацієнта. Переважно клітина-хазяїн являє собою клітину коренів рослин, вибрану з групи, яка складається з трансформованої Agrobacterium rihzogenes клітини кореня, клітини селери, клітини імбиру, клітини хрону і клітини моркви. Більш переважно, клітина кореня рослин являє собою клітину моркви. Найбільш переважно, трансформовані клітини-хазяїни моркви вирощують у суспензії. Відповідно до наступних переважних варіантів здійснення, розроблений спосіб лікування пацієнта, який має лізосомальну хворобу накопичення, з використанням екзогенного рекомбїнантного лізосомального ферменту, що включає: одержання рекомбінантної біологічно активної форми лізосомального ферменту, одержаного очищенням з трансформованих клітин кореня рослин і здатного ефективно надходити у клітини з аномальним дефіцитом лізосомального ферменту, де рекомбінантний біологічно активний фермент має незахищений кінцевий залишок манози на приєднаних олігосахаридах; і введення пацієнту терапевтично 89944 20 ефективної кількості рекомбінантного біологічно активного лізосомального ферменту. Даний спосіб необов'язково може бути здійснений з використанням будь-якої клітини-хазяїна і/або білка, як описано вище. Переважно рекомбінантний фермент може зв'язуватися з рецептором манози на клітинімішені у сайті-мішені в організмі пацієнта. Більш переважно, рекомбінантний лізосомальний фермент володіє підвищеною афінністю по відношенню до клітини-мішені у порівнянні з відповідною афінністю природного лізосомального ферменту по відношенню до клітини-мішені. Найбільш переважно, лізосомальний фермент вибирають з групи, яка складається з глюкоцереброзидази (GCD), кислотної сфінгомієлінази, гексозамінідази, -Νацетилгалактозамінідизи, кислотної ліпази, галактозидази, глюкоцереброзидази, -Lідуронідази, ідуронатсульфатази, -манозидази або зіалідази. Також найбільш переважно, лізосомальний фермент являє собою глюкоцереброзидазу (GCD). Також найбільш переважно, лізосомальна хвороба накопичення являє собою хворобу Гоше. Також найбільш переважно, клітина-мішень при сайті-мішені являє собою клітину Купфера печінки пацієнта. Відповідно до інших переважних варіантів здійснення розроблена фармацевтична композиція для лікування лізосомальної хвороби накопичення, що включає як активний інгредієнт рекомбінантний біологічно активний високоманозний лізосомальний фермент, як описано вище, дана композиція необов'язково додатково включає фармацевтично прийнятний розріджувач, носій або ексципієнт. Переважно, лізосомальна хвороба накопичення являє собою хворобу Гоше. Більш переважно, рекомбінантний лізосомальний фермент являє собою біологічно активну високоманозну глюкоцереброзидазу людини (GCD). Відповідно до наступних переважних варіантів здійснення, запропоноване застосування рекомбінантного біологічно активного високоманозного лізосомального ферменту, як описано вище, для одержання лікарського засобу для лікування або профілактики лізосомальної хвороби накопичення. Переважно, хвороба являє собою хворобу Гоше. Більш переважно біологічно активний лізосомальний фермент являє собою біологічно активну високоманозну глюкоцереброзидазу людини (GCD). Винахід буде додатково описаний з використанням наступних фігур, які є тільки ілюстративними і не обмежують об'єм винаходу, який також визначений доданою формулою винаходу. Винахід описаний, тільки як приклад, з посиланням на додані малюнки, де: Фігури 1А-1В На Фіг.1А показана одержана касета експресії, 35 що включає S промотор вірусу мозаїки цвітної капусти, омега-трансляційний елемент-енхансер TMV (вірусу мозаїки тютюну), ER націлюючий сигнал, послідовність GCD людини (також позначену SEQ ID NO:7), вакуолярний сигнал і термінаторну послідовність октопінсинтази з Agrobacterium turnefaciens. 21 На Фіг.1В показана схематична карта скелета плазміди pGreenll. На Фіг.2 показаний вестерн-блот аналіз екстракту трансформованих hGCD клітин з використанням специфічних проти hGCD антитіл. Як позитивний контроль використовували стандарт Церезим (смуга 1), нетрансформований калюс використовували як негативний контроль (смуга 2), різні вибрані екстракти калюсу показані на смугах 3-8. На Фіг.3А-3С показана перша стадія очищення rhGCD на сильній катіонообмінній смолі (MacroPrep high-S носій, Bio-Rad), набитій у колонку ХК (2,6х20см). Колонка була об'єднана з АКТА основною системою (Amersham Pharmacia Biotech), що дозволяє проводити моніторинг провідності, рН і поглинання при 280нм. Елюювання rhGCD проводили зрівноважуючим буфером, що містить 600мМ NaCl. На Фіг.3А представлений стандартний експеримент при проведенні даної стадії очищення. Фракції, зібрані під час проходження експерименту, контролюють за допомогою аналізу ферментативної активності, як показано на Фіг.3В, і об'єднують пробірки, вміст яких виявляє ферментативну активність (у піках елюювання). На Фіг.3С показано забарвлювання кумасином синім елюйованих фракцій, проаналізованих на активність. На Фіг.3D-3F показані відповідні графіки, як на Фіг.3А-3С, але для другої колонки. На Фіг.4А-С показана кінцева стадія очищення рекомбінантного hGCD на смолі з гідрофобною взаємодією (гель TSK, Toypearl Phenyl-650C, Tosoh Corp.), набитій у ХК колонку (2,6х20см). Колонка була об'єднана з АКТА основною системою (Amersham Pharmacia Biotech), що дозволяє проводити моніторинг провідності, рН і поглинання при 280нм. Об'єднану фракцію GCD з попередньої колонки завантажували при швидкості 6мл/хв. з подальшим промиванням зрівноважуючим буфером доти, доки поглинання в УФ не досягало базисної лінії. Чисту GCD елюювали 10мМ цитратним буфером, що містить 50% етанолу. На Фіг.4А показаний стандартний експеримент даної стадії очищення. На Фіг.4В показані фракції, зібрані під час експерименту, які контролювали за допомогою аналізу ферментативної активності. На Фіг.4С показано забарвлювання кумасином синім елюйованих фракцій, проаналізованих на активність. На Фіг.5 показана активність рекомбінантного hGCD після поглинання перитонеальними макрофагами (Фіг.5А-5С), тоді як на Фіг.5В показаний вестерн-блот аналіз рекомбінантної GCD відповідно до даного винаходу. На Фіг.6 показані порівняльні глікозильовані структури rGCD відповідно до даного винаходу. На Фіг.8 показані додаткові N-гліканглікозильовані структури rGCD відповідно до даного винаходу. Білки для фармацевтичного застосування традиційно продукують у системах експресії ссавців і бактерій. В останні декілька років була виявлена багатообіцяюча нова система експресії у рослинах. Внаслідок відносної простоти введення 89944 22 нових генів і потенціалу для масового виробництва білків і пептидів «молекулярна фармацевтика» стає все більш популярною як система експресії білків. Однією з основних відмінностей між тією, що відноситься до ссавців, і рослинною системами експресії білка є зміна у послідовностях глікозилювання білка, викликана відмінністю біосинтетичних шляхів. Показано, що глікозилювання сильно впливає на активність, складчастість, стабільність, розчинність, сприйнятливість до протеаз, швидкість виведення з крові і антигенний потенціал білків. Отже, при будь-якому продукуванні білка у рослинах потрібно брати до уваги потенційні розгалуження рослинного глікозилювання. Вуглеводний фрагмент являє собою одну з найбільш звичайних пост-трансляційних модифікацій білків. Глікозилювання білків поділяють на дві категорії: N-зв'язане і О-зв'язане. Ці два типи відрізняються амінокислотою, до якої приєднаний глікановий фрагмент у білці: N-зв'язаний приєднаний до залишків Asn, тоді як О-зв'язаний приєднаний до залишків Ser або Thr. Крім того, послідовність гліканів кожного типу містить унікальні відмітні особливості. Серед цих двох типів Nзв'язане глікозилювання є більш частим, і його вплив на білки був широко досліджений. О-зв'язані глікани, з іншого боку, є відносно рідкими і відносно їх впливу на білки доступна менша кількість інформації. Більшість доступних даних з глікозилювання білка у рослинах сфокусована на Nзв'язаних, а не на О-зв'язаних гліканах. У даному винаході описана рослинна система експресії, що базується на клітинах трансгенних рослин, які переважно являють собою клітини кореня, необов'язково і переважно вирощені у суспензії. Така система експресії спеціально розроблена для ефективного продукування високоманозного білка, що представляє інтерес. Термін «високоманозний» включає глікозилювання, що має принаймні один незахищений залишок манози. Таким чином, у першому аспекті даний винахід відноситься до клітини-хазяїна, яка продукує високоманозний рекомбінантний білок, що представляє інтерес. Переважно, рекомбінантний білок характеризується сигнальним пептидом ER (ендоплазматичної сітки), більш переважно ER-націлюючим сигнальним пептидом. Альтернативно або додатково, рекомбінантний білок характеризується сигналом, який викликає обхід білком апарату Гольджі. Сигнал переважно дає можливість одержання рекомбінантного білка, який відрізняється високоманозним глікозилюванням, більш переважно шляхом збереження такого глікозилювання і найбільш переважно шляхом направлення в ER і/або шляхом обходу апарату Гольджі. Як описано тут більш детально, такий сигнал переважно виконує як сигнальний пептид, який більш переважно утворює частину послідовності білка, необов'язково і більш переважно шляхом конструювання білка, відмітною особливістю якого є сигнальний пептид як частина білка. Потрібно зазначити, що сигнал необов'язково може являти собою націлюючий сигнал, сигнал збереження, сигнал відхилен 23 ня (обходу) або будь-яку їх комбінацію або будьякий інший тип сигналу, здатного забезпечувати бажану структуру з високоманозним глікозилюванням. Не бажаючи обмежуватися єдиною гіпотезою, потрібно розуміти, що застосування ERнацілюючого сигналу разом з рекомбінантним білком, що продукується у культурі рослинних клітин, здатне подолати транспортування в апарат Гольджі і, отже, зберегти бажане високоманозне глікозилювання. Необов'язково будь-який тип механізму, який здатний продукувати високоманозне глікозилювання, включаючи будь-який тип механізму обходу апарату Гольджі, можна використовувати відповідно до даного винаходу. ER-націлюючі сигнальні пептиди добре відомі у даній галузі, і вони являють собою N-кінцеві сигнальні пептиди. Необов'язково будь-який придатний ERнацілюючий сигнальний пептид можна використовувати відповідно до даного винаходу. Клітина-хазяїн відповідно до даного винаходу необов'язково може бути трансформована або трансфікована (постійно і/або тимчасово) молекулою рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує білок, який представляє інтерес, або вектором експресії, що включає молекулу нуклеїнової кислоти. Така молекула нуклеїнової кислоти включає першу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує цільовий білок, необов'язково і переважно функціонально зв'язану з другою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує вакуолярний направляючий сигнальний пептид. Потрібно зазначити, що як він використаний у даному описі, термін «функціонально» зв'язаний, не відноситься в обов'язковому порядку до фізичного зв'язку. Перша послідовність нуклеїнової кислоти може необов'язково і переважно додатково бути функціонально зв'язаною з третьою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує ЕR(ендоплазматична сітка)-націлюючий сигнальний пептид. Клітина-хазяїн за винаходом відрізняється тим, що білок, який представляє інтерес, продукується клітиною у формі, яка включає принаймні одні незахищений залишок манози, але переважно у високоманозильованій формі. Терміни «клітини», «клітини-хазяїни» або «рекомбінантні клітини-хазяїни» використовуються в даному описі взаємозамінно. Зрозуміло, що такі терміни відносяться не тільки до конкретних клітин, що розглядаються, але і до потомства або потенційного потомства таких клітин. Оскільки визначені модифікації можуть відбуватися у наступних поколіннях або за рахунок мутації, або під впливом навколишнього середовища, таке потомство може, фактично, не бути ідентичним початковій клітині, але все ще включене в об'єм терміну, як він використовується у даному описі. Термін «клітина-хазяїн», як він використовується у даному описі, відноситься до клітин, які можуть бути рекомбінантно трансформовані ізольованою ДНК або вектором експресії, сконструйованим з використанням рекомбінантних ДНК технологій. Як використано у даному описі термін «трансфекція» означає введення нуклеїнової кислоти, наприклад, ізольованої ДНК або вектора експресії, у клітини 89944 24 реципієнти за допомогою опосередкованого нуклеїновою кислотою перенесення гена. Термін «трансформація», як він використаний у даному описі, відноситься до процесу, в якому генотип клітини змінюється внаслідок клітинного поглинання екзогенної ДНК або РНК, і, наприклад, трансформована клітина експресує рекомбінантну форму бажаного білка. Потрібно розуміти, що лікарсько-стійкий або інший маркер, що селектується, призначений, частково, для полегшення селекції трансформантів. Крім того, присутність маркера, що селектується, наприклад, маркера стійкості відносно лікарських препаратів, може використовуватися для запобігання розмноженню забруднюючих мікроорганізмів у культуральному середовищі. Така чиста культура трансформованих клітин-хазяїнів була б одержана шляхом культивування клітин в умовах, які необхідні для виживання індукованого фенотипу. Як вказано вище, клітини-хазяїни за винаходом можуть бути трансфіковані або трансформовані молекулою нуклеїнової кислоти. Як використано у даному описі, термін «нуклеїнова кислота» відноситься до полінуклеотидів, таких як дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК) і, де це є придатним, рибонуклеїнова кислота (РНК). Потрібно також розуміти, що терміни включають, як еквіваленти, аналоги або РНК, або ДНК, одержані з аналогів нуклеотидів і, як застосовно до варіанту здійснення, що описується, полінуклеотиди з одиничним ланцюгом (таким як смисловий або антисмисловий) і з подвійним ланцюгом. Ще в іншому варіанті здійснення клітинахазяїн за винаходом може бути трансфікована або трансформована вектором експресії, що включає рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти. Термін «вектори експресії», як він використаний у даному описі, охоплює вектори, такі як плазміди, віруси, бактеріофаги, фрагменти ДНК, що інтегруються, та інші переносники, які здатні інтегрувати фрагменти ДНК у геном хазяїна. Вектори експресії звичайно являють собою самореплікуючі конструкції ДНК або РНК, що містять бажаний ген або його фрагменти, і функціонально зв'язані генні контрольні елементи, які розпізнаються у відповідній клітині-хазяїні і виконують експресію бажаних генів. Дані контрольні елементи здатні виконувати експресію у придатному хазяїні. Звичайно генні контрольні елементи можуть включати систему прокаріотичного промотору і контрольну систему експресії еукаріотичного промотору. Такі системи звичайно включають промотор транскрипції, необов'язковий оператор для контролю початку транскрипції, енхансери транскрипції для підвищення рівня експресії РНК, послідовність, яка кодує відповідний сайт зв'язування рибосоми, екзонінтронні зчленування РНК, послідовності, які закінчують транскрипцію і трансляцію і так далі. Вектори експресії звичайно містять джерело реплікації, яке дає можливість вектору реплікувати незалежно від клітини-хазяїна. Плазміди являють собою найбільш поширену форму вектора, але інші форми векторів, які виконують еквівалентну функцію, і які є або стануть відомими у даній галузі, підходять для застосуван 25 ня у даному винаході. Дивись, наприклад, Pouwels et al., Cloning Vectors: a Laboratory Manual (1985 і додатки), Elsevier N.Y.; і Rodriquez et al. (eds.), Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, Mass (1988), які включені у даний опис шляхом посилання. Звичайно, такі вектори містять, крім того, специфічні гени, які здатні забезпечити фенотипічну селекцію у трансформованих клітинах. Також передбачається застосування прокаріотичних і еукаріотичних вірусних векторів експресії для експресії генів, що кодують поліпептиди за даним винаходом. Необов'язково, вектор може являти собою загальний вектор рослини (як описано у наведених нижче прикладах). Альтернативно, вектор необов'язково може бути специфічним для клітин коренів. В одному переважному варіанті здійснення клітина-хазяїн за винаходом може являти собою еукаріотичну або прокаріотичну клітину. В конкретному варіанті здійснення клітинахазяїн за винаходом являє собою прокаріотичну клітину, переважно, бактеріальну клітину, найбільш переважно, клітину Agrobacterium tumefaciens. Дані клітини використовуються для інфікування переважних рослинних клітин-хазяїнів, описаних далі. В іншому переважному варіанті здійснення клітина-хазяїн за винаходом може являти собою еукаріотичну клітину, переважно, рослинну клітину, і, найбільш переважно, клітину кореня рослин, вибрану з групи, що включає трансформовану Agrobacterium rihzogenes клітину кореня, клітину селери, клітину імбиру, клітину хрону і клітину моркви. У переважному варіанті здійснення клітина кореня рослини являє собою клітину моркви. Потрібно зазначити, що трансформовані клітини моркви за винаходом вирощують у суспензії. Як зазначено вище і описано у прикладах, дані клітини були трансформовані з використанням клітин Agrobacterium tumefaciens за винаходом. Вектори експресії або молекули рекомбінантних нуклеїнових кислот, що використовуються для трансфекції або трансформації клітин-хазяїнів за винаходом, можуть бути додатково модифіковані відповідно до способів, відомих фахівцям у даній галузі, для додавання, видалення або модифікації яким-небудь іншим чином послідовностей сигнальних пептидів для зміни розщеплення сигнального пептиду або для збільшення або зміни цілеуказання лізосомального ферменту, що експресується, через ендомембранну систему рослини. Наприклад, але не як обмеження, конструкція експресії може бути спеціально розроблена для цілеуказання лізосомального ферменту для секреції, або вакуолярної локалізації або збереження в ендоплазматичній сітці (ER). В одному варіанті здійснення вектор експресії або молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти можуть бути сконструйовані для введення послідовності нуклеотидів, яка кодує сигнал, що направляє лізосомальний фермент у вакуоль рослини. Наприклад, але не як обмеження, молекула реко 89944 26 мбінантної нуклеїнової кислоти, що включена у клітину-хазяїн за винаходом, включає першу послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує лізосомальний фермент, яка функціонально зв'язана з другою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує вакуолярний націлюючий сигнальний пептид, одержаною з основного гена хітинази А тютюну. Даний вакуолярний сигнальний пептид має послідовність амінокислот, позначену як SEQ ID NO:2. Перша послідовність нуклеїнової кислоти необов'язково може бути додатково зв'язана за допомогою функціонального зв'язку з третьою послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує ЕR(ендоплазматична сітка)-націлюючий сигнальний пептид, позначений SEQ ID NO:1. В одному варіанті здійснення молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що включена у клітину-хазяїн за винаходом, додатково включає промотор, який є функціональним у рослинних клітинах. Такий промотор повинен бути функціонально зв'язаний з рекомбінантною молекулою за винаходом. Термін «функціонально зв'язаний» використовується у даному описі для указання того, що перша послідовність нуклеїнової кислоти функціонально зв'язана з другою послідовністю нуклеїнової кислоти, коли перша послідовність нуклеїнової кислоти вміщена у функціональний взаємозв'язок з другою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, промотор є функціонально зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо промотор впливає на транскрипцію або експресію кодуючої послідовності. Необов'язково і переважно функціонально зв'язані послідовності ДНК є прилягаючими (наприклад, фізично зв'язані) і, коли необхідно об'єднати дві протеїн-кодуючі області, знаходяться в одній і тій же рамці зчитування. Таким чином, послідовність ДНК і регуляторна(і) послідовність(ості) зв'язані таким чином, щоб допускати експресію гена, коли придатні молекули (наприклад, транскрипційні активуючі білки) зв'язані з регуляторною(ими) послідовністю(остями). В іншому варіанті здійснення така молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти необов'язково може додатково включати функціонально зв'язаний термінатор, який переважно є функціональним у рослинних клітинах. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за винаходом необов'язково може додатково включати додаткові контрольні, промотуючі і регуляторні елементи і/або маркери, що селектуються. Потрібно зазначити, що дані регуляторні елементи є функціонально зв'язаними з рекомбінантною молекулою. Регуляторні елементи, які можна використовувати у конструкціях експресії, включають промотори, які можуть бути або гетерологічними, або гомологічними по відношенню до клітин рослин. Промотор може являти собою рослинний промотор або не рослинний промотор, який здатний викликати високі рівні транскрипції зв'язаної послідовності у рослинних клітинах і рослинах. Необмежувальні приклади рослинних промоторів, які можна ефективно використовувати при практичній реалізації винаходу, включають вірус мозаїки 35 цвітної капусти (CaMV) S, rbcS, промотор для хлорофіл а/b зв'язувального білка, AdhI, NOS і 27 HMG2, або їх модифікації або похідні. Промотор може бути або конструктивним, або таким, що індукується. Наприклад, але не як обмеження, промотор, що індукується, може являти собою промотор, який стимулює або підвищує експресію нуклеотидної послідовності лізосомального ферменту після механічної активації гена (MGA) рослини, тканини рослини або клітини рослини. Вектори експресії, що використовуються для трансфікування або трансформування клітинхазяїнів за винаходом, можуть бути модифіковані додатково з використанням способів, відомих фахівцям у даній галузі, для посилення або оптимізації експресії гетерологічного гена у рослинах і рослинних клітинах. Такі модифікації включають, але не обмежені вказаним, мутування регуляторних елементів ДНК для збільшення ефективності промотору або для зміни цільового білка. У переважному варіанті здійснення цільовий високоманозний білок, що продукується клітинамихазяїнами за винаходом, може являти собою високоманозний глікопротеїн, що має принаймні один незахищений залишок манози (принаймні один кінцевий залишок манози). Такий високоманозний білок може являти собою, відповідно до іншого переважного варіанту здійснення, лізосомальний фермент, вибраний з групи, яка складається з глюкоцереброзидази (GCD), кислотної сфінгомієлінази, гексозамінідази, -Ν-ацетилгалактозамінідизи, кислотної ліпази, галактозидази, глюкоцереброзидази, -Lідуронідази, ідуронатсульфатази, -манозидази або зіалідази. Термін «лізосомальний фермент», як він використаний у даному описі по відношенню до будьякого такого ферменту і продукту, що продукується в описаній у винаході рослинній систем експресії, відноситься до рекомбінантного пептиду, що експресується у трансгенній рослинній клітині з нуклеотидної послідовності, що кодує лізосомальний фермент людини або тварини, модифікований лізосомальний фермент людини або тварини, або фрагмент, похідне, або модифікацію такого ферменту. Корисні модифіковані лізосомальні ферменти людини або тварини включають, але ну обмежуються вказаним, лізосомальні ферменти людини або тварини, що містять додавання, видалення (делецію) і/або заміщення однієї або декількох природних або штучно введених амінокислот. Розчинні лізосомальні ферменти мають такі початкові стадії біосинтезу, що і секреторні білки, тобто синтез на рибосомі, зв'язування N-кінцевого сигнального пептиду з поверхнею нерівності ендоплазматичної сітки (ER), транспорт у просвіт ER, де відщеплюється сигнальний пептид і приєднання олігосахаридів до специфічних аспарагінових залишків (N-зв'язування) з подальшою модифікацією білка, що утворюється, в апараті Гольджі [von Figura and Hasilik, Annu. Rev. Biochem., 55:167-193 (1986)]. N-зв'язані олігосахариди можуть бути комплексними, різними і гетерогенними і можуть містити високоманозні залишки. Білки піддаються подальшій переробці у пост-ER, відділі, що передує апарату Гольджі, і у цис-апараті Гольджі, утворюючи або N-зв'язаний маноза-6-фосфат (М-6-Р) 89944 28 олігосахарид-залежний або N-зв'язаний (М-6-Р) олігосахарид-незалежний сигнал розпізнавання для розташованих у лізосомах ферментів [Kornfeld & Mellman, Ann. Rev.Cell.Biol, 5:483-525 (1989); Kaplan et al, natl.Acad.Sci. USA, 74:2026 (1977)]. Присутність сигналу розпізнавання М-6-Р приводить до зв'язування ферменту з рецепторами М-6Р (MPR). Такі зв'язані ферменти, що залишилися у клітині, зрештою, упаковуються у лізосомах і таким чином відділяються від білків, націлених для секреції або до плазматичної мембрани. У переважному варіанті здійснення лізосомальний фермент може являти собою глюкоцереброзидазу людини (GCD). У подальшому, у конкретному варіанті здійснення, дану переважну клітину-хазяїна трансформують або трансфікують рекомбінантною молекулою нуклеїнової кислоти, яка додатково включає 35 S промотор вірусу мозаїки цвітної капусти, що переважно має послідовність нуклеїнової кислоти, позначену як SEQ ID NO:9, термінатор октопінсинтази Agrobacterium tumefaciens, що переважно має послідовність нуклеїнової кислоти, позначену як SEQ ID NO:12, і омега-трансляційний елементенхансер TMV (вірусу мозаїки тютюну)! Відповідно до переважного варіанту здійснення дана рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти включає послідовність нуклеїнової кислоти по суті таку, яка позначена SEQ ID NO:13, і кодує високоманозну GCD, що має послідовність амінокислот по суті таку, як представлено у SEQ ID NO:14. Потрібно розуміти, що даний винахід додатково відноситься до вектора експресії, що включає молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує біологічно активний високоманозний лізосомальний фермент. В одному переважному варіанті здійснення даного аспекту, вектор експресії за винаходом включає молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує біологічно активну високоманозну глюкоцереброзидазу людини (GCD). Переважно даний переважний вектор експресії включає рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, яка має послідовність нуклеїнової кислоти по суті таку, яка позначена SEQ ID NO:13. Відповідно до конкретного варіанту здійснення, у переважному векторі експресії використовується плазміда pGREEN II, як описано далі у прикладі 1. Далі потрібно зазначити, що винахід відноситься до касети експресії, яка включає в себе описаний вище вектор експресії. У другому аспекті даний винахід відноситься до рекомбінантного високоманозного білка, що продукується клітиною-хазяїном за винаходом. У переважному варіанті здійснення такий високоманозний білок може являти собою біологічно активний високоманозний лізосомальний фермент, вибраний з групи, яка складається з глюкоцереброзидази (GCD), кислотної сфінгомієлінази, гексозамінідази, -Ν-ацетилгалактозамінідизи, кислотної ліпази, -галактозидази, глюкоцереброзидази, -L-ідуронідази, ідуронатсульфатази, манозидази або зіалідази. Найбільш переважно, даний лізосомальний фермент може являти собою глюкоцереброзидазу людини (GCD). 29 Термін «біологічно активний» використовується у даному описі відносно будь-якого рекомбінантного лізосомального ферменту, що продукується у рослинній системі експресії, для позначення того, що даний рекомбінантний лізосомальний фермент здатний гідролізувати або природний субстрат, або аналог, або синтетичний субстрат відповідного лізосомального ферменту людини або тварини на рівні, що виявляється. Далі, винахід відноситься до рекомбінантного біологічно активного високоманозного лізосомального ферменту, що має принаймні один олігосахаридний ланцюг, який включає незахищений залишок манози. Відповідно до переважного варіанту здійснення рекомбінантний лізосомальний фермент за винаходом може зв'язуватися з рецептором манози на клітині-мішені у сайті-мішені. Переважно, даний сайт може знаходитися в організмі пацієнта, який страждає від лізосомальної хвороби накопичення. Необов'язково і переважно, даний рекомбінантний лізосомальний фермент володіє підвищеною афінністю по відношенню до клітини-мішені у порівнянні з відповідною афінністю природного лізосомального ферменту по відношенню до клітинимішені. У конкретному варіанті здійснення клітинамішень з сайтом-мішенню може являти собою клітину Купфера печінки пацієнта. У переважному варіанті здійснення рекомбінантний лізосомальний фермент може бути вибраний з групи, яка складається з глюкоцереброзидази (GCD), кислотної сфінгомієлінази, гексозамінідази, -Ν-ацетилгалактозамінідизи, кислотної ліпази, -галактозидази, глюкоцереброзидази, -L-ідуронідази, ідуронатсульфатази, манозидази або зіалідази. Найбільш переважно, даний лізосомальний фермент являє собою глюкоцереброзидазу (GCD). У третьому аспекті винахід відноситься до способу продукування високоманозного білка. Відповідно, спосіб за винаходом включає наступні стадії: (а) одержання культури рекомбінантних клітин-хазяїнів, трансформованих або трансфікованих рекомбінантними молекулами нуклеїнових кислот, що кодують рекомбінантний білок, що представляє інтерес, або вектором експресії, що включає рекомбінантні молекули нуклеїнових кислот; (b) культивування вказаної культури клітинихазяїна, одержаної на стадії (а) у суспензії в умовах, що допускають експресію високоманозного білка, де вказані клітини-хазяїни продукують білок у високо манозильованій формі; (с) збір клітин культури, забезпеченої на стадії (а) і виділення білка з клітин; і (d) очищення білка зі стадії (с) з використанням відповідного способу очищення білка. Необов'язково і переважно, рекомбінантний білок може продукуватися рослинними клітинами за винаходом при культивуванні у пристрої, описаному у патенті США 6391638, виданому 21 травня 2002p., і включеному у даний опис шляхом посилання, як якби він був повністю викладений у даному описі. Що стосується умов культивування клітин рослин у суспензії з використанням даного 89944 30 пристрою, то вони описані у патентній заявці США, озаглавленій «Пристрій, система і спосіб культивування клітин/тканин» ("Cell/tissue culturing device, - system and method"), - автором якої є один з авторів даного винаходу і визнаній одночасно разом з даною заявкою, яка включена у даний опис шляхом посилання, як якби вона була повністю викладена тут, і яка була подана у той же день, що і дана заявка. Конкретний і необмежувальний приклад виділення і очищення високоманозного білка, що представляє інтерес, який одержують з використанням способу за винаходом, можна знайти у наведених далі прикладах. У прикладі показано, що рекомбінантна h-GCD, що продукується за винаходом, несподівано виявилася зв'язаною з внутрішньою мембраною трансформованих клітин моркви за винаходом і не секретувалася у середовище. Розчинна rhGCD може бути відділена від дебрису клітин та інших нерозчинних компонентів відповідно до способів, відомих у даній галузі, таких як фільтрування або осадження. Наприклад, після циклу заморожування-відтавання, клітини руйнують і вивільняють внутрішньоклітинні розчинні білки, тоді як rhGCD залишається зв'язаною з нерозчинним дебрисом мембрани. Дану суміш розчинних компонентів і нерозчинного дебрису мембрани потім центрифугують і розчинну фракцію видаляють, спрощуючи таким чином очищення. Зв'язана з мембраною hGCD потім може бути розчинена шляхом механічного руйнування у присутності м'якого детергенту, інгібіторів протеази і нейтралізуючого окисника. Розчинний фермент далі може бути очищений з використанням хроматографічних способів, наприклад, на катіонообмінних колонках і хроматографічних колонках гідрофобної взаємодії. Під час продукування rhGCD у біореакторі і процесу очищення ідентичність, вихід, чистота і ферментативна активність можуть бути визначені за допомогою одного або декількох біохімічних аналізів, включаючи, але не обмежуючись вказаним, визначення гідролізу субстрату ферменту або аналога субстрату, аналіз з використанням електрофорезу на SDSполіакриламідному гелі та імунологічні аналізи, такі як ELISA і вестерн-блот аналіз. Відповідно до переважного варіанту здійснення, клітина-хазяїн, використана у даному способі, включає клітину-хазяїна за винаходом. В іншому переважному варіанті здійснення, високоманозний білок, що продукується способом за винаходом, може являти собою біологічно активний високоманозний фермент, що має принаймні один олігосахаридний ланцюг, який включає незахищений залишок манози. Даний рекомбінантний фермент може зв'язуватися з рецептором манози на клітині-мішені у сайті-мішені. Більш конкретно, рекомбінантний фермент, що продукується способом за винаходом, володіє підвищеною афінністю по відношенню до клітини-мішені у порівнянні з відповідною афінністю природного лізосомального ферменту по відношенню до клітини-мішені. Відповідно клітина-мішень при сайті-мішені може являти собою клітину Купфера печінки пацієнта. 31 У конкретному варіанті здійснення даний лізосомальний фермент може бути вибраний з групи, яка складається з глюкоцереброзидази (GCD), кислотної сфінгомієлінази, гексозамінідази, -Νацетилгалактозамінідизи, кислотної ліпази, галактозидази, глюкоцереброзидази, -Lідуронідази, ідуронатсульфатази, -манозидази або зіалідази. Найбільш переважно, даний лізосомальний фермент може являти собою глюкоцереброзидазу (GCD). В іншому переважному варіанті здійснення клітина-хазяїн, що використовується у способі за винаходом, може являти собою клітину кореня рослини, вибрану з групи, яка складається з трансформованої Agrobacterium rihzogenes клітини кореня, клітини селери, клітини імбиру, клітини хрону і клітини моркви. Найбільш переважно, клітина кореня рослини являє собою клітину моркви. Потрібно особливо зазначити, що трансформовані клітини-хазяїни моркви вирощують у суспензії. У наступному аспекті даний винахід відноситься до способу лікування пацієнта, переважно пацієнта, який відноситься до групи ссавців, що має лізосомальну хворобу накопичення, з використанням екзогенного рекомбінантного лізосомального ферменту. Потрібно розуміти, що розкрите і описане у даному винаході не обмежено конкретними прикладами, стадіями способів і розкритими тут матеріалами, оскільки такі стадії способу і матеріали можуть певною мірою змінюватися. Також потрібно розуміти, що використана у даному описі термінологія використовується тільки з метою опису конкретних варіантів здійснення і не призначена для обмеження, оскільки об'єм даного винаходу буде обмежений тільки доданою формулою винаходу і її еквівалентами. По всьому тексту в описі та у подальшій формулі винаходу, якщо контекст не передбачає іншого, потрібно розуміти, що слово «включати» і його варіації, такі як «включає» і «що включає» мають на увазі включення вказаного цілого або стадії, або груп цілого, або стадій, але не включення будь-якого іншого цілого або стадії, або групи цілого або стадій. Потрібно зазначити, що як це використано в даному описі і доданій формулі винаходу, використана невизначена і визначена форма однини включає посилання на форму множини, якщо контекст чітко не вказує іншого. Наступні приклади є ілюстрацією способів, використаних авторами даного винаходу для здійснення аспектів даного винаходу. Потрібно розуміти, що хоча дані способи є ілюстрацією переважних варіантів здійснення для практичної реалізації винаходу, у світлі даного опису фахівцям у даній галузі буде очевидно, що можна провести численні модифікації, не відступаючи від суті і передбачуваного об'єму винаходу. Приклади Експериментальні методики: Вектори плазмід * CE-T-Was сконструйована з плазміди СЕ, одержаної від професора Галілі (Prof. Galili). [па 89944 32 тент Сполучених Штатів Америки 5367110, 22 листопада (1994)] Плазміду СЕ розщеплювали за допомогою SalI. Зчеплений з SalI кінець притупляли з використанням великого фрагмента ДНК полімерази І. Потім плазміду розщеплювали за допомогою PstI і лігували до фрагмента ДНК, що кодує ERнацілюючий сигнал, від гена основної ендохітинази [Arabidopsis thaliana] ATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTTCTCATCTTTTCA CTTCTCCTATCATTATCCTCGGCCGAATTC і вакуолярний націлюючий сигнал від хітинази А тютюну: GATCTTTTAGTCGATACTATG розщеплювали Smal і PstI. * pGREEN II одержували від Dr.P.Mullineaux [Roger P.Hellens et al., (2000) Plant.Mol.Bio., 42:819832] Експресію від вектора pGREEN II контролю35 вали з використанням S промотору вірусу мозаїки цвітної капусти, омега-трансляційного елементу-енхансера TMV (вірусу мозаїки тютюну) і термінаторної послідовності октопінсинтази Agrobacterium tumefaciens. кДНК hGCD - одержаний від АТСС (каталожний №65696)6 GC-2.2 [GCS-2 т.п.о., лямбда-ЕZZгамма3 Homo sapiens], що містить глюкозидазабета-кислоту [глюкоцереброзидаза]. Довжина вставок (т.п.о.): 2,20; тканина: фібробласт клітини WI-38. Конструкція плазміди експресії кДНК, що кодує hGCD, ампліфікували з використанням прямого 5' CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3' і зворотного 5' CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3' праймерів. Очищений за допомогою ПЛР продукт ДНК розщеплювали ендонуклеазами EcoRI і Bglll (дивись послідовності, що розпізнають, підкреслені у праймерах) і лігували у проміжний вектор, що має касету експресії СЕТ, розщеплену тими ж ферментами. Касету експресії вирізали та елюювали з проміжного вектора і лігували у бінарний вектор pGREEN II з використанням ферментів рестрикції Smal і ХbаІ, утворюючи кінцевий вектор експресії. Стійкість до канаміцину надається за допомогою гена NPTII, керованого за допомогою nos промотору, одержаного разом з вектором pGREEN (Фіг.1В). Одержана касета експресії представлена на Фіг.1А. Одержану плазміду секвенували для того, щоб гарантувати коректне злиття сигналів у рамці зчитування з використанням наступних секвенуючих 35 праймерів: 5' S промотор: 5' СТ CAGAAGACCAGAGGGC 3' і 3' термінатор: 5' CAAAGCGGCCATCGTGC 3'. Створення калюсу моркви і суспензійних культур клітин Створення калюсу моркви і суспензійних культур клітин автори здійснювали аналогічно описаному раніше Torres К.С. (Tissue culture techniques for horticular crops, p.p. 111, 169). Трансформація клітин моркви і виділення трансформованих клітин. Трансформацію клітин моркви заздалегідь проводили з використанням трансформації 33 Argrobacterium, шляхом пристосування раніше описаного способу [Wurtele E.S. and Bulka K. Plant. Sci, 61:253-262 (1989)]. Клітини, вирощені у рідкому середовищі використовували протягом всього способу замість калюсу. Час інкубації і ріст адаптували для трансформації клітин у рідкій культурі. Argrobacterium трансформували з використанням вектора pGREEN II шляхом електропорації [den Dulk-ra, A. And Hooykaas PJ. (1995), Methods Mol.Biol., 55: 63-72], а потім відбирали з використанням 30мг/мл антибіотика паромоміцину. Клітини моркви трансформували з використанням Argrobacterium і відбирали з використанням 60мг/мл антибіотика паромоміцину у рідкому середовищі. Скринінг трансформованих клітин моркви на виділення калюсу, що експресує високі рівні GCD. Через 14 днів після трансформації клітини культури поміщали на тверде середовище при розведенні 3% упакованого об'єму клітин для трансформації калюсу від індивідуальних кластерів клітин. Коли індивідуальний калюс досягав 1-2см у діаметрі, клітини гомогенізували у буфері для SDS зразків і одержані екстракти білка ділили на SDSPAGE [Laemmli U., (1970) Nature 227: 680-885] і переносили на нітроцелюлозну мембрану (нітроцелюлоза hybond C, 0,45 мікрон. Каталожний №RPN203C від Amersham Life Science). Вестернблот аналіз для виявлення GCD проводили з використанням поліклональних антитіл проти hGCD (описано далі). Калюси, що експресують значні рівні GCD, збільшували у розмірах і переносили для росту у рідке середовище для масштабування, очищення білка і аналізу. Одержання поліклональних антитіл. 75 мікрограмів рекомбінантного GCD (Церезим ) суспендували у повному ад'юванті Фрейнда і вводили у вигляді ін'єкції, кожному з двох кроликів. Кожному кролику проводили повторну ін'єкцію через два тижні. У кроликів відбирали кров приблизно через 10 днів після другої ін'єкції і ще раз з тижневими інтервалами доти, доки титр антитіл не починав падати. Після видалення згустку крові сироватку крові ділили на аліквоти і зберігали при 20°С. Масштабоване вирощування високоякісної культури у біореакторах. Приблизно 1см (у діаметрі) калюс клітин генетично модифікованої моркви, що містить ген rhGCD, вміщували в агарові чашки діаметром 9cм Murashige and Skoog, що містять 4,4г/л середовища MSD (Duchefa), 9,9мг/л тіаміну НСl (Duchefa), 0,5мг фолієвої кислоти (Sigma), 0,5мг/л біотину (Duchefa), 0,8г/л гідролізату казеїну (Ducifa), цукор 30г/л і гормони 2-4 D (Sigma). Калюс вирощували протягом 14 днів при 25°С. Суспензійну культуру клітин одержували шляхом субкультивування трансформованого калюсу у рідкому середовищі MSD (Murashige & Skoog (1962), що містить 0,2мг/л 2,4-дихлороцтової кислоти), як добре відомо у даній галузі. Суспензію клітин культивували у колбі Ерленмейєра об'ємом 250мл (робочий об'єм починається з 25мл, через 7 днів збільшується до 50мл) при 25°С при швидкості струшування 60об./хв. Згодом об'єм клітинної 89944 34 культури збільшували до використання 1л колби Ерленмейєра шляхом додавання робочого об'єму до 300мл при тих же умовах. Інокуляцію невеликого біореактора (10л) [дивись WO 98/13469], що містить 4л середовища MSD, проводили, додаючи 400мл суспензії клітин, одержаної з двох колб Ерленмейєра, об'ємом 1л, які культивували протягом семи днів. Після тижня культивування при 25°С з використанням 1л/хв. потоку повітря, середовище MSD додавали до 10л і культивування продовжували при тих же умовах. Після додаткового культивування протягом 5 днів велику частину клітин проціджували і збирали, пропускаючи клітинне середовище через сітку з комірками 80мкм. Надлишкове середовище віддавлювали пресуванням і упакований осад клітин зберігали при -70°С. Додаткові подробиці пристрою біореактора можна знайти у патенті США 6391638, виданому 21 травня 2002p., і процитованому раніше шляхом посилання. Очищення білка Для відділення середовища від нерозчинної GCD заморожений осад клітин, що містить приблизно 100г сирої ваги клітин, відтавали з подальшим центрифугуванням при 17000xg протягом 20 хвилин при 4°С. Нерозчинні матеріали і незруйновані клітини промивали за допомогою повторного суспендування у 100мл промивального буфера (20мМ фосфату натрію, рН 7,2, 2 мМ EDTA) і потім осаджували центрифугуванням при 17000xg протягом 20 хвилин при 4°С. rhGCD (рекомбінантна GCD людини) екстрагували і солюбілізували шляхом гомогенізації осаду у 200мл екстрагувального буфера (20мМ фосфату натрію, рН 7,2, 20мМ EDTA, 1мМ PMSF, 20мМ аскорбінової кислоти, 3,8г полівінілпіролідону (PVPP), 1мМ DTT, 1% Triton-x-100). Гомогенат потім струшували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі та освітлювали центрифугуванням при 17000xg протягом 20 хвилин при 4°С. Осад відкидали і рН супернатанту доводили до рН 5,5 додаванням концентрованої лимонної кислоти. Каламутність, що виникає після доведення рН, освітлювали центрифугуванням у тих же умовах, як описано вище. Подальше очищення проводили за допомогою хроматографічних колонок наступним чином: на першій стадії 200мл освітленого екстракту завантажували на 20мл сильної катіонообмінної смоли (Macro-Prep high-S носій, Bio-Rad), зрівноваженої у 25мМ буфері цитрату натрію, рН 5,5 і набитої у колонку ХК (2,6x20см). Колонка була об'єднана з АКТА основною системою (Amersham Pharmacia Biotech), що дозволяє проводити моніторинг провідності, рН і поглинання при 280нм. Зразок завантажували при швидкості 20мл/хв., після чого колонку промивали зрівноважуючим буфером (25мМ буфер цитрату натрію, рН 5,5) при швидкості потоку 12мл/хв. доти, доки поглинання в УФ не досягало базисної лінії. Попереднє елюювання rhGCD проводили з використанням зрівноважуючого буфера, що містить 200мМ NaCl, і елюювання проводили зрівноважуючим буфером, що містить 600мМ NaCl. Фракції, зібрані під час проходження експерименту, контролювали за допомогою аналізу ферментативної активності, і об'єднували про 35 бірки, вміст яких виявляв ферментативну активність (у піках елюювання). Зібрані зразки розбавляли у воді (1:5), що містить 5% етанолу і рН доводили до 6,0 з використанням NaOH. Елюйовані фракції, що містять rGCD, наносили на другу колонку ХК (1,6x20см), набиту 10мл тієї ж гуми, що і попередня колонка. Смолу на даній колонці зрівноважували 20мМ цитратного буфера, рН 6,0, що містить 5% етанолу. Після завантаження зразка колонку промивали зрівноважуючим буфером і GCD елюювали з колонки за допомогою елююючого буфера (20мМ цитратного буфера, рН 6,0, 5% етанолу і 1М NaCl). Фракції з піком поглинання на стадії елюювання збирали і наносили на третю колонку. Кінцеву стадію очищення проводили на колонці ХК (1,6x20см), набитій 8мл смоли з гідрофобною взаємодією (гель TSK, Toypearl Phenyl650C, Tosoh Corp.). Смолу зрівноважували 10мМ цитратного буфера, рН 6,0, що містить 5% етанолу. Об'єднану фракцію GCD, елюйовану з попередньої колонки, завантажували при швидкості 6мл/хв. з подальшим промиванням зрівноважуючим буфером доти, доки поглинання в УФ не досягало базисної лінії. Чисту GCD елюювали 10мМ цитратним буфером, що містить 50% етанолу, об'єднували і зберігали при -20°С. Визначення концентрації білка. Концентрації білка в екстрактах і фракціях клітин аналізували способом Lowry/Bradford (аналіз білка Bio Rad) [Bradford M., Anal.Biochem. (1976) 72:248] з використанням стандарту бичачого сироваткового альбуміну (фракція V Sigma). Альтернативно, концентрацію у гомогенних зразках білка визначали за поглинанням при 280нм, 1мг/мл=1,4 ОП280. Чистоту визначали за співвідношенням 280/260нм. Аналіз ферментативної активності GCD Ферментативну активність GCD визначали з використанням п-нітрофеніл- -D-глюкопіранозиду (Sigma) як субстрату. Буфер для аналізу містив 60мМ фосфат-цитратного буфера, pH=6, 4мМ меркаптоетанолу, 1,3мМ EDTA, 0,15% Triton Χ100, 0,125% таурохоляту натрію. Аналіз попередньо формували у 96-ямкових планшетах ELISA, 050 мікролітри зразка інкубували з 250 мікролітрами буфера для аналізу і субстрат додавали до кінцевої концентрації 4мМ. Реакційну суміш інкубували при 37°С протягом 60 хвилин. Утворення продукту (п-нітрофеніл, pΝΡ) визначали за поглинанням при 405нм. Поглинання при 405нм контролювали у момент часу t=0 і у кінцевій точці. Через 60 хвилин 6 мікролітрів 5н NaOH додавали у кожну ямку і знову контролювали поглинання при 405нм. Криву посилального стандарту, що паралельно аналізується, використовували для кількісної оцінки концентрацій GCD у зразках, що тестуються [Friedman et al., (1999), Blood, 93(9):2807-16]. Біохімічні аналізи Протеоліз у гелі і мас-спектрометричний аналіз Забарвлені смуги білка у гелі вирізали за допомогою чистого леза бритви і білки у гелі відновлювали з використанням 10мМ DTT і модифікували 200мМ йодацетаміду у 10мМ бікарбонаті амонію. Шматки гелю обробляли 50% ацетонітри 89944 36 лом у 10мМ бікарбонаті амонію для видалення барвника з білків з подальшим висушуванням шматків гелю. У висушених шматках гелю відновлювали вологовміст з використанням 10% ацетонітрилу у 10мМ бікарбонаті амонію, що містить приблизно 0,1мкг трипсину на зразок. Шматки гелю інкубували протягом ночі при 37°С і одержані пептиди виділяли 60%-ним ацетонітрилом з додаванням 0,1% трифторацетату. Розщеплені трипсином пептиди розділяли за допомогою хроматографії з оберненою фазою на 0,1x300мм кварцових капілярних колонках (J&W, внутрішній діаметр 100 мікрометрів) наповнених самостійно пористим R2 (Perspective). Пептиди елюювали з використанням лінійного градієнта протягом 80 хвилин, починаючи від 5 до 95% ацетонітрилу з додаванням 0,1% оцтової кислоти у воді при швидкості потоку приблизно 1мкл/хв. Рідину з колонки піддавали електророзпиленню у мас-спектрометрі з іонною пасткою (LCQ, Finnegan, San Jose, СА). Mac-спектрометричний аналіз проводили у режимі позитивних іонів з використанням повного МС-сканування, що повторюється, з подальшою індукованою зіткненням дисоціацією (CID) найбільш домінуючого іона, вибраного з першого МС-скану. Mac-спектрометричні дані порівнювали з модельованим протеолізом і CID білків у NR-NCBI базі даних з гикористанням програмного забезпечення Sequest [J.Eng and J.Yates, University of Washington and Finnegan, San Jose]. Амінні кінці білка секвенували на пептидному секвенаторі Peptide Sequencer 494А (Perkin Elmer) відповідно до інструкцій виробника. Поглинання GCD перитонеальними макрофагами Відомо, що направлення GCD до макрофагів і поглинання макрофагами опосередковується маноза/N-ацетилпіюкозімінним рецептором і може бути визначене з використанням триогліколятдобутих перитонеальних макрофагів, одержаних у мишей, як описано Stahl P. і Gordon S. [J.cell Biol. (1982) 93(1): 49-56]. Коротко, мишам (самки, штам С57-В6) внутрішньочеревинно вводили 2,5мл 2,4% Bacto-тіогліколятного середовища ваг./об. у декстрозі (Difco Cat. No. 0363-17-2). Через 4-5 днів оброблених мишей умертвляли шляхом зміщення шийних хребців і порожнину очеревини ополіскували забуференим фосфатом фізіологічним розчином. Клітини осаджували центрифугуванням (1000xg, 10 хвилин) і повторно суспендували у DMEM (Belt Haemek, Israel), що містить 10% фетальної телячої сироватки. Потім клітини поміщали з 5 розрахунку 1-2х10 клітин/ямку у 96-ямкових планшетах для культур тканин та інкубували при 37°С. Через 90 хвилин не прилиплі клітини промивали три рази з використанням PBS і прилиплі макрофаги інкубували протягом 90 хвилин при 37°С у культуральному середовищі, що містить визначені кількості rhGCD, які коливаються від 0 до 40 мікрограмів у кінцевому об'ємі 200 мікролітрів, за відсутності і у присутності дріжджової манани (2-10, 5мг/мл). Після інкубації середовище, що містить надлишок rGCD, видаляли і клітини промивали три рази PBS, а потім лізували з викорис 37 танням лізисного буфера (10мМ Tris, рН=7,3, 1мМ MgCl2, 0,5% NP-40 та інгібітори протеази). Активність rGCD, поглинутої клітинами, визначали, піддаючи клітинні лізати глікозидазному аналізу in vitro, як описано вище. Приклад 1 Конструювання плазміди експресії У даному прикладі більш детально описано конструювання ілюстративної плазміди експресії, використаної у наступних прикладах. кДНК, що кодує hGCD (ATTC. Номер клону 65696), ампліфікували з використанням прямого 5' CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3' (також позначеного як SEQ ID NO:1) і зворотного 5' CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3' (також позначеного як SEQ ID NO:2) праймерів. Очищений ПЛР продукт ДНК розщеплювали ендонуклеазами EcoRI і Bglll (дивись послідовності, що розпізнають, підкреслені у праймерах) і лігували у проміжний вектор, що має касету експресії СЕ-Т, розщеплену тими ж ферментами. СЕ-Т включає ER націлюючий сигнал MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEA (також позначений як SEQ ID NO:3) з основного гена ендохітинази [Arabidopsis thaliana] і вакуолярний націлюючий сигнал хітинази А тютюну: DLLVDTM* (також позначений як SEQ ID NO:4). Касету експресії вирізали і елюювали з проміжного вектора і лігували у бінарний вектор pGREENII з використанням ферментів рестрикції Smal і ХbаІ, утворюючи кінцевий вектор експресії. Стійкість до канаміцину надається за допомогою гена NPТll, керованого за допомогою nos промотору разом з вектором pGREEN (Фіг.1В). Одержана касета експресії представлена на Фіг.1А. Одержану плазміду секвенували для того, щоб гарантувати коректне злиття сигналів у рамці зчитування з використанням наступних секвенуючих праймерів: 35 Праймер з 5' S промотору: 5' CTCAGAAGACCAGAGGGC 3' (також позначений як SEQ ID NO:5) і 3' термінатор: 5' CAAAGCGGCCATCGTGC 3' (також позначений як SEQ ID NO:6). Верифікована клонована кодуюча послідовність hGCD позначена як SEQ ID NO:7. Приклад 2 Трансформація клітин моркви і скринінг для виявлення трансформованих клітин, що експресують rhGCD У даному прикладі описується ілюстративний спосіб трансформування клітин моркви відповідно до даного винаходу, як він використаний у прикладі нижче. Трансформацію клітин моркви заздалегідь проводили з використанням трансформації Argrobacterium, як описано раніше [Wurtele and Bulka (1989), там же]. Генетично модифіковані клітини моркви висівали на агаровому середовищі Murashige і Skoog, що містить антибіотики для відбору трансформантів. Як показано на Фіг.2, екстракти, одержані від зростаючого калюсу, тестували на експресію GCD за допомогою вестерн-блот аналізу з використанням поліклональних антитіл проти hGCD і порівнювали з церезином як стандартом (позитивний контроль) і екстрактами нетран 89944 38 сформованих клітин (негативний контроль). Серед різних протестованих калюсів, один калюс (номер 22) був відібраний для масштабованого росту і очищення білка. Вестерн-блот аналіз проводили наступним чином. Для даного аналізу білки з одержаного зразка ділили електрофорезом на SDS поліакриламідному гелі і переносили на нітроцелюлозу. Для цієї мети SDS поліакриламідні гелі одержували наступним чином. SDS гелі складалися з гелю, що концентрує, і гелю, що розділяє (відповідно до Laeinmli, UK, 1970, Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriphage T4, Nature 227, 680-685). Склад гелів, що розділяють, був наступним: 12% акриламіду (Bio-Rad), 4 мікролітри TEMED (Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметилетилендіамин, каталожний номер Sigma Т9281) на 10мл розчину гелю, 0,1% SDS, 375мМ Tris-HCl, pH 8,8 і персульфат амонію (APS), 0,1% TEMED і персульфат амонію використовували у даному контексті як джерела вільних радикалів для полімеризації. Приблизно через 20 хвилин після ініціювання полімеризації гель, що концентрує, (3% акриламіду, 0,1% SDS, 126мМ Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% APS і 5 мікролітрів TEMED на 5мл розчину гелю, що концентрує) виливали на гель, що розділяє, і вводили гребінку з 12 або 18 проміжками для створення ямок для зразків. Анодну і катодну камери наповнювали ідентичними буферними розчинами: Tris-гліциновий буфер, що містить SDS (Biorad, каталожний номер 161-0772), рН 8,3. Матеріал, що містить антиген, обробляли 0,5 об'єму буфера для завантаження зразка (30мл гліцерину (Sigma, каталожний номер G9012), 9% SDS, 14% меркаптоетанолу (Sigma, каталожний номер М6250), 187,5мМ Tris-HCl, рН 6,8, 500 мікролітрів бромфенолу синього, всі об'єми на 100мл буфера для зразків) і потім суміш нагрівали при 100°С протягом 5 хвилин і завантажували на гель, що концентрує. Електрофорез проводили при кімнатній температурі протягом відповідного проміжку часу, наприклад, 45-60 хвилин, з використанням постійного амперажу у 50-70 вольт, після чого протягом 5460 хвилин при 180-200 вольтах для гелів розміром 13 на 9см. Потім антигени переносили на нітроцелюлозу (Schleicher and Schuell, Dassel). Перенесення білка здійснювали по суті, як описано у даному описі. Гель розміщували, разом з прилягаючою нітроцелюлозою, між листами фільтрувального паперу Whatmann 3MM, провідним спіненим матеріалом товщиною 0,5см і дротяними електродами, які проводили струм за допомогою платинових електродів. Фільтрувальний папір, спінений матеріал і нітроцелюлозу ретельно вимочували у буфері для перенесення (буфер TG від Biorad, каталожний номер 161-0771, розведений у 10 разів метанолом і водним буфером (20%-ний метанол)). Перенесення було здійснене при 100 вольтах протягом 90 хвилин при 4°С. Після перенесення вільні сайти зв'язування на нітроцелюлозі насичували при 4°С протягом ночі з використанням буфера, що блокує, який містить 1% сухого молока (Dairy America) і 0,1% Tween 20 39 (Sigma Cat P1379), розведеного фосфатним буфером (Riedel deHaen, каталожний номер 30435). Смуги блоту інкубували з антитілом (розведення 1:6500 у фосфатному буфері, що містить 1% сухого молока і 0,1% Tween 20 як вказано вище, рН 7,5) при 37°С протягом 1 години. Після інкубації з антитілом блот промивали три рази у кожному випадку по 10 хвилин з використанням PBS (забуферений фосфатом буфер фосфату натрію (Riedel deHaen, каталожний номер 30435)). Потім смуги блоту інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години з відповідним вторинним антитілом (козяче антикроляче антитіло (ціла молекула) HRP (Sigma, каталожний номер А-4914)), розведення 1:3000 у буфері, що містить % сухого молока (Dairy America) і 0,1% Tween 20 (Sigma Cat P1379), розведеному фосфатним буфером (Riedel deHaen, каталожний номер 30435). Після промивання декілька разів з використанням PBS смуги блоту забарвлювали проявними реагентами ELC (Amersham RPN 2209). Після занурення блотів у реагенти ELC блоти піддавали впливу рентгенівської плівки FUJI SUPER RX 18x24 і проявляли з використанням проявника FUJI-ANATOMIX і фіксажу (FUJI-X fix каталожний номер FIXRTU 1 з 2). Смуги, що характеризують білки, які були зв'язані антитілом, ставали видимими після такої обробки. Масштабоване вирощування високоякісної культури у біореакторах. Суспензійні культури калюсу 22 одержували шляхом субкультивування трансформованого калюсу у рідкому середовищі. Клітини культивували при струшуванні у колбах Ерленмейєра доти, доки загальний об'єм не виявлявся достатнім для інокулювання біореактора (як описано в експериментальних методиках). Генетично модифіковані клітини моркви можна культивувати місяцями, і збір клітин можна приводити з циклічністю у 5-7 днів (дані не показані). На сімнадцятий день культивування, коли кількість продукування rhGCD у клітинах моркви досягає максимуму, клітини збирають, пропускаючи культуру через сітку з діаметром комірок 100меш. Потрібно зазначити, що клітини можна збирати за допомогою способів, відомих у даній галузі, таких як фільтрування або центрифугування Запакований осад клітин, який забезпечує матеріал для очищення hGCD до гомогенності, можна зберігати при температурі заморожування. Приклад 3 Очищення рекомбінантного активного білка HGCD з трансформованих клітин моркви Встановлено, що рекомбінантна hGCD, що експресується у трансформованих клітинах моркви, зв'язана з внутрішніми мембранами клітин і не виділяється у середовище. Механічно зруйновані клітини залишають rGCD зв'язану з нерозчинним дебрисом мембрани (дані не показані). Потім rGCD розчиняли з використанням м'яких детергентів і відділяли від клітинного дебрису та інших нерозчинних компонентів. Розчинний фермент далі очищали з використанням хроматографічних методів, включаючи катіонообмінні хроматографічні колонки і колонки гідрофобної взаємодії, як описано в експериментальних методиках. 89944 40 Для відділення середовища від нерозчинної GCD заморожений осад клітин, що містить приблизно 100г сирої ваги клітин, відтавали з подальшим центрифугуванням при 17000xg протягом 20 хвилин при 4°С. Нерозчинні матеріали і незруйновані клітини промивали за допомогою повторного суспендування у 100мл промивального буфера (20мМ фосфату натрію, рН 7,2, 20мМ EDTA) і осадження центрифугуванням при 17000xg протягом 20 хвилин при 4°С. rGCD екстрагували і солюбілізували шляхом гомогенізації осаду у 200мл екстрагувального буфера (20мМ фосфату натрію, рН 7,2, 20мМ EDTA, 1мМ PMSF, 20мМ аскорбінової кислоти, 3,8г полівінілпіролідону (PVPP), 1мМ DTT, 1% Triton-x-100 (Sigma)). Гомогенат струшували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі і освітлювали центрифугуванням при 17000xg протягом 20 хвилин при 4°С. Осад відкидали і рН супернатанту доводили до рН 5,5 додаванням концентрованої лимонної кислоти. Каламутність, що виникає після доведення рН, освітлювали центрифугуванням у тих же умовах, як описано вище. Подальше очищення проводили за допомогою хроматографічних колонок наступним чином: на першій стадії 200мл освітленого екстракту завантажували на 20мл сильної катіонообмінної смоли (Macro-Prep high-S носій, Bio-Rad), зрівноваженої у 25мМ буфері цитрату натрію, рН 5,5, і набитої у колонку ХК (2,6x20см). Колонка була об'єднана з АКТА основною системою (Amersham Pharmacia Biotech), що дозволяє проводити моніторинг провідності, рН і поглинання при 280нм. Зразок завантажували при швидкості 20мл/хв., після чого колонку промивали зрівноважуючим буфером (25мМ буфер цитрату натрію, рН 5,5) при швидкості потоку 12мл/хв. доти, доки поглинання в УФ не досягало базисної лінії. Попереднє елюювання rhGCD проводили з використанням зрівноважуючого буфера, що містить 200мМ NaCl, і елюювання проводили зрівноважуючим буфером, що містить 600мМ NaCl. Фракції, зібрані під час проходження експерименту, контролювали за допомогою аналізу ферментативної активності, і об'єднували пробірки, вміст яких виявляв ферментативну активність (у піках елюювання). Зібрані зразки розбавляли у воді (1:5), що містить 5% етанолу і рН доводили до 6,0 з використанням NaOH. На Фіг.3А показаний стандартний експеримент даної стадії очищення. Фракції, зібрані під час експерименту, контролювали за допомогою аналізу ферментативної активності, як показано на Фіг.3В і Фіг.3С, що демонструють забарвлювання кумасином синім елюйованих фракцій, проаналізованих на активність. Елюйовані фракції, що містять rGCD, наносили на другу колонку ХК (1,6x20см), набиту 10мл тієї же гуми, що і попередня колонка, для проведення другої стадії очищення. Смолу на даній колонці зрівноважували 20мМ цитратного буфера, рН 6,0, що містить 5% етанолу. Після завантаження зразка колонку промивали зрівноважуючим буфером і rGCD елюювали з колонки за допомогою елююючого буфера (20мМ цитратного буфера рН 6,0, 5% етанолу і 1М NaCl). На Фіг.3В показаний 41 стандартний експеримент даної стадії очищення. Фракції, зібрані під час експерименту, контролювали за допомогою аналізу ферментативної активності, як показано на Фіг.3Е і Фіг.3F, що демонструють забарвлювання кумасином синім елюйованих фракцій, проаналізованих на активність. Фракції, що мають пік поглинання на стадії елюювання збирали і наносили на третю колонку, для проведення третьої стадії очищення. Третю стадію очищення проводили на колонці ХК (1,6x20см), набитій 8мл смоли з гідрофобною взаємодією (гель TSK, Toypearl Phenyl-650C, Tosoh Corp.). Смолу зрівноважували 10мМ цитратного буфера, рН 6,0, що містить 5% етанолу. Об'єднану фракцію GCD з попередньої колонки завантажували при швидкості 6мл/хв. з подальшим промиванням зрівноважуючим буфером доти, доки поглинання в УФ не досягало базисної лінії. Чисту GCD елюювали 10мМ цитратним буфером, що містить 50% етанолу, об'єднували і зберігали при 20°С. На Фіг.4А показаний стандартний експеримент даної стадії очищення. Фракції, зібрані під час експерименту, контролювали за допомогою аналізу ферментативної активності (Фіг.4В), на Фіг.4С показано забарвлювання кумасином синім елюйованих фракцій, проаналізованих на активність. Для порції клітин, що обробляється, призначеної для очищення, білок rGCD очищали до рівня, що перевищує 95%; якщо проводили тільки першу і третю стадії, чистота досягала рівня вище 80% (результати не представлені). Біохімічний аналіз. Для підтвердження ідентичності очищеного rGCD проводили Mass-Spec Mass-Spec (MSMS) аналіз. Одержані результати показали 49% межі послідовності білка, яка відповідає послідовності амінокислот, що прогнозується, на основі касети експресії ДНК, включаючи лідерний пептид і націлюючі послідовності. Поглинання і активність рекомбінантної hGCD у перитонеальних макрофагах. Для того, щоб визначити, чи була продукована у моркві rhGCD глікозильована правильним чином, і чи може вона поглинатися клітинами-мішенями і отже використовуватися для лікування хвороби Гоше, далі аналізували здатність rhGCD зв'язуватися і поглинатися макрофагами. Націлювання rhGCD на маркофаги опосередковується рецептором манози/N-ацетилглюкозаміну (Man/GlcNAc) і може бути визначене з використанням перитонеальних макрофагів, що виявляють тіогліколят. Як показано на Фіг.5, rGCD поглинається клітинами на високому рівні. На Фіг.5А показано поглинання клітинами rGCD відповідно до даного винаходу відносно концентрації манану. На Фіг.5А показане поглинання на порівнянних рівнях церезиму (даний препарат був одержаний з 80%-ною чистотою з використанням тільки першої і третьої описаних вище стадій очищення). На Фіг.5В і 5С показано, що поглинання rGCD знаходиться на більш високому рівні, ніж для церезиму , оскільки даний препарат був одержаний 89944 42 з чистотою, більше 95% з використанням всіх трьох описаних вище стадій очищення. Що стосується Фіг.5С, зрозуміло, що процент специфічної активності від загальної активності, що інгібується 4мг/мл манану, вище для GCD за даним винаходом (rGCD або рекомбінантна GCD людини), ніж для доступного у наш час на ринку продукту наступним чином: GCD (CB-mix1, яка являє собою rGCD за даним винаходом) - 75%, церезим - 65%. Крім того, як показано на фігурах, додавання манану чітко інгібує зв'язування rGCD клітинами. При концентрації у 2мг/мл манану, зв'язування rGCD інгібувалося на 50%. Дані результати показують, що навіть без модифікації структур глікану, rhGCD, експресований і очищений з трансформованих клітин моркви, специфічно поглинається клітинами-мішенями макрофагів за допомогою Man/GlcNAc рецепторів. Більш того, даний рекомбінантний rhGCD є ферментативно активним. На Фіг.5D показано, що rhGCD також розпізнається антитілами проти GCD у вестерн-блот аналізі; rGCD відноситься до білка відповідно до даного винаходу, тоді як стандарт GCD (показаний при 5, 10 і 25нг на смугу) являє собою одержану з комерційного джерела GCD (Церезим ). Приклад 4 Токсикологічне дослідження Матеріал, одержаний відповідно до згаданого вище способу очищення тестували згідно зі стандартними протоколами токсикологічного тестування (Guidance for Industry on Single Dose Acute Toxicity Testing for Pharmaceuticals (Посібник для промисловості з тестування гострої токсичності одноразової дози фармацевтичних засобів), Center for Drug Evaluation and Research (CDER), PT1 (61 Fr 43934, August 26, 1996) і ICН М3 (M) Non-clinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical trials for Pharmaceuticals (Дослідження неклінічної безпеки при проведенні клінічних випробувань фармацевтичних препаратів для людей) СРМР/ІСН/286/95 модифікація, 16 листопада 2000р.). Мишей ін'єктували наступним чином. Після першої дози 1,8мг/кг (клінічна доза) вводили дози 9 і 18мг/кг. Групи тестування включали по шість мишей (ICR CD01; 3 самця і 3 самки), які одержували rGCD відповідно до даного винаходу (у рідкому носії, що містить 25мМ цитратного буфера, 150мМ NaCl, 0,01 Tween 80, 5% етанолу), і інші шість мишей обробляли тільки носієм як контрольну групу. Потім за мишами спостерігали протягом 14 днів і проводили евтаназію. Жодна з мишей не померла перед проведенням евтаназії за розкладом. Жодна з мишей не продемонструвала яких-небудь помітних ефектів від обробки. У жодної з мишей не виявили явно помітної патології і/або змін ваги тіла. Приклад 5 Аналіз глікозилювання Був проведений аналіз структур гліканів, присутніх на rGCD, продукованому, як описано у попередніх прикладах. Як детально описано далі, результати показують, що більшість гліканів міс 43 тить термінальні залишки манози, а також має високоманозні структури. Встановлено, що переважно, високоманозний продукт є біологічно активним, і отже немає необхідності у подальших стадіях для його активації. Наступні способи були використані для визначення структури глікозилювання рекомбінантного hGCD, продукованого відповідно до наведених вище прикладів. Коротко, моносахаридні зв'язки як в N-, так і в О-зв'язаних гліканах визначали за допомогою гідролізу і ГХ-Мас-спектрометричної стратегії. У даному способі оцінюється тип зв'язку вуглеводів з пептидом і загальний моносахаридний склад глікопротеїну. На основі попередніх знань і також співвідношень між різними моносахаридами, за допомогою даного способу можна запропонувати тип гліканів на глікопротеїні. Дана інформація важлива для оцінки можливих структур гліканів, присутніх у білці. З використанням іншого способу проводили олігосахаридний аналіз популяції N-глікану. Проводили мас-спектральний FAB і MALDI-TOF аналізи після розщеплення аліквот зразків трипсином і пептид-N-глікозидазою F (PNGaseF) і вичерпного метилювання гліканів. Даний спосіб використовується для роз'єднання і виділення N-зв'язаних вуглеводів з ферментативно розщепленого глікопротеїну. Визначали маси популяції гліканів у виділеній суміші гліканів і їх маси порівнювали з масами відомих структур за базами даних з точки зору аналізу композиції моносахаридів. Структури, що пропонуються, базуються також на схемі глікозилювання організму-джерела. Інший спосіб включав аналіз популяції Огліканів після відновного елімінування оброблених трипсином і (PNGaseF) глікопептидів, знесолення і вичерпного метилування. О-глікани не вивільняються PNGaseF, отже глікани, що залишаються зв'язаними з пептидами, найбільш ймовірно являють собою О-зв'язані глікани. Дані глікани потім вивільняють шляхом відновного елімінування і аналізують їх маси. Аналіз композиції моносахаридів (підсумовано нижче) виявив характеристичний розподіл гексоз, гексозамінів і пентоз, характерних для рослинного глікозилювання. Співвідношення між GlcNac і манозою дозволяє припустити, що характерні Nзв'язані структури є домінуючими у популяції гліканів. Mac-спектрометричний аналіз N-гліканів з hGCD, продукованої як описано вище, вказує, що домінуюча популяція N-гліканів має склад моносахаридів Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc2. Матеріали і методи Аналіз проводили з використанням комбінації газової хроматографії - мас-спектрометрії (ГХ-МС), мас-спектрометрії з бомбардуванням швидкими атомами (FAB-MS) і мас-спектрометрії з використанням уповільненої екстракції - матрицядопоміжної лазерної десорбційної іонізації - часу прольоту (DE-MALDI-TOF MS). Для аналізу олігосахаридів, популяцію Nгліканів аналізували за допомогою масспектрометрії FAB-MS і MALDI-TOF після розщеплення аліквот зразків трипсином і пептид-N 89944 44 глікозидазою F (PNGaseF) і вичерпного метилування гліканів. Популяцію О-гліканів аналізували після відновного елімінування оброблених трипсином і (PNGaseF) глікопептидів, знесолення і вичерпного метилування. Моносахаридні зв'язки як для N-, так і для Огліканів, визначали з використанням гідролізу, і ГХМС стратегії для одержаних похідних. Експериментальний опис Зразок Одержаним ампулам зі зразками присвоювали унікальний номер зразка наступним чином (таблиця 1) Таблиця 1 Продукт Посилальний номер Глюкоцереброзидаза. Чотири пробірки, що містять по 1мл зразка у кожній при встановленій концентрації 0,8мг/мл у 25мМ цитратному буфері, рН 6,0, 0,01% Tween 80 62995 62996 62997 62998 Зразки зберігали при температурі між -10 і 30°С до моменту, коли вони будуть потрібні. Хімія білка Діаліз цілісних зразків Одну ампулу (що містить 1мл білка у встановленій концентрації 0,8мг/мл) вводили у касету для діалізу Slide-A-Lyzer (відтинання за молекулярною масою 10кДа) і проводили діаліз при 4°С протягом 24 годин проти води, при цьому воду замінювали 3 рази. Після діалізу зразок видаляли з касети і ліофілізували. Розщеплення трипсином цілісних зразків Діалізовані, ліофілізовані зразки повторно суспендували у 50мМ амоній-бікарбонатному буфері, доведеному до рН 8,4 10% водним аміаком і розщеплювали обробленим ТРСК трипсином протягом 4 годин при 37°С відповідно до SOPs B001 і В003. Реакцію закінчували шляхом вміщення зразка на 2 хвилини у нагрівальний блок при температурі 95°С з подальшою ліофілізацією. Вуглеводна хімія Розщеплення пептид-N-пнкозидазою А Розщеплену трипсином суміш пептид/глікопетид зі зразка глікопротеїну обробляли ферментом пептид-N-глікозидазою A (PNGaseF) в амонійацетатному буфері, рН 5,5 при 37°С протягом 15 годин. Реакцію зупиняли шляхом ліофільного сушіння. Одержані продукти очищали з використанням катриджу C18 Sep-Pak. Відновне елімінування Фракцію Sep-Pak, що містить потенційні Озв'язані глікопептиди, розчиняли у розчині, що містить 10мг/мл боргідриду натрію в 0,05М гідроксиді натрію та інкубували при 45°С протягом 16 годин. Реакцію закінчували додаванням льодяної оцтової кислоти. Висолювання відновно елімінованого матеріалу. Висолювання з використанням кульок смоли Dowex проводили відповідно до SOP B022. Зразок 45 завантажували на колонку та елюювали з використанням 4мл 5%-ної водної оцтової кислоти. Зібрану фракцію ліофілізували. Вичерпне метилування вивільнених вуглеводів Для N-зв'язаних вуглеводів, елюйованих 5%ною оцтовою кислотою з фракції Sep-Pak і потенційних О-зв'язаних гліканів, вивільнених за допомогою відновного елімінування, проводили вичерпне метилування з використанням методики (SOP В018) із застосуванням гідроксиду натрію (NІаОН)/йодистого метилу (МеІ). Частину перметильованої суміші N-гліканів аналізували з використанням мас-спектрометричних аналізів FAB-MS і MALDI-TOF MS, а залишок піддавали аналізу на зв'язування. Аналіз зв'язування N-зв'язаного вуглеводу Одержання похідних Зразок суміші перметильованих гліканів, одержаної після розщеплення трипсином і PNGase або відновного елімінування, гідролізували (2М ТФОК, 2 години при 120°С) і відновлювали (бордейтерид натрію (NaBD4) у 2М NH4OH, 2 години при кімнатній температурі, SOP B025). Борат, що утворюється при руйнуванні бордейтериду, видаляли, 3 рази додаючи суміш метанолу з льодяною оцтовою кислотою (90:10) з подальшою ліофілізацією. Потім зразки ацетилювали з використанням оцтового ангідриду (1 година при 100°С). Ацетильовані зразки очищали екстракцією у хлороформ. Частково метильовані альдитолацетати потім досліджували за допомогою газової хроматографії/мас-спектрометрії (ГХ/МС). Стандартні суміші частково метильованих альдитолацетатів і пустий зразок також аналізували при тих же умовах. Газово-рідинна хроматографія/масспектрометрія (ГХ/МС) Аліквоту (1мкл) зразка вуглеводів після одержання похідних, розчинених у гексані, аналізували методом ГХ/МС з використанням Perkin Elmer Turbomass Gold мас-спектрометра з газовим хроматографом Autosystem XL і системою даних Dell при наступних умовах: Газова хроматографія Колонка: DB5 Упорскування: прямо у колонку Температура інжектора: 40°С Програма: 1 хвилина при 40°С, потім 70°С/хвилину до 100°С, витримування при 100°С протягом 1 хвилини, потім 8°С/хвилину до 290°С, нарешті витримування при 290°С протягом 5 хвилин Газ-носій: гелій Мас-спектрометрія Напруга іонізації: 70еВ Спосіб одержання даних: сканування Діапазон мас: 35-450 дальтон Розрізнення мас-спектра: одиниця Аналіз цукрів непорушеної глюкоцереброзидази Одержання похідних Аліквоту, еквівалентну 500мкг глюкоцереброзидази, ліофілізували з використанням 10мкг арабітолу як внутрішнього стандарту. Потім її метанолізували протягом ночі при 80°С і сушили в 89944 46 атмосфері азоту. Моносахариди, що вивільнилися, потім повторно N-ацетилювали з використанням розчину метанолу, піридину і оцтового ангідриду, сушили знову в атмосфері азоту і перетворювали у триметилсилільні (ТМС) похідні відповідно до SOP B023. ТМС-похідні відновлювали в об'ємі в атмосфері азоту, розчиненого у 2мл гексану і обробляли ультразвуком протягом 3 хвилин. Зразки потім залишали зрівноважуватися при 4°С протягом ночі. Паралельно одержували пустий зразок, що містить 10мкг арабітолу, і стандартну суміш моносахаридів, що містить по 10мкг фукози, ксилози, манози, галактози, глюкози, Nацетилгалактозаміну, N-ацетилглюкозаміну, Nацетилнеурамінової кислоти і арабітол. ТМСпохідні потім досліджували методом газової хроматографії/мас-спектрометрії (ГХ/МС). Газово-рідинна хроматографія/масспектрометрія (ГХ/МС) Аліквоту (1мкл) зразка вуглеводів після одержання похідних, розчинених у гексані, аналізували методом ГХ/МС з використанням Perkin Elmer Turbomass Gold мас-спектрометра з газовим хроматографом Autosystem XL і системою даних Dell при наступних умовах: Газова хроматографія Колонка: DB5 Упорскування: прямо у колонку Температура інжектора: 40°С Програма: 1 хвилина при 90°С, потім 25°С/хвилину до 140°С, 5°С/хвилину до 220°С, нарешті 10°С/хвилину до 300°С і витримування при 300°С протягом 5 хвилин Газ-носій: гелій Мас-спектрометрія Напруга іонізації: 70еВ Спосіб одержання даних: сканування Діапазон мас: 50-620 дальтон Розрізнення мас-спектра: одиниця Мас-спектрометрія уповільненої екстракції матриця-допоміжної лазерної десорбційної іонізації (DE-MALDI-MC) і мас-спектрометрія при бомбардуванні швидкими атомами (FAB-MC) MALDI-TOF мас-спектрометрію здійснювали з використанням лазерно-десорбційного масспектрометра Voyager STR Biospectrometry Research, зв'язаного з уповільненою екстракцією (DE). Висушені перметильовані глікани розчиняли у суміші метанол:вода (80:20) і аналізували з використанням матриці 2,5-дигідроксибензойної кислоти. Як зовнішні калібранти використовували брадикінін, ангіотензин і АСТН. Mac-спектрометричний аналіз позитивних іонів при бомбардуванні швидкими атомами проводили на мас-спектрометрі M-Scan's VG AutoSpecE, що функціонує при Vacc=8кВ для 4500 масового діапазону при повній чутливості з розрізненням приблизно 2500. Для генерації спектра використовували цезієву іонну гармату, що працює при 30кВ. Спектри реєстрували на системі даних VAX3100 М76 з використанням програмного забезпечення Opus. Висушені перметильовані глікани розчиняли у метанолі і завантажували на мішень, заздалегідь 47 89944 намазану 2-4мкл тіогліцерину як матрицю перед введенням у джерело. Результати і обговорення TMS аналіз цукрів глюкоцереброзидази Скринінг N-зв'язаних олігосахаридів Цілісний глікопротеїн піддавали діалізу з подальшим розщепленням трипсином і ліофілізовані продукти розщеплювали з використанням PNGase A, a потім очищали з використанням C18 Sep-Pak. Фракцію 5% водної оцтової кислоти (що містить Nзв'язані олігосахариди) піддавали вичерпному метилюванню і одержували FAB мас-спектри з використанням частини дериватизованого олігосахариду у діапазоні низьких мас для одержання фрагментованих іонів і DE-MALDI-TOF масспектри одержували з використанням частини дериватизованих олігосахаридів у діапазоні високих мас для одержання молекулярних іонів. Аналіз N-гліканів глюкоцереброзидази У таблиці 1 перераховані домінуючі фрагменти іонів, що присутні у FAB спектрі, і молекулярні іони, що присутні у MALDI спектрі. Область молекулярного іона (показана у додатку III) містить домінуючий сигнал при m/z 1505,8 (відповідає + [M+Na] квазімолекулярному іону для структури, що має склад Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc2). Також 48 виявляли діапазон квазімолекулярних іонів меншої інтенсивності, що відповідає комплексу і високоманозним структурам. Виявлені високоманозні структури коливаються у розмірі від Hex5HexNAc2 при m/z 1579,8 до Hex8HexNAc2 при m/z 2193,0. Сигнальні комплекси утворюються від менш сильно оброблених N-гліканів, як наприклад m/z 1331,7 + (відповідає [M+Na] квазімолекулярному іону для структури, що має склад Pent.Hex3.HexNAc2) або від великих N-гліканів, наприклад, що мають m/z + 1751,0 (відповідає [M+Na] квазімолекулярному іону для структури, що має склад Pent.deoxyHexHex3.HexNAc3), m/z 2375,4 (відпові+ дає [M+Na] квазімолекулярному іону для структури, що має склад Pent.deoxyHex2Hex4.HexNAc4) і + m/z 2753,6 (відповідає [M+Na] квазімолекулярному іону для структури, що має склад Pent.deoxyHex3Hex5.HexNAc4). FAB мас-спектр забезпечує інформацію, що стосується антена-подібної структури, шляхом візуалізації фрагментарних іонів в області низьких мас спектра (дані не показані). Сигнали виявляли, ідентифікуючи гексозу (при m/z 219) і HexNAc (при m/z 260) як кінцеві моносахариди, що не відновлюються, в N-гліканах. Таблиця 2 Маси, що спостерігаються у спектрі перметильованої глюкоцереброзидази (посилальний номер 62996) після розщеплення трипсином і пептид-N-глікозидазою А Сигнали, що спостерігаються (m/z) Низька маса 219 228 260 Висока маса 1032,4 1171,5 1299,6 1331,6 1345,6 1505,7 1579,8 1709,9 1750,9 1783,9 1989,0 1997,0 2027,0 2099,0 2130,0 2193,1 2375,2 2753,4 Можливе віднесення + Нех + HexNAc (-метанол) + HexNAc + Pent.Нех3.HexNAc + Hex3.HexNAc2OMe+Na елімінування фукози з m/z 1505,8 + Pent.Hex3.HexNAc2OMe+Na + deoxyHex.Hex3.HexNAc2OMe+Na + Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc2OMe+Na + Hex5.HexNAc2OMe+Na + Pent.deoxyHex.Hex4.HexNAc2OMe+ Na + Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc3OMe+Na + Hex6.HexNAc2OMe+Na + Hex7.HexNAc2OMe+Na + Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc4OMe+Na не віднесено не віднесено + Pent.deoxyHex2.Hex4.HexNAc3OMe+Na + Hex8.HexNAc2OMe+Na + Pent.deoxyHex2.Hex4.HexNAc4OMe+Na + Pent.deoxyHex3.Hex5.HexNAc4OMe+Na Всі маси у першій колонці є моноізотопними, якщо не вказано іншого. Масові числа можуть не відноситися безпосередньо до необроблених даних, оскільки програмне забезпечення часто від13 носить масові числа до піків С ізотопу, особливо для мас, що перевищують 1700Да. Аналіз зв'язування N-гліканів глікоцереброзидази Аналіз зв'язування проводили на N-зв'язаних вуглеводах, що вивільняються після розщеплення PNGase А, очищенням на Sep-Pak і вичерпного метилювання. 49 89944 Комплексна хроматограма була одержана разом з декількома піками домішок, що виникають при дериватизації реагентів. Порівняння часу 50 утримування і спектру зі стандартними сумішами дозволило провести умовне віднесення піків, що містять цукор, перерахованих у таблиці 3. Таблиця 3 Часи утримування різним чином зшитих моносахаридів, що визначаються у вигляді з частково метильованих альдитолацетатів у ГХ-мас-спектрометричному аналізі глюкоцереброзидази (посилальний номер 62996) після розщеплення трипсином і пептид N-глікозидазою А Сполуки, за якими спостерігають Кінцева Ксилоза Кінцева Фукоза Кінцева Маноза Кінцева Галактоза 2-зшита Маноза 4-зшита Глюкоза 2,6-зшита Маноза 3,6-зшита Маноза 2,3,6-зшита Маноза 4-зшитий GlcNAc 3,4-зшитий GlcNAc Час утримування (хвилини) глюкоцереброзидази (62996) 10,41 10,84 12,29 (основний) 12,55 13,40 13,58 14,91 15,08 15,87 16,73 17,59 4.3. Скринінг О-зв'язаних олігосахаридів Проводили відновне елімінування на фракції 60%-ного 2-пропанолу (потенційна фракція Озв'язаного глікопротеїну), одержаній при очищенні на Sep-Pak глюкоцереброзидази після розщеплення трипсином і PNGaзoю А. Зразок висолювали після закінчення реакції і після видалення борату проводили вичерпне метилювання (перметилювання). Одержували FAB-мас-спектри, використовуючи порцію похідного олігосахариду, у діапазоні низьких мас з метою одержання іонів фрагментації, і DE-MALDI-TOF мас-спектр одержували, використовуючи порцію похідного олігосахариду, у діапазоні високих мас з метою одержання молекулярних іонів. Сигнали, що узгоджуються з наятшістю О-зв'язаних гліканів, не спостерігалися (дані не представлені). Аналіз зв'язування О-гліканів глюкоцереброзидази Аналіз зв'язування проводили для продуктів відновного елімінування після вичерпного метилювання. Сигналів, що відповідають присутності типових О-зв'язаних гліканів, не спостерігалося (дані не показані). На Фіг.6 показані деякі ілюстративні структури гліканів для порівняння GCD, що одержана з клітин СНО (яєчник китайського хом'ячка), які є клітинами ссавців (Церезим ), і GCD за даним винаходом з клітин моркви. Як показано, для Церезиму необхідна модифікація даних структур для одержання незахищених залишків манози. Наприклад, такі незахищені залишки манози безпосередньо одержують у випадку GCD, одержаної з клітин рослин відповідно до даного винаходу, де не потрібні подальші маніпуляції, наприклад, з використанням глікозилаз. На Фіг.7 представлена основна структура глікану встановлена для rGCD. На Фіг.7 показані передбачувані структури: а) домінантної популяції олігосахаридів, виявленої на hGCD, що експресується у суспензії клітин моркви (1505,7 m/z); b) типове N-зв'язане ядро; с) фукозильоване рослинне N-зв'язане ядро. N-зв'язані глікани зшиті з білком за допомогою аспарагіну і через відновний кінець залишку GlcNac (GN) з правого боку діаграми. N-рослинні схеми глікозилювання, фукозні залишки можуть бути частиною структури ядра, зв'язаною з першим GlcNac з використанням альфа(13) глікозидного зв'язку, тоді як у структурах, що відносяться до ссавців, звичайно використовується альфа(1-6) глікозидний зв'язок. На Фіг.8A-8D показані всі можливі структури для N-гліканів, що виявляються на rGCD білці відповідно до даного винаходу. Домінантна структура глікану, яка була ідентифікована, являє собою ядерну гліканову структуру, виявлену у більшості рослинних глікопротеїнів з рису, маїсу та інших їстівних рослин. Дана структура містить ядерний залишок ксилози, а також ядерну альфа-(1,3)фукозу. Дослідження, проведене Bardor та ін. (33) показує, що 50% неалергічних донорів крові мають специфічні антитіла до ядерної ксилози у сироватці крові, і 25% мають специфічні антитіла до ядерної альфа-(1,3)-фукози. Однак все ще потрібне дослідження, чи можуть такі антитіла вводити обмеження на застосування одержаних з рослин біофармацевтичних глікопротеїнів. Мінорна популяція гліканів hGCD, що продукується, як описано вище, являла собою високоманозні структури від Hex4HexNAc2 до Hex8HexNAc2. Серед комплексних структур виявлялися структури, такі як Pent.deoxyHex2Hex4.HexNAc3 і Pent.deoxyHex3Hex5.HexNAc3. Структура Pent.deoxyHex3HexNAc2 виявлялася у менших частках. Основними кінцевими моносахаридами є гексоза (маноза або галактоза) і N-ацетилгексозамін, що відповідає присутності високоманозних структур і частково перероблених комплексних структур. Що стосується скринінгу О-зв'язаних олігосахаридів, сигналів, які відповідали б типовим О 51 зв'язаним гліканам, не спостерігалося. Відомо, що GCD не містить О-зв'язаних олігосахаридів, так що дані результати відповідають відомому глікозилюванню GCD в інших клітинних системах, включаючи природну GCD і рекомбінантну GCD, що продукується у культуральних системах, які відносяться до ссавців. Однак, у композиції моносахаридів виявлялися сигнали, що відповідають арабінозі. Важливим моментом, що стосується даного винаходу, є те, що аналіз композиції N-гліканів білка hGCD показав, що більшість N-гліканів має на кінці манозні залишки. Це узгоджується з вимогами для кінцевих манозних груп в N-гліканах, що сприяють поглинанню терапевтичної hGCD рецептором манози макрофагів. Однак, ні природна GCD, ні рекомбінантна GCD, що продукується клітинами ссавців не є високоманозними. Отже, даний винахід долає помітний недолік hGCD білків, що комерційно виробляються, який полягає у тому, що дані білки модифікують для того, щоб вони містили і кінцеві манозні цукри, на відміну від білка, що продукується, як описано вище. Приклад 6 Лікування з використанням даного винаходу Рекомбінантний білок, що продукується відповідно до даного винаходу, переважно включає відповідним чином глікозильованчй білок, що продукується культурою рослинних клітин, який переважно являє собою, наприклад, лізосомальний фермент і/або високоманозний глікозильований білок. Відповідно до переважних варіантів здійснення, білок, що продукується відповідно до даного винаходу, є придатним для лікування лізосомнозв'язаних захворювань, таких, наприклад, як лізосомальні хвороби накопичення. Спосіб лікування необов'язково і переважно включає: (а) одержання рекомбінантної біологічно активної форми лізосомального ферменту, одержаного очищенням з трансформованих клітин коренів рослин і здатного ефективно надходити у клітини з аномальним дефіцитом лізосомального ферменту. Даний рекомбінантний біологічно активний фермент має незахищені кінцеві залишки манози на прикріплених олігосахаридах; і (b) введення пацієнту терапевтично ефективної кількості рекомбінантного біологічно активного лізосомального ферменту або композиції, що включає його. У переважному варіанті здійснення рекомбінантний високоманозний лізосомальний ферме лт, що використовується у способі за винаходом, може продукуватися клітинами-хазяїнами за винаходом. Переважно, дана клітина-хазяїн являє собою клітину моркви. Термін «суб'єкт-ссавець» або «пацієнтссавець» означає будь-якого ссавця, для якого бажана генна терапія, включаючи суб'єктів, які являють собою людей, корів, коней, суб'єктів сімейства псових і сімейства котячих, найбільш переважно, людей. Потрібно розуміти, що термін «лікування» також включає поліпшення або полегшення патологічного стану і/або одного або декількох його симптомів, лікування такого стану або запобігання виникненню такого стану. 89944 52 В іншому переважному варіанті здійснення лізосомальний фермент, що використовується за допомогою способу за винаходом, може являти собою високоманозний фермент, що включає принаймні один олігосахаридний ланцюг, що має незахищений залишок манози. Такий рекомбінантний фермент може зв'язуватися з рецептором манози на клітині-мішені у сайті-мішені в організмі пацієнта. Більш переважно, даний рекомбінантний лізосомальний фермент володіє підвищеною афінністю до даних клітин-мішеней у порівнянні з відповідною афінністю до клітин-мішеней природного лізосомального ферменту. Отже, кожна доза залежить від ефективного визначення клітин з аномальним дефіцитом GCD, і кожна доза такої форми GCD по суті менша, ніж доза природного GCD, який був би в інших обставинах введений аналогічним чином для досягнення терапевтичного ефекту. Відповідно до переважних варіантів здійснення даного винаходу, білок є придатним для лікування лізосомальних хвороб накопичення, так що даний винахід також включає спосіб лікування таких захворювань. Лізосомальні хвороби накопичення являють собою групу з більш ніж 40 захворювань, які виникають внаслідок дефекту генів, що кодують ферменти, які руйнують гліколіпідні або полісахаридні побічні продукти у лізосомах клітин. Ферментативні продукти, наприклад, цукри і ліпіди, потім перетворюються у нові продукти. Кожне з цих порушень є результатом спадкової аутосомної або Х-зв'язаної рецесивної межі, яка впливає на рівні ферментів у лізосомі. Звичайно, порушені ферменти у клітинах і тканинах уражених індивідуумів не виявляють біологічної або функціональної активності. При таких захворюваннях дефіцит ферментативної функції створює прогресуюче системне відкладення жиру або вуглеводного субстрату у лізосомах клітин тіла, зрештою викликаючи втрату функції органу і смерть. Генетична етіологія, клінічні вияви, молекулярна біологія і можливість лізосомних хвороб накопичення детально описані Scriver та ін. [Scriver et al., eds., The Metablic and th Molecular Basis of Inherited Disease, 7 Ed., Vol. II, McGraw Hill, (1995)]. Приклади лізосомальних хвороб накопичення (і зв'язаних з ними дефіцитних ферментів) включають, але не обмежуються вказаним, хворобу Фабрі ( -галактозидаза), хворобу Фарбера (керамідаза), хворобу Гоше (глюкоцереброзидаза), Gm1 гангліозидоз ( -галактозидаза), хворобу Тея-Сакса ( -гексозамінідаза), хворобу Німана-Піка (сфінгомієліназа), хворобу Шиндлера ( -Νацетилгалактозамінідаза), синдром Гунтера (ідуронат-2-сульфатаза), синдром Слая ( глюкуронідаза), синдроми Гурлера і Гурлера/Шейє (ідуронідаза) і синдром I-клітина/Сан-Філіпо (транспортер маноза-6-фосфатази). Хвороба Гоше є найбільш поширеною лізосомальною хворобою накопичення у людей, при цьому з найбільшою частотою вона зустрічається у популяції євреїв ашкенази. Приблизно від 5000 до 10000 людей у Сполучених штатах Америки уражені даним захворюванням [Grabowski, Adv. Hum.Genet. 21:377-441 (1993)]. Хвороба Гоше є 53 результатом дефіциту глюкоцереброзидази (hGCD; глюкозилкерамідаза). Цей дефіцит приводить до накопичення субстрату ферменту, глюкоцереброзиду, у ретикулоендотеліальних клітинах кісткового мозку, селезінки і печінки, приводячи до значних скелетних ускладнень, таких як розширення кісткового мозку і ушкодження кісток, а також до спленомегалії, гепатомегалії, тромбоцитопенії, анемії та ускладнень легень [Grabowski, (1993) ibid.; Lee, Prog. Clin.Biol.Res. 95:177-217 (1982)]. Більш конкретно, лізосомальний фермент, що використовується у способі за винаходом, може бути вибраний з групи, яка складається з глюкоцереброзидази (GCD), кислотної сфінгомієлІнази, гексозамінідази, -Ν-ацетилгалактозамінідизи, кислотної ліпази, -галактозидази, глюкоцереброзидази, -L-ідуронідази, ідуронатсульфатази, манозидази або зіалідази. Переважно, коли захворювання, що піддається лікуванню, являє собою хворобу Гоше, лізосомальний фермент, що використовується у способі за винаходом, являє собою глюкоцереброзидазу (GCD). Білок за даним винаходом можна використовувати для одержання фармацевтичної композиції. Таким чином, відповідно до іншого аспекту даного винаходу, розроблена фармацевтична композиція, яка включає як активний інгредієнт білок і фармацевтично прийнятний носій. Як використано у даному описі, термін «фармацевтична композиція» відноситься до препарату одного або декількох описаних тут активних інгредієнтів, таких як рекомбінантний білок, разом з іншими хімічними компонентами, такими як традиційні лікарські засоби, фізіологічно придатні носії і ексципієнти. Метою фармацевтичної композиції є полегшення введення білка або клітини в організм. Фармацевтичні композиції за даним винаходом можуть бути виготовлені способами, добре відомими у даній галузі, наприклад, за допомогою звичайних способів змішування, розчинення, гранулювання, виготовлення драже, розтирання у порошок, емульгування, інкапсулювання, захоплення або ліофілізації. У переважному варіанті здійснення термін «фармацевтично прийнятний» означає схвалений органами державного регулювання Федерального уряду або уряду держави, або перерахований у Фармакопеї США або інших загальноприйнятих фармакопеях для застосування для тварин, і, більш конкретно, для людини. Далі фрази «фізіологічно прийнятний носій» і «фармацевтично прийнятний носій» використовуються взаємозамінно і відносяться до схваленого носія або розріджувача, який не викликає помітного подразнення організму і не анулює біологічну активність і властивості кон'югату, що вводиться. Термін «носій» відноситься до розріджувача, ад'юванта (допоміжного агента, що посилює дію лікарського засобу), ексципієнта або переносника, разом з яким вводиться лікарський засіб. Такі фармацевтичні носії можуть являти собою стерильні рідини, такі як вода і масла, включаючи масла нафтового, тваринного, рослинного або синтетичного походження, такі як арахісова олія, соєва олія, 89944 54 мінеральне масло, кунжутна олія і тому подібні. Вода являє собою переважний носій, коли фармацевтичну композицію вводять внутрішньовенно. Фізіологічні розчини і водні розчини декстрози і гліцерину також можна використовувати як рідкі носії, особливо для розчинів, що ін'єктують. Придатні фармацевтичні ексципієнти включають крохмаль, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, борошно, крейду, силікагель, стеарат натрію, гліцеринмоностеарат, тальк, хлорид натрію, висушене зняте молоко, гліцерин, пропілен, гліколь, воду, етанол і тому подібні. Композиція, за бажанням, також може містити незначні кількості змочувальних або емульгувальних агентів або рНбуферних агентів. Дані композиції можуть мати вигляд розчинів, суспензій, емульсій, таблеток, пілюль, капсул, порошків, препаратів уповільненого вивільнення і тому подібного. Композиція може бути виготовлена у вигляді супозиторію з традиційними зв'язувальними речовинами і носіями, такими як тригліцериди. Пероральні препарати можуть включати стандартні носії, такі як ті, що мають фармацевтичну якість маніт, лактоза, крохмаль, стеарат магнію, сахаринат натрію, целюлоза, карбонат магнію і т.д. Приклади придатних фармацевтичних носіїв описані у довіднику E.W.Martin "Remington's Pharmaceutical Science". Такі композиції будуть містити терапевтично ефективну кількість білка, переважно в очищеному вигляді, разом з відповідною кількістю носія таким чином, щоб забезпечити форму для належного введення пацієнту. Препарат повинен бути придатним для способу введення. У даному описі термін «ексципієнт» відноситься до інертної речовини, що додається до фармацевтичної композиції для додаткового полегшення процесів і введення активних інгредієнтів. Приклади ексципієнтів, без обмеження, включають карбонат кальцію, фосфат кальцію, різні цукри і типи крохмалю, похідні целюлози, желатин, рослинні олії і поліетиленгліколі. Додаткові способи одержання рецептур лікарських препаратів і введення активних інгредієнтів можна знайти у книзі "Remington's Pharmaceutical Science", Mark Publishing Co., Easton PA, останнє видання, яке включене у даний опис у всій повноті шляхом посилання. Описані тут фармацевтичні композиції також можуть включати придатні тверді або гелеподібні носії або ексципієнти. Приклади таких носіїв або ексципієнтів включають, але не обмежуються вказаним, карбонат кальцію, фосфат кальцію, різні цукри, крохмалі, похідні целюлози, желатин і полімери, такі як поліетиленгліколі. Придатні шляхи введення можуть, наприклад, включати пероральний, ректальний, черезслизовий, черезшкірний, кишковий або парентеральний шляхи доставки, включаючи внутрішньом'язові, підшкірні та інтрамедулярні ін'єкції, а також підоболонкові, прямі внутрішньошлункові, внутрішньовенні, внутрішньочеревинні, внутрішньоназальні або внутрішньоочні ін'єкції. Таким чином, фармацевтичні композиції для застосування відповідно до даного винаходу можуть бути одержані звичайним чином з викорис 55 танням одного або декількох фармацевтично прийнятних носіїв, включаючи ексципієнти і допоміжні домішки, які полегшують переробку активних інгредієнтів у препарати, які можуть фармацевтично використовуватися. Належний препарат залежить від вибраного шляху введення. Для ін'єкції активні інгредієнти за винаходом можуть бути виготовлені у вигляді лікарських препаратів у водних розчинах, переважно у фізіологічно сумісних буферних розчинах, таких як розчин Хенка, розчин Рінгера або фізіологічний буферний розчин. Для введення через слизову оболонку у препаратах використовуються агенти, що сприяють проникності. Такі агенти, що сприяють проникності, звичайно відомі у даній галузі. Для перорального введення активні інгредієнти необов'язково можуть бути виготовлені у вигляді лікарських препаратів для введення цілісних клітин, що продукують білок за даним винаходом, такий, наприклад, як GCD. Активний інгредієнт також може бути введений до складу лікарських препаратів шляхом об'єднання активних інгредієнтів і/або клітин з фармацевтично прийнятними носіями, добре відомими у даній галузі. Такі носії дають можливість введення активних інгредієнтів за винаходом до складу таблегок, пілюль, драже, капсул, рідин, гелів, сиропів, гідросумішей, суспензій і тому подібного для перорального всмоктування у пацієнта. Фармакологічні препарати для перорального використання можуть бути одержані з використанням твердого ексципієнта, необов'язково шляхом подрібнення одержаної суміші і переробки суміші у гранули, після додавання, за бажанням, придатних допоміжних домішок, для одержання ядра таблеток або драже. Придатними ексципієнтами, зокрема, є наповнювачі, такі як цукри, включаючи лактозу, сахарозу, маніт або сорбіт; препарати целюлози, такі як, наприклад, кукурудзяний крохмаль, пшеничний крохмаль, рисовий крохмаль, картопляний крохмаль, желатин, трагакантова камедь, метилцелюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза, карбоксим етилцелюлоз а натрію; і/або фізіологічно прийнятні полімери, такі як полівінілпіролідон (ПВП). За бажанням можуть бути додані дезінтегруючі агенти, такі як зшитий полівінілпіролідон, агар або альгінова кислота або її солі, такі як альгінат натрію. Ядро драже забезпечують відповідними покритими. З цією метою можна використовувати концентровані розчини цукру, які необов'язково можуть містити аравійську камедь, тальк, полівінілпіролідон, карбополовий гель, поліетиленгліколь, діоксид титану, розчини глазурі і придатні органічні розчинники або суміші розчинників. У покриття таблеток або драже можуть бути додані барвники або пігменти для ідентифікації або характеризування різних комбінацій доз активних інгредієнтів. Фармацевтичні композиції, які можна використовувати перорально, включають капсули з щільною посадкою, виготовлені з желатину, а також м'які герметично закриті капсули, виготовлені з желатину і пластифікатора, такого як гліцерин або сорбіт. Капсули з щільною посадкою можуть містити активні інгредієнти у суміші з наповнювачем, таким як лактоза, зв'язувальними речовинами, 89944 56 такими як крохмалі, лубрикантами, такими як тальк або стеарат магнію і, необов'язково, стабілізаторами. У м'яких капсулах активні інгредієнти можуть бути розчинені або суспендовані у придатних рідинах, таких як жирні масла, рідкий парафін або рідкі поліетиленгліколі. Крім того, можуть бути додані стабілізатори. Всі препарати для перорального введення повинні бути у дозуваннях, придатних для вибраного шляху введення. Для букального введення композиція може мати вигляд таблеток або пастилок, одержаних звичайним чином. При введенні шляхом інгаляції активні інгредієнти для застосування відповідно до даного винаходу звичайно доставляють за допомогою аерозольного спрею з упаковки під тиском або небулайзера з використанням відповідного пропеленту, наприклад, дихлордифторметану, трихлорфторметану, дихлортетрафторметану або діоксиду вуглецю. У випадку аерозолю під тиском одиниця дозування може визначатися за рахунок забезпечення клапана для доставки відміряної кількості. Можуть бути одержані капсули і картриджі, наприклад, з желатину, що містять порошкоподібну суміш активного інгредієнта і придатної порошкоподібної основи, такої як лактоза або крохмаль, для застосування в інгаляторі або апараті для вдування. Описані тут активні інгредієнти можуть бути використані для одержання препаратів для парентерального введення, наприклад за допомогою болюсної ін'єкції або безперервного вливання. Препарати для ін'єкції можуть бути представлені у вигляді одиничної препаративної лікарської форми, наприклад, в ампулах або у багатодозових контейнерах, необов'язково з додаванням консерванту. Композиції можуть являти собою суспензії, розчини або емульсії у маслянистих або водних носіях і можуть містити агенти для одержання лікарських препаратів, такі як суспендуючі, стабілізуючі і/або диспергуючі агенти. Фармацевтичні композиції для парентерального введення включають водні розчини активного препарату у водорозчинній формі. Крім того, можуть бути одержані суспензії активних інгредієнтів у вигляді відповідних масляних суспензій для ін'єкцій. Відповідні ліпофільні розчинники або переносники включають жирні масла, такі як кунжутна олія, або синтетичні ефіри жирних кислот, такі як етилолеат, тригліцериди або ліпосоми. Водні ін'єкційні суспензії можуть містити речовини, які збільшують в'язкість суспензії, такі як карбоксиметилцелюлоза натрію, сорбіт або декстран. Необов'язково, суспензія також може містити відповідні стабілізатори або агенти, які збільшують розчинність активних інгредієнтів, щоб мати можливість одержання розчинів з високою концентрацією. У переважному варіанті здійснення композицію одержують відповідно до звичайних способів у вигляді фармацевтичної композиції, адаптованої для внутрішньовенного введення людям. Звичайно, фармацевтичні композиції для внутрішньовенного введення являють собою розчини у стерильному ізотонічному водному буфері. Звичайно 57 інгредієнти забезпечують або окремо або змішують їх разом в одиничній препаративній лікарській формі, наприклад, у вигляді сухого ліофілізованого порошку або концентрату, що не містить води, у герметично закупореному контейнері, такому як ампула або саше з вказівкою кількості активного агента. Коли композиція призначена для введення шляхом вливання, її можна відпускати разом з пляшкою для інфузії, що містить воду або фізіологічний розчин фармацевтичної якості. Коли композиції вводять шляхом ін'єкції, може забезпечуватися ампула зі стерильною водою для ін'єкції або з фізіологічним розчином так, щоб інгредієнти могли бути змішані перед введенням. Фармацевтичні композиції за винаходом можуть бути одержані у нейтральному вигляді або у вигляді солі. Фармацевтично прийнятні солі включають ті, які утворені аніонами, такими як одержані з хлористоводневої, фосфорної, оцтової, щавлевої, винної кислот і т.д., і ті, які утворені катіонами, такими як одержані з гідроксидів натрію, калію, амонію, кальцію, заліза, ізопропіламіну, триетиламіну, 2-етиламіноетанолу, гістидину, прокату, і т.д. Активні інгредієнти за даним винаходом також можуть бути введені до складу ректальних композицій, таких як супозиторії або утримувальні клізми з використанням, наприклад, звичайних основ для супозиторіїв, таких як олія какао або інші гліцериди. Описані тут фармацевтичні композиції також можуть включати придатні тверді або гелеподібні носії або ексципієнти. Приклади таких носіїв або ексципієнтів включають, але не обмежуються вказаним, карбонат кальцію, фосфат кальцію, різні цукри, крохмалі, похідні целюлози, желатин і полімери, такі як поліетиленгліколі. Введення необов'язково проводять зовнішнім (місцевим) шляхом, що супроводжується використанням носія для зовнішньогозастосування. Носій для зовнішнього застосування являє собою такий носій, який, загалом, є придатним для місцевого введення активного інгредієнта і включає будь-які подібні матеріали, відомі у даній галузі. Носій для місцевого застосування вибирають таким чином, щоб забезпечити бажану форму композиції, наприклад, як рідкий або не рідкий носій, лосьйон, крем, паста, гель, порошок, мазь, розчинник, рідкий розріджувач, краплі і тому подібне, і він може включати матеріали або природного, або синтетичного походження. Зрозуміло, що істотним є, щоб вибраний носій не надавав несприятливої дії на активний інгредієнт або інші компоненти місцевого препарату і був стабільним відносно всіх компонентів місцевого препарату. Приклади придатних носіїв для місцевого застосування включають воду, спирти та інші нетоксичні органічні розчинники, гліцерин, мінеральне масло, силікон, вазелін, ланолін, жирні кислоти, рослинні олії, парабени, воски і тому подібне. Переважні препарати у даному описі являють собою безбарвні, такі, що не мають запаху, мазі, рідини, лосьйони, креми і гелі. Мазі являють собою напівтверді препарати, які звичайно базуються на вазеліні або інших похідних вазеліну. Конкретна використовувана основа мазі, як це буде очевидно фахівцям у даній галузі, 89944 58 буде являти собою ту, яка буде забезпечувати оптимальну доставку активних інгредієнтів і, переважно, буде забезпечувати інші бажані характеристики, наприклад, пом'якшувальні властивості або тому подібні. Як і у випадку інших носіїв або переносників, основа мазі повинна бути інертною, стабільною, не подразнюючою і не чутливою. Як пояснюється у довіднику Remington: The Science and th Practice of Pharmacy, 19 Ed. (Easton, Pa.: Mark Publishing Co., 1995) на сторінках 1399-1404, основи мазей можуть бути згруповані у чотири класи: маслянисті основи; основи, що емульгуються; емульсійні основи; і водорозчинні основи. Маслянисті основи мазей включають, наприклад, рослинні олії, жири, одержані з тварин, і напівтверді вуглеводні, одержані з нафти. Основи мазей, що емульгуються, також відомі як абсорбуючі основи мазей, містять незначну кількість води або не містять води і включають, наприклад, гідростеаринсульфат, безводний ланолін і гідрофільний вазелін. Емульсійні основи мазей являють собою або емульсії вода-у-маслі (В/М), або емульсії масло-уводі (М/В), і включають, наприклад, цетиловий спирт, гліцерилмоностеарат, ланолін і стеаринову кислоту. Переважні водорозчинні основи мазей одержують з поліетиленгліколів з різною молекулярною масою; знову ж для одержання додаткової інформації можна послатися на Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Лосьйони являють собою препарати для нанесення на поверхню шкіри без тертя, і звичайно вони являють собою рідкі або напіврідкі препарати, в яких тверді частинки, включаючи активний агент, присутні у воді або у спиртовій основі. Лосьйони звичайно являють собою суспензії твердих речовин і можуть включати рідку маслянисту емульсію типу масло-у-воді. Лосьйони є переважними препаратами у даному винаході для лікування великих площ тіла, внаслідок легкості нанесення великої кількості рідкої композиції. Звичайно необхідно, щоб нерозчинна речовина у розчині була дрібнодисперсною. Лосьйони звичайно будуть містити суспендуючі агенти для одержання кращих дисперсій, а також активні інгредієнти, корисні для локалізації і підтримання контакту активного агента з шкірою, наприклад, метилцелюлозу, карбоксиметилцелюлозу і тому подібне. Креми, що містять вибрані активні інгредієнти, являють собою, як відомо у даній галузі, в'язкі рідкі і напівтверді емульсії, або масло-у-воді, або водау-маслі. Основи крему є такими, що змиваються водою, і містять масляну фазу, емульгатор і водну фазу. Масляна фаза, що також іноді називається «внутрішньою фазою», звичайно включає вазелін і жирний спирт, такий як цетиловий або стеариловий спирт; водна фаза звичайно, хоча і не обов'язково, перевищує масляну фазу за об'ємом і звичайно містить зволожувач. Емульгатор у препараті крему, як пояснено у довіднику Remington, процитованому вище, звичайно являє собою неіонну, аніонну, катіонну або амфотерну поверхневоактивну речовину. Препарати у вигляді гелю є переваленими для нанесення на шкіру голови. Як буде очевидно працюючим у галузі препаратів активних інгредієнтів 59 для зовнішнього застосування, гелі являють собою напівтверді системи типу суспензій. Однофазові гелі містять органічні макромолекули, по суті рівномірно розподілені у рідкому носії, який звичайно є водним, але також переважно містить спирт і, необов'язково, масло. У препарати за винаходом для зовнішнього застосування можуть бути включені різні допоміжні домішки, відомі фахівцям у даній галузі. Наприклад, розчинники можна використовувати для солюбілізації деяких активних речовин-інгредієнтів. Інші необов'язкові домішки включають підсилювачі проникності шкіри, глушники, антиоксиданти, желеутворюючі агенти, загусники, стабілізатори і тому подібні. Композиції для зовнішнього застосування за даним винаходом також можуть доставлятися до шкіри за допомогою звичайних пластирів дермального типу або виробів, в яких композиції активних інгредієнтів містяться всередині ламінованої структури, яка служить пристроєм доставки лікарського засобу, що прикріплюється до шкіри. У такій структурі композиція активних інгредієнтів міститься у шарі або «резервуарі», розташованому під верхнім захисним шаром. Ламінована структура може містити один резервуар, або ж вона може містити множину резервуарів. В одному варіанті здійснення резервуар включає полімерну матрицю з фармацевтично прийнятного контактного прилипаючого матеріалу (адгезиву), який служить для прикріплення системи до шкіри під час доставки активних інгредієнтів. Приклади придатних для шкіри контактних прилипаючих матеріалів включають, але не обмежуються вказаним, поліетилени, полісилоксани, поліізобутилени, поліакрилати, поліуретани і тому подібне. Конкретні полімерні прилипаючі матеріали, що вибираються, будуть залежати від конкретних активних інгредієнтів, носія і т.д., тобто прилипаючий матеріал повинен бути сумісним з усіма компонентами композиції, що містить активні інгредієнти. Альтернативно, резервуар, що містить активні компоненти, і контактуючий зі шкірою прилипаючий матеріал можуть бути присутніми у вигляді окремих і індивідуальних шарів, при цьому прилипаючий матеріал розташований нижче резервуару, який, у такому випадку, може або являти собою полімерну матрицю, як описано вище, або може являти собою рідкий або гідрогелевий резервуар, або може мати якунебудь іншу форму. Захисний шар у таких ламінатах, який служить верхньою поверхнею пристрою, функціонує як первинний структурний елемент ламінованої структури і забезпечу пристрою більшу гнучкість. Матеріал, що вибирається для захисного шару, потрібно вибирати таким чином, щоб він був по суті непроникним для активних інгредієнтів і для будьяких інших компонентів композиції, що містить активні інгредієнти, запобігаючи, таким чином, втраті будь-яких компонентів через верхню поверхню пристрою. Захисний шар може бути або герметичним, або не герметичним, в залежності від того, чи є бажаним, щоб шкіра зволожувалася під час доставки активних інгредієнтів. Захисний шар звичайно виготовляють з листа або плівки переважно 89944 60 гнучкого еластомерного матеріалу. Приклади полімерів, які є придатними для захисного шару, включають поліетилен, поліпропілен і складні поліефіри. Під час зберігання і перед використанням ламінована структура включає прокладку, що знімається. Безпосередньо перед вживанням даний шар видаляють з пристрою, залишаючи відкритою основну структуру, або резервуар з активними інгредієнтами, або окремий контактний адгезивний шар, таким чином, щоб можна було прикріпити систему до шкіри. Така прокладка, що знімається, повинна бути виготовлена з матеріалу, не проникного для активних інгредієнтів/носія. Такі пристрої можуть бути виготовлені з використанням звичайних технологій, відомих у даній галузі, наприклад, шляхом виливання рідкої суміші адгезиву, активних інгредієнтів і носія на захисний шар з подальшим ламінуванням з використанням прокладки, що знімається. Аналогічно, адгезивну суміш можна виливати на прокладку, що знімається, з подальшим ламінуванням з використанням захисного шару. Альтернативно, резервуар для активних інгредієнтів може бути одержаний за відсутності активних інгредієнтів або ексципієнту, а потім навантажений ними шляхом «просочування» сумішшю активних інгредієнтів і носія. Що стосується лікарських форм для зовнішнього (місцевого) застосування за винаходом, композиції активних інгредієнтів, що містяться у резервуарах для активних інгредієнтів даних ламінованих систем, можуть містити ряд компонентів. У деяких випадках активні інгредієнти можуть доставлятися «нерозбавленими», тобто за відсутності додаткової рідини. Однак у більшості випадків активні інгредієнти будуть розчинені, дисперговані або суспендовані у відповідному фармацевтично прийнятному носії, звичайно у розчиннику або гелі. Інші компоненти, які можуть бути присутніми, включають консерванти, стабілізатори, поверхнево-активні речовини і тому подібне. Потрібно зазначити, що білок за винаходом, такий як високоманозний лізосомальний фермент, переважно вводять пацієнту, який потребує цього, в ефективній кількості. Як використано у даному описі, термін «ефективна кількість» означає кількість, необхідну для досягнення вибраного результату. Наприклад, ефективна кількість композиції за винаходом може бути вибрана як така, що використовується при лікуванні лізосомальної хвороби накопичення. Фармацевтичні композиції, придатні для застосування у контексті даного винаходу, включають композиції, в яких активні інгредієнти містяться у кількостях, ефективних для досягнення передбачуваної мети. Більш конкретно, вираз «терапевтично ефективна кількість» означає кількість активного інгредієнта, ефективного для профілактики, полегшення або поліпшення симптомів захворювання або продовження життя пацієнта, який піддається лікуванню. Визначення терапевтично ефективної кількості знаходиться у межах здібностей фахівця у даній галузі, особливо у світлі представленого тут докладного опису.