Спосіб генерування активних антитіл до антигену стійкості, антитіла, одержані цим способом, та їх застосування
Формула / Реферат
1. Спосіб створення in vitro антитіла або одного з його функціональних фрагментів, направленого проти пухлинного антигену, що експресується на поверхні пухлини, стійкої щонайменше до однієї протипухлинної сполуки, який характеризується тим, що включає наступні стадії:
і) безпосередню імунізацію тварин подрібненим гомогенатом і/або суспензією, і/або клітинним лізатом, що походять з вказаної резистентної пухлини,
іі) злиття клітин селезінки тварини, імунізованої на стадії i), з мієломними клітинами із одержанням гібридом, і
iii) відбір за допомогою диференційної селекції гібридом, що секретують антитіла, які специфічно розпізнають антигени, що експресують на поверхні пухлинних клітин резистентної пухлини, і експресія яких індукується в результаті протипухлинного лікування, де вказану резистентну пухлину одержують способом, вибраним з наступних:
а) одержання біопсії і/або хірургії від пацієнта, який проходить або проходив терапевтичне лікування з використанням щонайменше однієї протипухлинної сполуки, що індукує стійкість, і
b) трансплантація пухлинної лінії і/або всієї людської пухлини або її частини тварині і потім за допомогою лікування цієї тварини шляхом ін'єкції протипухлинної сполуки, стійкість до якої нативної пухлини бажано індукувати.
2. Спосіб за п. 1, який характеризується тим, що вказану імунізацію проводять за допомогою внутрішньоочеревинної і/або підшкірної, і/або внутрішньовенної, і/або внутрішньоселезінкової ін'єкції.
3. Спосіб за п. 1, який характеризується тим, що вказане антитіло або один з його функціональних фрагментів, направлене(ий) проти пухлинного антигену, що експресується на поверхні вказаної резистентної пухлини, являє собою моноклональне антитіло.
4. Спосіб за п. 1, який характеризується тим, що вказане антитіло або один з його функціональних фрагментів являє собою імуноглобулін, вибраний з групи IgG, IgA, IgM, IgD або IgE.
5. Спосіб за п. 1, який характеризується тим, що вказане антитіло або один з його функціональних фрагментів є IgG ізотипу гамма 1, гамма 2 або гамма 4.
6. Спосіб за п. 1, який характеризується тим, що вказаний функціональний фрагмент вибраний з фрагментів Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv (одноланцюжкові Fv), scFv-Fc і діател або будь-якого фрагмента, тривалість існування якого була б збільшена, такого як ПЕГильовані фрагменти.
7. Спосіб за п. 1, який характеризується тим, що він додатково включає перед стадією i) наступні стадії:
а) відбір і трансплантацію тваринам пухлинної лінії і/або всієї вихідної пухлини або її частини,
b) лікування частини цих підданих трансплантації тварин щонайменше однією протипухлинною сполукою,
с) витягання цілком або частин вихідних пухлин, що походять з нелікованих тварин, підданих трансплантації на стадії a),
d) витягання цілком або частин резистентних пухлин, що походять з тварин, лікованих на стадії b),
e) підготовку засобу для диференційної селекції антитіл з пухлин, які повністю або частково витягують на стадіях с) та d), відповідно, і
f) підготовку подрібненого гомогенату і/або клітинного лізату з резистентних пухлин, які повністю або частково витягують на стадії d).
8. Спосіб за п. 7, який характеризується тим, що вказана пухлинна лінія і/або вихідна пухлина вибрана з групи, яка складається з пухлинних клітин легені, товстої кишки, передміхурової залози, молочної залози, яєчників або будь-якої пухлини, стійкості яких до лікування встановлені.
9. Спосіб за п. 1, який характеризується тим, що вказана щонайменше одна протипухлинна сполука вибрана з хіміотерапевтичних агентів, агентів променевої терапії, гормонотерапевтичних агентів, хімічних молекул як інгібіторів тирозинкінази або антитіл.
10. Спосіб за п. 1, який характеризується тим, що вказана щонайменше одна протипухлинна сполука, переважно, являє собою моноклональне антитіло.
11. Спосіб за п. 1, який характеризується тим, що вказане антитіло являє собою моноклональне антитіло, і тим, що воно вибране з групи антитіл або їх функціональних фрагментів, направлених проти рецепторів ростових факторів, молекул, залучених в ангіогенез, або навіть хемокінів та інтегринів, залучених в явища клітинній міграції.
12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-11, який характеризується тим, що вказана щонайменше одна протипухлинна сполука є комбінацією щонайменше двох, переважно щонайменше трьох, протипухлинних сполук різної природи, і/або які мають різні механізми дії, і/або направлені на різні білки.
13. Спосіб за п. 12, який характеризується тим, що вказана комбінація протипухлинних сполук являє собою комбінацію моноклональних антитіл або їх функціональних фрагментів.
14. Спосіб за п. 12, який характеризується тим, що вказана комбінація моноклональних антитіл або їх функціональних фрагментів являє собою комбінацію антитіл, вибраних з антитіл проти IGF-1R (рецептора інсуліноподібного фактора росту 1 типу), проти EGFR (рецептора епідермального фактора росту) проти Her/2neu, проти VEGF (судинного ендотеліального фактора росту), проти VEGFR (рецептора VEGF), проти CXCR (рецепторів хемокінів типу C-X-C), проти cMET, проти RON (recepteur d’origine nantais).
15. Спосіб за п. 14, який характеризується тим, що вказана комбінація являє собою комбінацію антитіла проти IGF-1R, антитіла проти EGFR та антитіл проти Her/2neu.
16. Спосіб за п. 15, який характеризується тим, що вказана комбінація являє собою комбінацію моноклональних антитіл 7C10, 225 та h4D5.
17. Спосіб за п. 16, який характеризується тим, що він включає додаткову стадію толеризації перед стадією i).
18. Спосіб за п. 17, який характеризується тим, що вказана стадія толеризації складається з:
- введення тваринам подрібненого гомогенату і/або суспензії, і/або клітинного лізату, одержаних з так званих "нативних" пухлин, що походять із стадії с), і
- обробки цих тварин імуносупресором з метою видалення B-клітин, активованих в результаті введення, проведеного на попередній стадії, і тим самим інгібування будь-якої можливої відповіді проти вказаної так званої нативної пухлини.
19. Спосіб створення і відбору in vitro антитіла або одного з його функціональних фрагментів, здатного інгібувати стійкість пухлини до протипухлинної сполуки, або спосіб створення і відбору in vitro антитіла або одного з його функціональних фрагментів, направленого проти пухлинного антигену, що експресується на поверхні пухлини, стійкої щонайменше до однієї протипухлинної сполуки, причому вказаний пухлинний антиген залучений в стійкість вказаної пухлини до протипухлинної сполуки, причому спосіб характеризується тим, що він включає:
a) спосіб створення in vitro антитіла або одного з його функціональних фрагментів за будь-яким з пп. 1-16, причому вказане антитіло направлене проти вказаного пухлинного антигену, що специфічно експресується на поверхні резистентної пухлини, вказаний пухлинний антиген не експресується на поверхні клітин нативної пухлини, з якої дана резистентна пухлина походить;
b) приведення одержаного на стадії а) антитіла in vitro або in vivo в контакт з пухлиною, стійкою до протипухлинної сполуки; і
с) відбір вказаного антитіла, якщо продемонстрований інгібуючий ефект цього антитіла на стійкість пухлини до протипухлинної сполуки.
20. Спосіб за будь-яким з пп. 1-19 для застосування для створення терапевтичних і/або діагностичних моноклональних антитіл.
21. Моноклональне антитіло або один з його функціональних фрагментів, одержані шляхом використання способу за будь-яким з пп. 1-20, яке характеризується тим, що вибране з групи антитіл, що складається з:
a) антитіла, яке містить:
- легкий ланцюг, який містить CDR-ділянки (гіперваріабельні ділянки) послідовностей SEQ ID No: 1, 2 та 3; і
- важкий ланцюг, який містить CDR-ділянки послідовностей SEQ ID No: 4, 5 та 6;
b) антитіла, яке містить:
- легкий ланцюг, який містить Cdr-ділянки послідовностей SEQ ID No: 9, 10 та 11; і
- важкий ланцюг, який містить Cdr-ділянки послідовностей SEQ ID No: 12, 13 та 14;
c) антитіла, яке містить:
- легкий ланцюг, який містить Cdr-ділянки послідовностей SEQ ID No: 17, 18 та 19; і
- важкий ланцюг, який містить Cdr-ділянки послідовностей SEQ ID No: 20, 21 та 22;
d) антитіла, яке містить:
- легкий ланцюг, який містить Cdr-ділянки послідовностей SEQID No: 25, 26 та 27; і
- важкий ланцюг, який містить Cdr-ділянки послідовностей SEQ ID No: 28, 29 та 30;
e) антитіла, яке містить:
- легкий ланцюг, який містить Cdr-ділянки послідовностей SEQ ID No: 33, 34 та 35; і
- важкий ланцюг, який містить Cdr-ділянки послідовностей SEQ ID No: 36, 37 та 38.
22. Мишача гібридома, здатна секретувати антитіло за п. 21, вибрана з групи, що складається з мишачих гібридом, депонованих в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) 31 травня 2006 року під № I-3612, № I-3613,
№ I-3615, № I-3614 і № I-3616.
23. Антитіло або один з його функціональних фрагментів за п. 21, яке характеризується тим, що вказане антитіло являє собою химерне антитіло і додатково містить константні ділянки легкого ланцюга і важкого ланцюга, що походять з антитіла гетерологічного мишам виду.
24. Антитіло або один з його функціональних фрагментів за п. 23, яке характеризується тим, що вказане антитіло являє собою химерне антитіло і вказаним гетерологічним видом є людський вид.
25. Виділена нуклеїнова кислота, яка характеризується тим, що вона вибрана з наступних нуклеїнових кислот:
а) нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, що кодує антитіло або один з його функціональних фрагментів за п. 21; та
b) нуклеїнової кислоти, комплементарної нуклеїновій кислоті, визначеній в а).
26. Вектор, який містить нуклеїнову кислоту за п. 25.
27. Клітина-хозяїн, яка містить вектор за п. 26.
28. Спосіб одержання антитіла або одного з його функціональних фрагментів за п. 21, який характеризується тим, що він включає наступні стадії:
a) культивування клітини за п. 27 в середовищі і в придатних умовах культивування; і
b) виділення одержаних таким чином вказаних антитіл або одного з їх функціональних фрагментів з культурального середовища, або з вказаних культивованих клітин.
29. Антитіло або один з його функціональних фрагментів за п. 21 як ліки.
30. Композиція, яка містить як активний інгредієнт сполуку, що являє собою антитіло або один з його функціональних фрагментів, за п. 21.
31. Композиція за п. 30, яка характеризується тим, що вона додатково містить як комбінований продукт для одночасного, роздільного застосування або рознесеного за часом застосування хіміотерапевтичний агент, агент променевої терапії або антитіло.
32. Композиція за п. 30 як ліки.
33. Застосування антитіла за п. 29 і/або композиції за п. 32 для виготовлення ліків, призначених для запобігання або лікування раку.
34. Застосування за п. 33, яке характеризується тим, що вказаний рак являє собою рак стійкого типу, вибраний з раку товстої кишки, передміхурової залози, молочної залози, легені, яєчників або підшлункової залози.
35. Застосування антитіла або одного з його функціональних фрагментів за п. 21 для виготовлення ліків, призначених для специфічно направленої доставки біологічно активної сполуки до резистентних пухлин і/або пухлин, виявлених на пізній стадії.
36. Спосіб ідентифікації нових терапевтичних і/або діагностичних мішеней, або внутрішньоклітинних, або позаклітинних, залучених в явище стійкості, який характеризується тим, що він являє собою застосування способу за будь-яким з пп. 1-19 для одержання моноклонального антитіла і подальшої ідентифікації білка, який розпізнається вказаним моноклональним антитілом.
Текст
Реферат: Винахід належить до застосування подрібненого гомогенату і/або суспензії, і/або клітинного лізату, що походять з пухлини, стійкої щонайменше до однієї протипухлинної сполуки, з метою імунізації і створення in vitro антитіла або одного з його функціональних фрагментів, UA 102812 C2 (12) UA 102812 C2 направленого проти пухлинного антигену, який специфічно експресується на поверхні вказаної резистентної пухлини, а також їх застосування для лікування раку. UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується нового підходу для створення виключно моноклональних антитіл з терапевтичною і/або діагностичною метою. Більш конкретно, задачею даного винаходу є створення антитіл, направлених проти пухлинного антигену, відсутнього на поверхні пухлинних клітин нативних пухлин і який може з'явитися після проведення протипухлинного лікування цих нативних пухлин, антигену, який також можливо може бути залучений в стійкість даних пухлин до цих протипухлинних лікувань. Крім того, даний винахід включає такі антитіла, а також застосування цих антитіл як лікарського засобу для профілактичного і/або терапевтичного лікування резистентних пухлин. І нарешті, винахід включає композиції, які містять такі антитіла, які можуть бути об'єднані з протираковими агентами, і їх застосування для запобігання і/або лікування деяких типів раку. Відкриття антитіл і, більш конкретно, розробка способів створення антитіл виявилася революцією в терапевтичному лікуванні або діагностиці і, більш конкретно, в сфері, що стосується раку. Дійсно, вперше цей новий інструмент дав можливість здійснювати направлене лікування через наявність розпізнавальної здатності, властивої антитілам. Одна з основних задач цих останніх десятиліть полягає в розробці способів створення антитіл, незалежно від того, чи є вони в першій фазі поліклональними антитілами, моноклональними антитілами або навіть фрагментами антитіл або аналогічними структурами. На сьогоднішній день фахівцями в даній галузі техніки розроблені декілька технологій, за допомогою яких можна створювати антитіла з терапевтичною і/або діагностичною метою. Найперші антитіла являють собою поліклональні антитіла, тобто гетерогенні популяції антитіл, які містяться в сироватках імунізованих тварин. Для їх одержання деяких тварин (мишей, щурів, кролів, кіз …) імунізують шляхом ін'єкції заданого природного або синтетичного антигену, у комбінації з одним або більше ад'ювантами, такими як ад'ювант Фрейнда і гідроксид алюмінію, направленими на стимуляцію і посилення імунної відповіді. Потім здійснюють забір крові у тварин і одержують сироватку або антисироватку, яка містить як антитіла, що більш або менш ефективно розпізнають деякі епітопи даного антигену (поліклональні антитіла), так і інші антитіла тварини. Очищення одержаних антитіл виконують, наприклад афінною хроматографією. Перша розробка полягала у створенні моноклональних антитіл, які можуть бути одержані з гібридом згідно з методикою, описаною KOHLER та MIELSTEIN (1975). Ця методика дозволяє одержати специфічні моноклональні антитіла передетермінованого антигену і полягає в об'єднанні клону лімфоцита B з мієломною (myelomatous) клітиною із одержанням клітини, яка називається гібридомою. Ця гібридома характеризується не лише як імморталізована, але також постійно продукуюча моноклональні і, отже, моноспецифічні антитіла. Також описані інші методики, основані на тому самому принципі, як наприклад методика з використанням тріоми або ще одна гібридомна методика, описана KOZBOR тощо. (1983). Ці методики, спочатку застосовані для створення мишачих антитіл, розвивалися, результатом чого стало створення гуманізованих або навіть людських химерних антитіл. Усі ці методики сьогодні добре відомі фахівцеві в даній галузі техніки. Людські антитіла можуть бути одержані з використанням технології генетично модифікованих мишей, так званої "ксеномишачої" технології, яка описана в патентах US 5814318 та US 5939598. Крім того, розроблені інші нові сучасні способи створення людських моноклональних антитіл і, більш конкретно, фрагментів антитіл, як наприклад методики, які використовують банки або бібліотеки фагів, як описано RIDDER і ін. (1995), або так звана технологія "фагового дисплея", основана на екстракції мРНК з директорії (directory) людських клітин, що походять з периферичної крові, побудові банку або бібліотеки кДНК, які містять послідовності варіабельних ділянок, і на вставці кДНК у фаги з метою продукування варіабельних ділянок антитіл у вигляді фрагментів, переважно, Fab-фрагментів. Не дивлячись на те, що ці способи розрізняються, всі вони мають одну і ту саму характерну особливість, тобто імунізацію відомим антигеном або, в рамках об'єму бібліотек або банків, скринінг цих банків з використанням того самого відомого і визначеного антигену. Даний винахід відрізняється від цих способів тим, що відомий і визначений антиген більше не використовується, а використовується безпосередньо вся пухлина або її частина. Більш конкретно, даний винахід стосується безпосереднього застосування лізату, і/або суспензії і/або подрібненого клітинного гомогената пухлини. При лікуванні раку спостерігали протягом декількох років, що деяка кількість пацієнтів, які характеризувалися повною і задовільною відповіддю після першого терапевтичного лікування, мала тенденцію до розвитку рецидиву. У більш конкретному випадку відомо, що пухлини здатні модифікувати свій генотип і/або свій фенотип, щоб бути стійкими до різних видів лікування, що застосовуються до них. 1 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Це явище має місце як для таких типів лікувань, як променева терапія і хіміотерапія, так і для лікувань моноклональними антитілами. Історично, перші хіміотерапевтичні сполуки для лікування раку стали об'єктом клінічних випробувань в 1940-х роках. Це були головним чином агенти з коротким часом напіввиведення, такі як кортикостероїди, антифолати або навіть вінкаалкалоїди. Проте, навіть якщо була досягнута повна ремісія, то вона, як правило, продовжувалася протягом не більше, ніж одного року, і систематично спостерігали рецидив, асоційований із стійкістю до хіміотерапевтичної сполуки, використаної для даного лікування (Lehnert M., Eur. J. Cancer, 1996, 32A: 912-920). У відповідь на це явище було запропоновано проводити так звані "комбіновані" лікування з використанням різних протипухлинних сполук. Шляхом одночасного або послідовного застосування різних сполук дійсно були одержані гарніші результати. Насправді, у випадку застосування різних протипухлинних сполук, кожна з яких має цитотоксичну активність, але різними механізмами дії, пухлинна клітина, стійка до сполуки, може все ще бути чутливою щонайменше до однієї з інших використовуваних сполук. Проте, не дивлячись на використання різних протипухлинних сполук або агентів, стійкість пухлин залишається головною проблемою в рамках хіміотерапевтичних лікувань. Застосування комбінацій тягне за собою затримку виникнення явища стійкості, але не призводить до його зникнення. Стійкість до хіміотерапевтичних засобів, як при початковому лікуванні, так і та, що з'являється після рецидиву слідом за сприятливою початковою відповіддю, є практично у всіх випадках так званих "виліковних" видів раку. Як приклад можна згадати заявки на патент WO 2005/077385, WO 2004/026293 або навіть ще WO 2004/110497, де добре проілюстрований такий пошук нових способів контролю явища стійкості, причому всі ці заявки основані на принципі додаткового введення, як правило, нової хімічної молекули. Продемонстровані інші механізми придбання стійкості в пухлині, спочатку чутливої до лікування. Згідно з найбільш широко визнаним припущенням мається на увазі, що це явище стійкості могло б відбуватися через накопичення спонтанних і випадковим чином виникаючих соматичних мутацій в генотипі пухлинної клітини (Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and practice, Chabner & Lango editors, 1996, chapter 1). Інше відоме та описане явище стійкості, яке називається "MDR" (множинна лікарська стійкість (multidrug resistance); також полірезистентність; також резистентність до багатьох ліків), основане на здатності пухлинної клітини до виживання при летальних концентраціях великої кількості фармакологічно, хімічно або навіть таких, що структурно розрізняються, цитотоксичних сполук. Клітини, що проявляють "MDR", мають здатність до зниження накопичення всередині клітин цитотоксичних сполук в результаті виведення вказаних сполук транспортними білками. Ці білки, які називаються "переносники лікарських засобів, що забезпечують множинну лікарську стійкість" (multi-drug transporters), є мембранними білками, здатними виводити широкий ряд токсичних молекул з клітини. Ці "переносники лікарських засобів, що забезпечують множинну лікарську стійкість" належать "суперсімейству АТФ-зв'язуючих касетних (ABC ATP-binding cassette)” транспортних білків, які використовують енергію гідролізу АТФ для своєї активності. Показано, що за цю "MDR" відповідальні декілька механізмів. Найбільш відомим і найбільш документованим геном, наділеним такою стійкістю, зв'язаною з механізмом виведення (expulsion mechanism), залежним від АТФ, є ген MDR1. Одночасно з цим явищем стійкості, індукованим хіміотерапевтичним лікуванням, також описана індукована стійкість після лікування моноклональними антитілами. Ця стійкість може бути зв'язана з типом хазяїна, з фармакологічними міркуваннями або окрім цього вона може бути властивою самій пухлині. Раніше, при первинному використанні антитіл, які відносяться до мишачих антитіл, в результаті одержували антитільну відповідь проти вказаних мишачих антитіл, так званий HAMA (людська антимашача антитільна (human anti-mouse antibody))-відповідь. Ця форма стійкості, яка має відношення до хазяїна, частково врегульована тим, що мишачі антитіла перестали застосовувати, а почали використовувати людські або гуманізовані антитіла. У різних тестах з використанням таких людських або гуманізованих антитіл продемонстровані нові явища, в результаті яких пухлина може бути стійкою до імунологічних лікувань. В основі цих нових механізмів головним чином лежать мутації, що індукуються в пухлині, конститутивна активація рецепторів з подальшим їх розщеплюванням (або шедінгом) або навіть втратою експресії цільового антигену. Як буде очевидне далі з Прикладу 1, дослідження, що проводяться заявником, показують, наприклад, що при потрійній терапії з використанням антитіл проти IGF-1R (рецептора інсуліноподібного фактора росту 1 типу), EGFR (рецептора епідермального фактора росту) і 2 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Her/2neu можливе досягнення значного зниження пухлинного росту A549-клітин в бестимусних голих мишей до повного зникнення пухлин у 90 % лікованих тварин. Не дивлячись на те, що така множинна терапія суттєво ефективніша, ніж монотерапія або бітерапія, очевидно пухлини, які все-таки повністю регресували, поступово з'являються знову, не дивлячись на продовження лікування: тобто вони стають стійкими до множинного лікування. На підставі цього спостереження заявник вперше пропонує безпосереднє застосування таких резистентних пухлин для створення антитіл, переважно терапевтичних і/або діагностичних моноклональних антитіл, здатних до розпізнавання антигенів, експресія яких буде індукована на поверхні пухлинних клітин цієї пухлини, стійкої до протипухлинного лікування, і які не будуть експресуватися на поверхні пухлинних клітин нативної (нелікованої) пухлини, ці антигени також можуть бути залучені в стійкість пухлини до протипухлинного лікування. Отже, згідно з першим аспектом предметом даного винаходу є застосування подрібненого гомогената, і/або суспензії, і/або клітинного лізату з пухлини, стійкої щонайменше до однієї протипухлинної сполуки, для імунізації і створення in vitro антитіла або одного з його функціональних фрагментів, направленого проти пухлинного антигену, що експресується на поверхні пухлинних клітин вказаної резистентної пухлини, при цьому даний пухлинний антиген, переважно, не експресується на поверхні пухлинних клітин нативної пухлини, з якої походить резистентна пухлина, і цей пухлинний антиген можливо залучений в стійкість вказаної пухлини до протипухлинної сполуки. Під виразом "подрібнений гомогенат" або "клітинний гомогенат" розуміють суміш клітин і/або клітинних фрагментів, що походять з пухлин (ксенотрансплантантів, ортотопічних трансплантатів, сингенних трансплантатів, хірургічних зразків від лікованих пацієнтів, у яких мав місце рецидив пухлини або зразків з клітинних культур), одержану за допомогою механічної дисоціації, наприклад з використанням ультразвукового млина типу "Potter", млина типу Ultraturax® тощо. Під виразом "суспензія" або "клітинна суспензія" розуміють суспензію клітин, одержаних після культивування in vitro з обробкою або без неї і від'єднаних від середовища, що підтримує їх, із застосуванням ферментативних розчинів або неферментативних розчинів для дисоціації. Під виразом "лізат" або "клітинний лізат" розуміють суміш клітин і/або клітинних фрагментів, що походять з пухлин (ксенотрансплантантів, ортотопічних трансплантатів, сингенних трансплантатів, хірургічних зразків від лікованих пацієнтів, у яких мав місце рецидив пухлини або зразків клітинних культур), одержану за допомогою ферментативного розщеплювання (enzymatic dissociation). Під виразом "резистентна пухлина" розуміють пухлину, яка не відповідає або більше не відповідає на лікування(я), що застосовується(ються). Як описано вище, така стійкість може спостерігатися або після лікування із застосуванням хіміотерапії, променевої терапії, гормонотерапії або навіть у результаті конкретного використання антитіл; ці види лікування можуть застосовуватися окремо, або також у вигляді комбінації. У витоків такої здатності до стійкості можуть стояти різні механізми, як відомі, так і не відомі на цей час. І нарешті, така стійкість може виражатися у втраті або зниженні ефекту спочатку застосованого лікування. Безсумнівно, відомі та описані явища "вислизування", являють собою частину явища стійкості, яке прагнуть контролювати з використанням даного винаходу. Під нативною пухлиною (або вихідною пухлиною) в даному описі розуміють позначення пухлини, з якої походить резистентна пухлина, при цьому дана нативна пухлина не піддавалася жодному протипухлинному лікуванню на противагу резистентній пухлині. Пухлинний антиген розуміється в даному описі як такий, що відноситься, зокрема, до антигенів, що експресуються на поверхні пухлинних клітин, незалежно від того, чи походять вони з нативної пухлини або з резистентної пухлини, причому цей пухлинний антиген не експресується на поверхні здорових клітин. У загальному випадку цими пухлинними антигенами є природні макромолекули (які можна синтезувати), з якими антитіло може специфічно зв'язуватися. Пухлинним антигеном може бути, зокрема, поліпептид, полісахарид, вуглевод, нуклеїнова кислота, ліпід, гаптен або будь-яка інша сполука, природно присутня на поверхні пухлинної клітини. І нарешті, вирази "антитіло" або "імуноглобулін" використовуються в даному описі взаємозамінно в їх найширшому значенні і включають моноклональні антитіла (наприклад, цілі або інтактні моноклональні антитіла), поліклональні антитіла, полівалентні антитіла, поліспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла, за умови, що вони демонструють бажану біологічну активність). Химерні або гуманізовані антитіла також підпадають під це позначення. Більш конкретно, така молекула являє собою глікопротєїн, який містить щонайменше два 3 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 важкі ланцюги (H) і два легких ланцюги (L), з'єднані разом дисульфідними містками. Кожен важкий ланцюг складається з варіабельної ділянки (або домену) важкого ланцюга (HCVR або VH) і константної ділянки важкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга складається з трьох доменів CH1, CH2 та CH3. Кожен легкий ланцюг складається з варіабельної ділянки легкого ланцюга (LCVR або VL) і константної ділянки легкого ланцюга. Константна ділянка важкого ланцюга містить LС-домен. VH- та VL-ділянки можуть бути підрозділені на гіперваріабельні ділянки, які називаються CDR (ділянки, що визначають комплементарність; "complementary determining regions"), що чергуються з більш консервативними ділянками, які називаються каркасними ділянками (FR). Кожна VH та VL складається з трьох CDR і чотирьох FR, розташованих від N-кінцевої амінокислоти до С-кінцевої амінокислоти в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Варіабельні ділянки важких і легких ланцюгів містять зв'язуючий домен, який взаємодіє з антигеном. Константні ділянки антитіл можуть опосередкувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) і перший компонент (C1q) системи стандартного комплементу. Вони можуть також включати визначені фрагменти антитіл (експресія буде описана детальніше), що демонструють бажану афінність і специфічність відносно джерела або типу імуноглобуліну (IgG, IgE, IgM, IgA тощо). Як правило, для одержання моноклональних антитіл або їх функціональних фрагментів, особливо мишачого походження, можна зробити посилання на методики, описані, зокрема, в довіднику "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988), або на методики одержання з гібридом, описані Kohler и Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975). Серед антитіл, спроба створення яких вирішується даним винаходом, переважні антитіла, визначені вище, і так звані "активні" антитіла, тобто такі, що мають протипухлинну активність, націлену на пухлинні клітини, стійкі до терапії. Серед антитіл, спроба створення яких вирішується даним винаходом, і в конкретному аспекті винаходу переважні антитіла, які визначені вище, і ті, які здатні також до прояву протипухлинної активності, направленої проти пухлинних клітин з агресивним фенотипом, які природно (до лікування) експресують антиген, проти якого ці антитіла направлені. У першому втіленні застосування за винаходом характеризується тим, що вказану резистентну пухлину одержують безпосередньо шляхом біопсії і/або хірургії від пацієнта, який проходить або проходив терапевтичне лікування з використанням щонайменше вказаної протипухлинної сполуки, здатної індукувати стійкість, або стійкість до якого даної пухлини встановлена. У цьому втіленні адаптоване до кожного пацієнта лікування можна розглядати в тому значенні, що у відповідь на імунізацію, що здійснюється з використанням всієї резистентної пухлини або її частини, що походить з реального пацієнта, виробляються антитіла згідно з винаходом. Таким чином, пацієнту може бути запропонована необхідна терапія ex vivo. У другому втіленні застосування за винаходом характеризується тим, що вказану резистентну пухлину індукують за допомогою трансплантації пухлинної лінії і/або всієї людської пухлини або її частини тварині і потім за допомогою лікування цієї тварини шляхом введення, найчастіше за допомогою ін'єкції щонайменше однієї протипухлинної сполуки, стійкість до якої бажано індукувати або встановити. Більш конкретно, щонайменше одна вказана протипухлинна сполука вибрана з хіміотерапевтичних агентів, таких як хімічні молекули, або навіть з терапевтичних антитіл, або навіть з агентів променевої терапії. У загальному випадку у всьому даному описі терміни "протипухлинний агент" або "протираковий терапевтичний агент" призначені для позначення речовини, яка, коли її вводять пацієнту, лікує рак або запобігає розвитку раку у пацієнта. Як необмежувальний приклад таких агентів можуть бути згадані так звані "цитотоксичні" агенти, такі як "алкілуючі" агенти, антиметаболіти, протипухлинні антибіотики, інгібітори мітозу, інгібітори функціонування хроматину, антиангіогенезні агенти, антиестрогени антиандрогени або імуномодулятори. Подібні агенти згадуються, наприклад у довіднику ВІДАЛЬ 2006 року видання на сторінці, присвяченій сполукам, що відносяться до онкології і гематології, в графі "Цитотоксичні засоби"; ці цитотоксичні сполуки, згадані за допомогою посилання в цьому документі, згадані в даному описі як переважні цитотоксичні агенти. Термін "алкілуючі агенти" стосується будь-якої речовини, яка може утворювати ковалентний зв'язок або алкілувати будь-яку молекулу, переважно, нуклеїнову кислоту (наприклад ДНК), в 4 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітині. Як приклади таких алкілуючих агентів можуть бути згадані азотисті аналоги іприту, такі як мехлоретамін, хлорамбуцил, мелфалан, хлоргідрат, піпоброман, преднімустин, фосфат динатрію або естрамустин; оксазафосфорини, такі як циклофосфамід, альтретамін, трофосфамід, сульфофосфамід або іфосфамід; азиридини або етиленіміни, такі як тіотепу, триетиленамін або альтретамін; нітрозосечовини, такі як кармустин, стрептозоцин, фотемустин або ломустин; алкілсульфонати, такі як бусульфан, треосульфан або імпросульфан; триазени, такі як дакарбазин; або навіть комплекси платини, такі як цисплатин, оксаліплатин або карбоплатин. Термін "антиметаболіти" стосується речовин, які блокують ріст і/або метаболізм клітини шляхом дії на деякі види активності, особливо на синтез ДНК. Прикладами антиметаболітів є метотрексат, 5-фторурацил, флоксуридин, 5-фтордезоксиуридин, капецитабін, цитарабін, флударабін цитозинарабінозид, 6-меркаптопурин (6-MP), 6-тіогуанін (6-TG), хлордезоксіаденозин, 5-азацитидин, гемцитабін, кладрибін, дезоксикоформіцин і пентостатин. Термін "протипухлинні антибіотики" стосується сполук, які можуть перешкоджати синтезу або інгібувати синтез ДНК, РНК і/або білка. Приклади таких протипухлинних антибіотиків включають доксорубіцин, даунорубіцин, ідарубіцин, валрубіцин, мітоксантрон, дактиноміцин, мітраміцин, плікаміцин мітоміцин C, блеоміцин і прокарбазин. "Інгібітори мітозу" перешкоджають нормальному проходженню клітинного циклу і мітозу. У загальному випадку, інгібітори мікротрубочок або "таксоїди", такі як паклітаксел і доцетаксел, здатні інгібувати мітоз. Також здатні інгібувати мітоз вінкаалкалоїди, такі як вінбластин, вінкристин, віндезин і вінорелбін. Термін "інгібітори функціонування хроматину" або "інгібітори топоізомераз" стосується речовин, які інгібують нормальне функціонування білків, що моделюють хроматин, таких як топоізомерази I та II. Приклади таких інгібіторів включають, для топоізомерази I, - камптотецин а також його похідні, такі як іринотекан або топотекан, і для топоізомерази II, - етопозид, фосфат етипозиду і теніпозид. Термін "антиангіогенезні агенти" стосується будь-якого лікарського засобу, сполуки, речовини або агента, які інгібують ріст кров'яних судин. Приклади антиангіогенезних агентів включають, без якого-небудь обмеження, разоксин (razoxin), маримастат, батимастат, приномастат, таномастат, іломастат CGS-27023A, галофугінон, COL-3, неовастат, BMS-275291, талідомід, CDC 501, DMXAA, L-651582, скваламін, ендостатин, SU5416, SU6668, альфаінтерферон, EMD121974, інтерлейкін-12, IM862, ангіостатин і вітаксин. Термін "антиестрогени" або "антиестрогенні агенти" стосується будь-якої речовини, яка ослабляє, антагонізує або інгібує дію естрогену. Прикладами таких агентів є тамоксифен, тореміфен, ралоксифен, дролоксифен, іодоксифен (iodoxyfene), анастрозол, летрозол та ексеместан. Термін "антиандрогени" або "антиандрогенні агенти" стосується будь-якої речовини, яка ослабляє, антагонізує або інгібує дію андрогену. Прикладами антиандрогенів є флутамід, нілутамід, бікалутамід, спіронолактон, ципротерону ацетат, фінастерид і цимітидин. Імуномодуляторами є речовини, які стимулюють імунну систему. Приклади таких імуномодуляторів включають інтерферон, інтерлейкіни, такі як алдеслейкин, OCT-43, денілейкін дифлітокс або інтерлейкін-2, фактори некрозу пухлин, такі як тазонермін, або інші типи імуномодуляторів, такі як лентинан, сизофіран, роквінімекс, підотимод, пегадемаза, тимопентин, полі- I:C (поліінозинова:поліцитидилова кислота) або левамізол в комбінації з 5-фторурацилом. Докладнішу інформацію фахівець в даній галузі техніки може знайти в довіднику під редакцією Association Francaise des Enseignants de Chimie Therapeutique з назвою "Traite de chimie therapeutique, Vol. 6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans Ie traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003". Як протипухлинні агенти також можуть бути згадані агенти променевої терапії, гормонотерапії або терапевтичні агенти, що направляються невеликими молекулами, наприклад інгібіторами тирозинкіназ. І нарешті, згідно з переважним втіленням антитіла являють собою частину протипухлинних агентів, які можуть бути використані згідно з винаходом. Більш конкретно, як необмежувальний приклад можна згадати наступні антитіла: антитіла проти EGFR, такі як цетуксимаб (C225 або ербітакс), матузумаб, huR3, HuMax-EGFR або панітумаб; антитіла проти VEGF (судинний ендотеліальний фактор росту), такі як бевацизумаб (авастин) або 2C3; антитіла проти IGF-1R, такі як 7C10, h7C10, hEM164, ABX-IGF-1R, Mab (моноклональне антитіло (також mAb)) 39, 1H7 або 4G11; антитіла проти HER2, такі як трастузумаб (герцептин) або пертузумаб; антитіла проти CD20 (лейкоцитарний антиген 20), такі як комеритуксимаб (commerituximab), ібритумомаб або тоситумомаб; антитіла проти CD33, такі як гемтузумаб або лінтузумаб; антитіла проти CD22, такі як епратузумаб; антитіла проти CD52, 5 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 такі як алемтузумаб; антитіла проти EpCAM (молекула адгезії епітеліальних клітин), такі як едреколомаб, Ch 17-1A або IGN-101; антитіла проти CTP21 або 16, такі як Xactin; антитіла проти 131 131 ДНК-Ag, такі як I-Cotara TNT-1 ( I-котара - агент 1 терапії некрозу пухлин); антитіла проти MUC1 (муцин-1), такі як пентумомаб або R1150; антитіла проти MUC18, такі як ABX-MA1; антитіла проти GD3, такі як мітумомаб; антитіла проти CEA (карциноембріональний антиген), такі як CeaVac або лабетузумаб; антитіла проти CA125, такі як OvaRex; антитіла проти HLA(головний комплекс гістосумісності)-DR, такі як аполізумаб; антитіла проти CTLA4 (цитотоксичний T-лімфоцитарний антиген 4), такі як MDX-010; антитіла проти PSMA 111 90 177 (мембранний антиген передміхурової залози), такі як MDX-070, In и Y-J591, Lu J591, J591DM1; антитіла, направлені проти антигену Л'юіса (anti-Lewis Y antibodies), такі як IGN311; 90 антиангіогенезні антитіла, такі як AS1405 та YmuBC1; антитіла проти Trail-R1 (TNF-related apoptosis-induced ligand receptor 1; рецептор 1 спорідненого фактору некрозу пухлини апоптозиндуючого ліганду), такі як TRAIL R1mAb або TRAIL R2mAb; або навіть будь-яке антитіло, направлене проти тирозинкіназного рецептора, відмінного від згаданих вище, або RON (recepteur d'origine nantais) рецептора, cMET-рецептора, CXCR 2 (рецепторів хемокінів типу C-X-C), CXCR4, рецепторів ефринового типу і так далі, подібно до терапій направленої дії з використанням невеликих хімічних молекул, таких як інгібітори тирозинкіназ. Безсумнівно, цей список жодним чином не є обмежувальним, і його метою є просто згадка про антитіла, використовувані або розроблені на сьогоднішній день. Згідно з конкретним втіленням винаходу мається на увазі, що вказана резистентна пухлина є стійкою до різних видів лікування або протипухлинних агентів, при цьому останні можуть мати різноманітну природу. Більш конкретно, застосування за винаходом характеризується тим, що вказана щонайменше одна протипухлинна сполука складається щонайменше з двох, переважно щонайменше з трьох сполук різної природи, які і/або мають різні механізми дії, і/або направлені на різні білки. Під різним механізмом дії розуміють, наприклад те, що протипухлинні агенти будуть впливати на різні біологічні функції клітини, такі як ангіогенез, синтез ДНК або навіть мітоз. Більш конкретно, направлена дія на різні білки стосується випадку, коли протипухлинні агенти є антитілами, здатними зв'язуватися з білками або рецепторами різної природи. Абсолютно очевидно, що можна розглядати або комбінування лише антитіл одного з одним або лише хіміотерапевтичних агентів одного з одним, або комбінування обох цих сімейств сполук одного з одним або з променевою терапією, гормонотерапевтичними лікуваннями або терапіями направленої дії, що використовують невеликі хімічні молекули, як описано вище. Також переважно, хоча необов'язково, щоб у всіх протипухлинних сполук був би різний механізм дії або вони б діяли на різні мішені. Згідно з другим аспектом задачею даного винаходу є спосіб створення in vitro антитіла або одного з його функціональних фрагментів, направленого проти пухлинного антигену, що експресується на поверхні пухлини, стійкої щонайменше до однієї протипухлинної сполуки, причому вказаний пухлинний антиген, переважно, не експресується на поверхні пухлинних клітин відповідної нативної (нелікованої) пухлини і вказаний пухлинний антиген можливо залучений в стійкість вказаної пухлини, стійкої до протипухлинного лікування, спосіб, що включає стадію, яка складається з імунізації тварин безпосередньо подрібненим гомогенатом, і/або суспензією, і/або клітинним лізатом з вказаної резистентної пухлини, і стадію, що складається з відбору антитіл, які розпізнають резистентну пухлину, а не ненативну пухлину, з якої походить резистентна пухлина. Згідно з конкретним аспектом цього способу за винаходом описаний спосіб створення in vitro антитіла або одного з його функціональних фрагментів, направленого проти пухлинного антигену, що експресується на поверхні резистентної пухлини, можливо залученого в стійкість вказаної резистентної пухлини, який включає імунізацію тварин безпосередньо подрібненим гомогенатом, і/або суспензією, і/або клітинним лізатом з вказаної пухлини, стійкої щонайменше до однієї протипухлинної сполуки (протипухлинної сполуки, стійкість до якої даної пухлини була встановлена або стійкість до якої бажано індукувати), або після толеризації тварин подрібненим гомогенатом, і/або суспензією, і/або клітинним лізатом з нативної пухлини (пухлини, що не піддавалася якому-небудь лікуванню) або без толеризації. Метою цієї толеризації, яку проводять з використанням імуносупресивного агента типу циклофосфаміду, є заглушення імунної відповіді, направленої проти всіх поверхневих антигенів, присутніх до проведення протипухлинного лікування(ь), що застосовується до тварини або людини з метою індукції стійкості або в рамках терапії, що стосується людей. Таким чином, імунна відповідь після введення, особливо за допомогою ін'єкції, препаратів з резистентних пухлин буде сфокусована 6 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на структурах поверхонь, що індукуються лікуванням і потенційно залучені у встановлення стійкості пухлини. Ефективність толеризації оцінюють на підставі подальшого зникнення сироваткового титру, що встановлюється після імунізації тварин пухлинними клітинами з нативної пухлини. Потім проводять відбір зразків селезінок мишей, імунізованих згідно з вищезазначеним способом, і здійснюють злиття спленоцитів з мієломними клітинами відповідно до стандартного способу, відомого фахівцеві в даній галузі техніки. Скринінг гібридом, одержаних після цього клітинного злиття, буде проведений за допомогою "диференційної імуногістохімії" на предметних стеклах, що приготовані заздалегідь і несуть зрізи (нелікованих) "нативних пухлин" або зрізи резистентних пухлин (лікованих як одним, так і багатьма протипухлинними агентами). З метою продукування антитіл і тестування їх на предмет їх протипухлинної активності будуть відібрані, клоновані і заморожені лише гібридоми, які продукують антитіла, які розпізнають резистентну пухлину, але не нативні пухлини. Цілком цей спосіб буде схематично зображений згодом на Фіг. 2 та 3. Слід зазначити, що такий підхід також може бути запропонований для пошуку і виявлення внутрішньоклітинних молекул, залучених в стійкість. Визначені вище антитіла за даним винаходом, переважно, являють собою специфічні, особливо мишачі, химерні або гуманізовані моноклональні антитіла, які можуть бути одержані згідно із стандартними способами, добре відомими фахівцеві в даній галузі техніки. У загальному випадку для одержання моноклональних антитіл або їх функціональних фрагментів, особливо мишачого походження, можна послатися на методики, описані зокрема, у довіднику "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) або на методику одержання з гібридом, описану Kohler і Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975). Як антитіла за даним винаходом також включені химерні або гуманізовані антитіла. Химерне антитіло призначене для позначення антитіла, яке містить природну варіабельну ділянку (легкого ланцюга і важкого ланцюга), що походить з антитіла заданого виду, в асоціації з константними ділянками легкого ланцюга і важкого ланцюга антитіла, гетерологічного вказаному заданому виду (миші, коні, кролики, собаки, корови, кури тощо). Антитіла або їх фрагменти химерного типу за винаходом можуть бути одержані шляхом використання методик генетичної рекомбінації. Наприклад, химерне антитіло може бути одержане за допомогою клонування рекомбінантної ДНК, яка включає в себе промотор і послідовність, що кодує варіабельну ділянку не-людського, особливо мишачого, моноклонального антитіла за винаходом, і послідовність, що кодує константну ділянку людського антитіла. Химерне антитіло за винаходом, що кодується таким рекомбінантним геном, буде, наприклад людино-мишачою конструкцію, причому специфічність цього антитіла буде визначатися варіабельною ділянкою, що походить з мишачої ДНК, а його ізотипи константною ділянкою, що походить з людської ДНК. Відносно способів одержання химерних антитіл можна послатися, наприклад на документ Verhoeyn і ін. (BioEssays, 8: 74, 1988), Morrison і ін. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6851-6855, 1984) або патент США 4816567. Гуманізоване антитіло призначене для позначення антитіла, яке містить CDR-ділянки, що походять з антитіла не-людського походження, причому інші частини молекули даного антитіла походять з одного (або більш ніж одного) людського антитіла. До того ж, деякі із залишків сегментів остову (skeleton) (які називаються FR) можуть бути замінені з метою збереження афінності зв'язування (Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327, 1988). Гуманізовані антитіла за винаходом або їх фрагменти можуть бути одержані з використанням методик, відомих фахівцеві в даній галузі техніки (таких як, наприклад описані в документах Singer et al., J. Immun. 150: 2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; або Bebbington et al., Bio/Technology, 10: 169-175, 1992). Фахівцеві в даній галузі техніки також відомі і інші методики одержання гуманізованих антитіл, такі як, наприклад методика "CDR-прищеплення" ("CDR Grafting"), описана PDL (Public Documentation License), яка є предметом винаходу патентів EP 0451261, EP 0682040, EP 0939127, EP 0566647 або ще US 5530101, US 6180370, US 5585089 та US 5693761. Також можна зазначити патенти US 5639641 або ще US 6054297, US 5886152 та US 5877293. Функціональний фрагмент антитіла за винаходом призначений, зокрема, для позначення такого фрагмента антитіла, як фрагменти Fv, scFv (одноланцюжкові Fv; sc від англ. simple chain), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc, або діатела або будь-який фрагмент, тривалість існування (lifetime) якого була б збільшена за допомогою хімічної модифікації, подібної до додавання полі(алкілен)гліколю, такого як поліетиленгліколь (ПЕГ), в результаті "ПЕГлювання", або за 7 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 допомогою інкорпорації в лізосоми. Вказаний фрагмент звичайно містить щонайменше один з характерних CDR того антитіла, з якого він походить, і звичайно здатний до прояву хоч часткової активності антитіла, з якого він походить. Переважно, вказані функціональні сегменти будуть складатися з часткової послідовності або будуть містити часткову послідовність важкого або легкого варіабельного ланцюга антитіла, з якого вони походять, причому вказана часткова послідовність по суті буде належним чином зберігати ту саму специфічність зв'язування, що і антитіло, з якого вона походить, і достатню афінність, переважно, щонайменше еквівалентну 1/100, більш переважно, щонайменше 1/10 від афінності антитіла, з якого вона походить. Такий функціональний фрагмент буде включати як мінімум 5 амінокислот, переважно, 10, 15, 25, 50 та 100 послідовних амінокислот з послідовності антитіла, з якого він походить. Переважно, ці функціональні фрагменти будуть фрагментами типу Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc або діатела, які звичайно мають ту саму специфічність зв'язування, що і антитіло, з якого вони походять. Згідно з даним винаходом фрагменти антитіл за винаходом можуть бути одержані з антитіл так, як описано раніше, такими способами, як переварювання ферментами, такими як пепсин або папаїн, і/або за допомогою розщеплювання дисульфідних містків в результаті хімічного відновлення. По-іншому фрагменти антитіл за даним винаходом можуть бути одержані із застосуванням методик генетичної рекомбінації, також добре відомих фахівцеві в даній галузі техніки, або навіть за допомогою пептидного синтезу, наприклад із застосуванням автоматичних пептидних синтезаторів, як наприклад, які випускаються Applied Biosystems, тощо. Більш переважно, винахід включає антитіла або їх функціональні фрагменти за даним винаходом, особливо химерні або гуманізовані антитіла, одержані за допомогою генетичної рекомбінації або шляхом хімічного синтезу. Згідно з переважним втіленням способу за винаходом вказану імунізацію проводять за допомогою внутрішньочеревинної, і/або підшкірної, і/або внутрішньовенної, і/або внутрішньоселезінкової ін'єкції. Оскільки кожен спосіб імунізації рівноцінний іншому, вибір одного з них відносно іншого роблять відповідно до використовуваних тварин і знань і досвіду фахівця в даній галузі техніки. Більш конкретно, згідно з першим втіленням результуючу пухлину одержують безпосередньо шляхом біопсії і/або хірургії від пацієнта, який проходить або проходив терапевтичне лікування з використанням щонайменше однієї протипухлинної сполуки, здатної індукувати стійкість або стійкість до якої (даної пухлини) встановлена. Згідно з другим втіленням резистентну пухлину індукують за допомогою трансплантації пухлинної лінії і/або всієї людської пухлини або її частини тварині і потім за допомогою лікування цієї тварини шляхом введення ін'єкцією щонайменше однієї протипухлинної сполуки, стійкість до якої бажано індукувати або встановити. Яким би не було описане вище переважне втілення, спосіб за винаходом характеризується тим, що вказане активне антитіло або один з його функціональних фрагментів являє собою моноклональне антитіло. Більш конкретно, вказане моноклональне антитіло або один з його функціональних фрагментів являє собою імуноглобулін, вибраний з групи, яка складається з IgG, IgA, IgM, IgD або IgE. Ще більш переважно, коли вказане моноклональне антитіло або один з його функціональних фрагментів являє собою IgG ізотипу гамма 1, гамма 2 або гамма 4. Однак слід розуміти, що згідно з винаходом переважні імуноглобуліни типів IgG1 та IgG2 через їх здатність індукувати ефекторні функції. Як правило, фахівцеві в даній галузі буде очевидне, що ефекторні функції включають, як необмежувальний приклад, зв'язування з C1q, CDC (комплементзалежну цитотоксичність), зв'язування з рецептором Fc, ADCC (антитілозалежну клітинну цитотоксичність) і фагоцитоз. Більш конкретно, переважними ефекторними функціями за винаходом є ADCC та CDC. У загальному випадку функціональні фрагменти, до яких даний винахід відноситься, вибрані з фрагментів Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv, scFv-Fc і діател або будь-якого фрагмента, тривалість існування якого буде збільшена, подібно до ПЕГільованих фрагментів. У більш конкретному, але ніякою мірою необмежувальному способі, спосіб за винаходом включає щонайменше наступні стадії: i) безпосередню імунізацію тварин подрібненим гомогенатом, і/або суспензією, і/або клітинним лізатом, що походять з резистентної пухлини, ii) злиття клітин селезінки тварини, імунізованої на стадії i), з мієломними клітинами із одержанням гібридом і 8 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 iii) відбір за допомогою диференційної селекції (differential selection) гібридом, секретуючих антитіла, які специфічно розпізнають антигени, що експресуються на поверхні пухлинних клітин резистентної пухлини, і експресія яких індукується в результаті протипухлинного лікування. Під "диференційною селекцією" розуміють будь-який вид селекції, оснований на способах, за допомогою яких індуковані антигени можна відрізнити за появою стійкості до лікування від антигенів, присутніх на клітинах до встановлення цієї стійкості. Як необмежувальний приклад методики, що забезпечує таку "диференційну селекцію", можна згадати імуногістохімію на заморожених зрізах або включених в парафін зразках або підходи за типом "білкових масивів" або "генних масивів". Більш конкретно, використання так званої методики "тканинного масиву" є переважним. Методика "тканинного масиву" полягає в побудові з блоків тканин, включених в парафін або заморожених, нових блоків, які містять від декількох десятків до декількох сотень серцевин (cores) цих тканин так, щоб після розрізання цих блоків "тканинних масивів" була можливість виготовлення предметних стекол мікроскопа, які містять від декількох десятків до декількох сотень зрізів тканин. Згідно з переважним втіленням спосіб за винаходом додатково включає перед стадією i), описаною вище, наступні стадії: а) відбір тварин і трансплантацію твариною пухлинної лінії і/або всієї так званої "нативної" пухлини або її частини, b) лікування частини цих підданих трансплантації тварин щонайменше однією протипухлинною сполукою, c) витягання цілком або частин так званих "нативних" пухлин з нелікованих тварин, підданих трансплантації на стадії а), d) витягання цілком або частин резистентних пухлин з тварин, що лікуються на стадії b), e) підготовку засобу для диференційної селекції антитіл з пухлин, повністю або частково витягнутих на стадіях с) та d), відповідно, і f) підготовку подрібненого гомогената і/або клітинного лізату з резистентних пухлин, повністю або частково витягнутих на стадії d). Слід розуміти, що в даному описі вираз "нативні пухлини" і "вихідні пухлини" є еквівалентними і будуть використовуватися незалежно. Згідно з втіленням винаходу вказана пухлинна лінія і/або так звана "нативна" пухлина вибрана з групи пухлинних клітин (A549) з легенів, і крім того, але цим не обмежуючись, з товстої кишки, передміхурової залози, молочних залоз, яєчників або будь-якої пухлини, стійкості яких до лікування встановлені. На додаток до цього, протипухлинна сполука, що використовується згідно з винаходом, вибрана з хіміотерапевтичних агентів, агентів променевої терапії, хімічних молекул або антитіл, причому всі ці різні сполуки визначені вище в даному описі. Згідно з переважним втіленням винаходу вказана щонайменше одна протипухлинна сполука являє собою моноклональне антитіло, причому вказане моноклональне антитіло навіть більш переважно вибране з групи антитіл або їх функціональних фрагментів, направлених проти рецепторів ростових факторів, молекул, залучених в ангіогенез, або навіть хемокінів та інтегринів, залучених в явища клітинної міграції. Під "ростовими рецепторами" розуміють будь-який трансмембранний білок, який після зв'язування ліганду(ів) або незалежної зміни конформації ліганду або гомо- або гетеродимеризації з іншими мембранними білками буде опосередкувати проліферативну відповідь. Під "молекулами, залученими в ангіогенез" розуміють будь-який мембранний рецептор, який після зв'язування ліганду(ів) або незалежної зміни конформації ліганду або гомоабо гетеродимеризації з іншими мембранними білками буду викликати утворення судин. Під "хемокінами та інтегринами, залученими в явища клітинної міграції" розуміють будь-яку розчинну молекулу, здатну мати активність переварювання позаклітинного матриксу і/або хемоатрактантну активність. Згідно з іншим втіленням винаходу спосіб характеризується тим, що вказана щонайменше одна протипухлинна сполука являє собою комбінацію щонайменше двох, переважно щонайменше трьох протипухлинних сполук різної природи і/або таких, що характеризуються різними механізмами дії і/або направлених на різні білки. Переважно, вказана комбінація протипухлинних сполук складається з комбінації моноклональних антитіл або їх функціональних фрагментів. Ще більш переважно, вказана комбінація моноклональних антитіл або їх функціональних фрагментів складається з комбінації антитіл вибраних з антитіл проти IGF-1R, проти EGFR, проти Her/2neu, проти VEGF, проти VEGFR (рецептора VEGF), проти CXCR, проти cMET, проти 9 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 RON, ефринового антитіла тощо. Згідно з втіленням, як необмежувальний приклад, спосіб за винаходом характеризується тим, що вказана комбінація являє собою комбінацію антитіла проти IGF-1R, антитіла проти EGFR і антитіл проти Her/2neu, причому вказані згадані антитіла, переважно, є моноклональними антитілами 7C10, 225 та h4D5, відповідно. Моноклональне антитіло 7C10 являє собою антитіло, описане в заявці на патент WO 03/059951, поданій заявником 20 січня 2003 року, і вміст якої включений в даний опис за допомогою посилання. Моноклональне антитіло 225 являє собою антитіло, що продукується гібридомою, депонованою в ATCC під посилальним номером HB-8508. Моноклональне антитіло h4D5 являє собою наявний в продажі герцетин, наприклад в ICR (Institut Claudius Regaud). Згідно з іншим переважним втіленням спосіб за винаходом характеризується тим, що вказану стадію iii) для проведення селекції гібридом, секретуючих антитіла, які не розпізнають антигени так званої "нативної" пухлинної клітини, виконують шляхом диференційного скринінгу між тканиною нелікованої так званої "нативної" пухлини і тканиною резистентної пухлини і/або пухлини, яка зроблена резистентною. Під "диференційним скринінгом" розуміється скринінг, за допомогою якого індуковані антигени можна відрізнити за появою стійкості до лікування від антигенів, присутніх на клітинах до встановлення цієї стійкості. Переважно, коли диференційний скринінг проводять, застосовуючи засіб, одержаний на стадії e), як описано вище. І нарешті, згідно з останнім втіленням винаходу, переважно, що даний спосіб включає додаткову стадію толеризації перед стадією i). Під "толеризацією" розуміється ослаблення імунної відповіді, що індукується за допомогою імуносупресивних сполук, таких як циклофосфамід. На практиці вказана стадія толеризації може складатися з: - введення, особливо шляхом ін'єкції, тваринам подрібненого гомогената, і/або суспензії, і/або клітинного лізату, одержаних з так званих нативних пухлин, що походять із стадії с), і - обробки цих тварин імуносупресором з метою елімінування B-клітин, активованих ін'єкцією на описаній вище стадії і тим самим інгібування будь-якої можливої відповіді проти вказаної так званої нативної пухлини. Безсумнівно, будь-який схожий спосіб або практична діяльність, за допомогою чого може бути одержаний той самий результат, слід розглядати еквівалентним і включеним в обсяг винаходу. Під "імуносупресором", розуміють будь-яку речовину, здатну виснажувати (depleting) клітинні популяції імунної системи. Як необмежувальний приклад може бути згаданий циклофосфамід. В іншому аспекті даний винахід стосується способу створення і відбору in vitro антитіла або одного з його функціональних фрагментів, здатного інгібувати стійкість пухлини до протипухлинної сполуки або до способу створення і відбору in vitro антитіла або одного з його функціональних фрагментів, направленого проти пухлинного антигену, що експресується на поверхні пухлини, стійкої щонайменше до однієї протипухлинної сполуки, причому вказаний пухлинний антиген залучений в стійкість вказаної пухлини до протипухлинної сполуки, способу, що характеризується тим, що він включає: a) спосіб створення in vitro антитіла або одного з його функціональних фрагментів за винаходом, причому вказане антитіло направлене проти вказаного пухлинного антигену, що специфічно експресується на поверхні резистентної пухлини, вказаний пухлинний антиген не експресується на поверхні клітин нативної пухлини, з якої дана резистентна пухлина походить; b) приведення одержаного на стадії а) антитіла in vitro або in vivo в контакт з пухлиною, стійкою до протипухлинної сполуки; і с) відбір вказаного антитіла, якщо продемонстрований інгібуючий ефект цього антитіла на стійкість пухлини до протипухлинної сполуки. Згідно з іншим втіленням може бути проведений тест in vitro або in vivo з метою визначення того, чи залучений антиген, експресію якого індукують протипухлинним лікуванням, в явище стійкості або ні. Згідно з переважним втіленням така стадія може полягати в тестуванні in vitro або in vivo антитіла, одержаного відповідно до винаходу, на резистентній пухлині і спостереженням того, чи розвивається на резистентній пухлині інгібуюча стійкість активність. Ще один інший аспект даного винаходу стосується способу створення і відбору in vitro антитіла або одного з його функціональних фрагментів, здатного проявляти протипухлинну активність, особливо шляхом інгібування проліферації пухлинних клітин, експресуючих антиген, проти якого направлене вказане антитіло, яке характеризується тим, що спосіб включає: 10 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 a) спосіб створення in vitro антитіла або одного з його функціональних фрагментів за винаходом, причому вказане антитіло направлене проти вказаного пухлинного антигену, що специфічно експресується на поверхні резистентної пухлини, вказаний пухлинний антиген не експресується на поверхні клітин нативної пухлини, з якої резистентна пухлина походить; b) приведення одержаного на стадії а) антитіла in vitro або in vivo в контакт з пухлиною, клітини якої експресують вказаний пухлинний антиген, переважно, з вказаною резистентною пухлиною, використаною на стадії а), або з пухлиною, що має агресивний фенотип; і с) відбір вказаного антитіла, якщо на цій пухлині продемонстрований протипухлинний ефект, особливо інгібування клітинної проліферації цієї пухлини. На стадії b) способу, наведеного раніше, слід розуміти, що пухлина, клітини якої експресують вказаний пухлинний антиген, не обов'язково є пухлиною, стійкою до протипухлинної сполуки, використаної для створення вказаного антитіла. На стадії b) може бути використана будь-яка пухлина, особливо з агресивним фенотипом, пухлинні клітини якої експресують пухлинний антиген, що розпізнається вказаним антитілом. Крім того, винахід очевидно стосується застосування описаного вище способу для створення терапевтичних і/або діагностичних моноклональних антитіл. Винахід також охоплює часткове застосування такого способу, який може бути розроблений фахівцем в даній галузі техніки з метою задоволення конкретному критерію або, інакше, з метою зовсім повної відмінності від даного опису. Згідно з третім аспектом винаходу запропоновані моноклональне антитіло або один з його функціональних фрагментів, одержане(ий) в результаті застосування описаного вище способу за винаходом. Даний винахід є передовим в тому значенні, що на даний момент не описано жодного антитіла, яке має такі властивості, більше того, одержаного в такий спосіб. Переважно, вказані функціональні фрагменти за даним винаходом будуть вибрані з фрагментів Fv, scFv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv-Fc або діател або будь-якого функціонального фрагмента, тривалість існування якого була б збільшена за допомогою хімічної модифікації, особливо в результаті "ПЕГілювання", або за допомогою інкорпорації в лізосому. Безсумнівно, цей список ніяким чином не є обмежувальним, або будь-який інший тип фрагмента, відомого фахівцеві в даній галузі техніки, слід розглядати як частину винаходу. Як ілюстративний приклад винаходу далі описано 5 антитіл, одержаних шляхом застосування даного способу за винаходом. Ці антитіла, названі як 1A6, 1A9, 2E11, 3C11 та 3G7, можуть бути мишачими, химерними або гуманізованими. Згідно з першим втіленням даний винахід стосується моноклонального антитіла або одного з його функціональних фрагментів, що характеризується тим, що він/воно містить: - легкий ланцюг, який містить CDR-ділянки послідовностей SEQ ID No 1, 2 та 3, або для яких послідовності мають щонайменше 80 % ідентичності після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No 1, 2 та 3; і - важкий ланцюг, який містить CDR-ділянки послідовностей SEQ ID No 4, 5 та 6, і для яких послідовності мають щонайменше 80 % ідентичності після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No 4, 5 та 6. У даному описі терміни поліпептиди, поліпептидні послідовності, пептиди і білки, зв'язані з антитілами або їх послідовностями, взаємозамінні. Тут слід розуміти, що винахід не стосується антитіл в їх природній формі, тобто вони не беруться в їх природному оточенні, а існує можливість їх виділення та одержання за допомогою очищення з природних джерел або також одержання їх з використанням генетичної рекомбінації або із застосуванням хімічного синтезу, і тому вони можуть включати неприродні амінокислоти, як буде описано пізніше. CDR-ділянка(ки) або CDRs призначені для позначення гіперваріабельних ділянок важких і легких ланцюгів імуноглобулінів, як визначено Kabat і ін. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.s. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, і пізніші видання). Існують 3 CDR важких ланцюгів і 3 CDR легких ланцюгів. Термін CDR або CDRs використовується в даному описі для позначення, залежно від випадку, однієї з цих ділянок або декількох або навіть всіх цих ділянок, які містять велику частину амінокислотних залишків, відповідальних за афінне зв'язування антитілом антигену або епітопа, який воно розпізнає. "Відсоток ідентичності" між двома послідовностями нуклеїнових кислот або амінокислот в контексті даного винаходу призначений для позначення відсотка нуклеотидів або ідентичних амінокислотних залишків між обома порівнюваними послідовностями, одержаного після найкращого вирівнювання (оптимального вирівнювання), при тому, що цей відсоток є чисто статистичним, і відмінності між обома послідовностями розподілені випадковим чином і по всій їх довжині. Порівняння послідовностей двох нуклеїнових кислот або двох амінокислотних 11 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 послідовностей традиційно проводять, порівнюючи ці послідовності після вирівнювання їх оптимальним чином, при цьому вказане порівняння може бути проведене за допомогою порівняння сегментів або з використанням "вікна порівняння". Оптимальне вирівнювання послідовностей для їх порівняння може бути здійснене також і вручну із застосуванням алгоритму локальної гомології Smith та Waterman (1981) (Ad. App. Math. 2: 482), із застосуванням алгоритму локальної гомології Neddleman et Wunsch (1970) (J. MoI. Biol. 48: 443), із застосуванням аналогічного способу пошуку Pearson та Lipman (1988) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444), із застосуванням пакетів комп'ютерних програм, що використовують ці алгоритми (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакеті програм Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, або навіть із застосуванням пакетів програм для такого порівняння BLAST N або BLAST P). Відсоток ідентичності між двома послідовностями нуклеїнових кислот або амінокислот визначають за допомогою порівняння цих двох послідовностей, що вирівнюються оптимальним способом, при цьому порівнювана послідовність нуклеїнових кислот або амінокислот може містити домішки або делеції відносно еталонної послідовності (reference sequence) для здійснення оптимального вирівнювання між обома послідовностями. Відсоток ідентичності розраховують, визначаючи число ідентичних положень, в яких нуклеотидний або амінокислотний залишок буде однаковим в двох послідовностях, і проводячи ділення цього числа ідентичних положень на загальне число положень у вікні порівняння і проводячи множення одержаного результату на 100 для одержання відсотка ідентичності між обома цими послідовностями. Наприклад, можна використовувати програму BLAST "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al, "Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol. Lett. 174: 247-250), доступну на сайті http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, з параметрами, що використовуються за умовчанням (зокрема, що стосується параметрів "штраф на внесення делеції" ("gap open penalty"): 5, і "штраф на продовження делеції" ("extension gap penalty": 2; при цьому вибраною матрицею є, наприклад, матриця "BLOSUM 62", запропонована цією програмою), відсоток ідентичності між обома порівнюваними послідовностями безпосередньо обчислюється цією програмою. Можна також використовувати інші програми, такі як пакети програмного забезпечення "ALIGN" або "Megalign" (DNASTAR). Серед амінокислотних послідовностей, які мають щонайменше 80 %, переважно, 85 %, 90 %, 95 % та 98 % ідентичності з еталонною амінокислотною послідовністю, переважні послідовності, які мають відносно еталонної послідовності визначені модифікації, зокрема делецію, домішку або заміну щонайменше однієї амінокислоти, укорочення або вставку. У випадку заміни однієї або більше розташованих один за одним або не розташованих один за одним амінокислот переважні заміни, при яких замінювані амінокислоти замінюються "еквівалентними" амінокислотами. Вираз "еквівалентні амінокислоти" в даному описі запропонований для позначення будь-якої амінокислоти, якою можна замінити одну з амінокислот базисної структури, проте, без істотної зміни біологічних активностей відповідних антитіл, які будуть визначені згодом, особливо в прикладах. Ці еквівалентні амінокислоти можна визначити, покладаючись або на їх структурну гомологію з амінокислотами, яких вони замінюють, або на результати порівняльних тестів біологічної активності між різними антитілами, які можуть бути проведені. Як необмежувальний приклад в наведеній нижче Таблиці 1 повторені можливості замін, які можуть бути проведені без великого впливу на біологічну активність відповідного модифікованого антитіла, зворотні заміни природно можуть розглядатися в тих самих умовах. Таблиця 1 Вихідний залишок Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (C) Gln (Q) Glu (G) Gly (G) His (H) Заміна(и) Val, Gly, Pro Lis, His Gln Glu Ser Asn Asp Ala Arg 12 UA 102812 C2 Продовження таблиці 1 Ile (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Leu Ile, Val, Met Arg Leu Tyr Ala Thr, Cys Ser Tyr Phe, Trp Leu, Ala Переважним є описане вище антитіло, яке одержало назву 1A6 і містить послідовність важкого ланцюга, що відповідає послідовності SEQ ID No 7, і легкий ланцюг, який містить послідовність SEQ ID No 8. Більш конкретно, даний винахід також стосується мишачої гібридоми (1A6), здатної секретувати антитіло 1A6, яке описане вище. У даному описі незалежно використовується одне і те саме кодування, коли йдеться про мишачу гібридому або також про антитіло, що продукується тією самою гібридомою. Така мишача гібридома являє собою гібридому, депоновану в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) 31 травня 2006 року під № I-3612. Серед шести коротких CDR-послідовностей третій CDR важкого ланцюга (CDRH3) характеризується великим ступенем варіабельності (велика різноманітність по суті внаслідок механізмів організації генів, що приводять до нього). Він може бути таким коротким, як 2 амінокислоти, тоді як найбільший відомий розмір дорівнює 26. Функціонально CDRH3 відіграє окрему роль у визначені специфічності антитіла (Segal et al., PNAS, 71: 4298-4302, 1974; Amit et al., Science, 233: 747-753, 1986; Chothia et al., J. MoI. Biol, 196: 901-917, 1987; Chothia et al., Nature, 342: 877-883, 1989; Caton et al., J. Immunol, 144: 1965-1968, 1990; Sharon et al., PNAS, 87: 4814-4817, 1990; Sharon et al., J. Immunol, 144: 4863-4869, 1990; Kabat et al., J. Immunol, 147: 1709-1719, 1991). Відомо, що лише невеликий відсоток амінокислот CDRs вносить вклад в будову сайту зв'язування даного антитіла, проте ці залишки повинні підтримуватися в дуже специфічній просторовій конформації. Згідно з другим втіленням винахід стосується моноклонального антитіла або одного з його функціональних фрагментів, що характеризується тим, що воно/він містить: - легкий ланцюг, який містить CDR-ділянки послідовностей SEQID No 9, 10 та 11, або для яких послідовності мають щонайменше 80 % ідентичності після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No 9, 10 та 11; і - важкий ланцюг, який містить CDR-ділянки послідовностей SEQ ID No 12, 13 та 14, або для яких послідовності мають щонайменше 80 % ідентичності після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No 12, 13 та 14. Згідно з іншим втіленням вказане антитіло за винаходом, що одержало назву 1A9, містить послідовність важкого ланцюга, що відповідає послідовності SEQ ID No 15, і легкий ланцюг, який містить послідовність SEQ ID No 16. Згідно з іншим аспектом також заявлена мишача гібридома (1A9) здатна секретувати антитіло, визначене вище. І нарешті, згідно з переважним втіленням винаходу включена мишача гібридома 1A9, депонована в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) 31 травня 2006 року під № I-3613. Згідно з третім втіленням винахід стосується моноклонального антитіла або одного з його функціональних фрагментів, одержаного згідно із способом винаходу і містить: - легкий ланцюг, який містить CDR-ділянки з послідовностями SEQ ID No 17, 18 та 19 або для яких послідовності мають щонайменше 80 % ідентичності після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ No 17, 18 та 19; і - важкий ланцюг, який містить CDR-ділянки послідовностей SEQ ID No 20, 21 та 22, або для яких послідовності мають щонайменше 80 % ідентичності після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No 20, 21 та 22. 13 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Переважно, вказане антитіло за винаходом, яке одержало назву 2E11, містить послідовність важкого ланцюга, який містить послідовність SEQ ID No 23, і легкий ланцюг, який містить послідовність SEQ ID No 24. Згідно з іншим аспектом винахід також включає мишачу гібридому 2E11, здатну секретувати антитіло, описане вище. Більш конкретно, вказана мишача гібридома являє собою гібридому, депоновану в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) 31 травня 2006 року під № I-3615. Згідно з четвертим втіленням винахід стосується моноклонального антитіла або одного з його функціональних фрагментів, одержаного описаним вище способом і містить: - легкий ланцюг, який містить CDR -ділянки послідовностей SEQ ID No 25, 26 та 27, або для яких послідовності мають щонайменше 80 % ідентичності після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No 25, 26 та 27; і - важкий ланцюг, який містить CDR-ділянки послідовностей SEQ ID No 28, 29 та 30, або для яких послідовності мають щонайменше 80 % ідентичності після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No 28, 29 та 30. Більш конкретно, вказане антитіло за винаходом, яке одержало назву 3С11, містить послідовність важкого ланцюга, який містить послідовність SEQ ID No 31, і легкий ланцюг, який містить послідовність SEQ ID No 32. Згідно з іншим аспектом винахід також стосується мишачої гібридоми 3C11, здатної секретувати антитіло, описане вище. Вказана гібридома, переважно, являє собою гібридому, депоновану в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) 31 травня 2006 року під № I-3614. І нарешті, згідно з п'ятим втіленням винаходу останнє стосується моноклонального антитіла або одного з його функціональних фрагментів, одержаного в результаті застосування способу за даним винаходом і містить: - легкий ланцюг, який містить CDR-ділянки послідовностей SEQ ID No 33, 34 або 35, або для яких послідовності мають щонайменше 80 % ідентичності після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No 33, 34 та 35; і - важкий ланцюг, який містить CDR-ділянки послідовностей SEQ ID No 36, 37 та 38, або для яких послідовності мають щонайменше 80 % ідентичності після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No 36, 37 та 38. Переважно, вказане антитіло, яке одержало назву 3G7, містить послідовність важкого ланцюга, який містить послідовність SEQ ID No 39, і легкий ланцюг, який містить послідовність SEQ ID No 40. Згідно з іншим аспектом винаходу заявлена мишача гібридома 3G7, здатна секретувати антитіло, описане вище. Вказана гібридома, переважно, являє собою гібридому, депоновану в 1a CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) 31 травня 2006 року під № I-3616. Для розуміння, вона наведена в Таблиці 2, нижче, в якій вказана відповідність між антитілами за винаходом і відповідними амінокислотними послідовностями CDR вказаних антитіл. Таблиця 2 Антитіло 1А6 1A9 Важкий ланцюг Легкий ланцюг CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 45 14 SEQ ID No 1 2 3 4 5 6 9 10 11 12 13 14 UA 102812 C2 Продовження таблиці 2 2E11 3C11 3G7 5 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 17 18 19 20 21 22 25 26 27 28 29 30 33 34 35 36 37 38 У Таблиці 3, наведеній в даному описі нижче, в цьому відношенні показана відповідність між цими ж антитілами за винаходом і відповідними амінокислотними послідовностями важких і легких ланцюгів вказаних антитіл. Таблиця 3 Антитіло 1А6 1A9 2E11 3C11 3G7 Важкий ланцюг ціла Легкий ланцюг ціла ціла ціла ціла ціла ціла ціла ціла ціла SEQ ID No 7 8 15 16 23 24 31 32 39 40 І нарешті, в наведеній нижче Таблиці 4 даного опису підсумовувані назви кожного антитіла за винаходом з депозитними номерами в CNCM. 10 Таблиця 4 Гібридома 1А6 1A9 2E11 3C11 3G7 15 Депозитний № в CNCM I-3612 I-3613 I-3614 I-3615 I-3616 Безсумнівно, весь набір властивостей або модифікацій, описаних вище для антитіла 1A6, застосовний до інших антитіл за винаходом і, більш конкретно, до антитіл, ідентифікованих як 1A9, 2E11, 3C11 та 3G7. Аналогічно тому, як описано вище для будь-якого антитіла, одержаного згідно з способом за винаходом, також встановлено, що весь набір бажаних характеристик, властивостей або модифікацій слід також розглядати як застосовний до антитіл, ідентифікованих в даний заявці. 15 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Більш конкретно, встановлено, що будь-який функціональний фрагмент вибраний з фрагментів Fv, scFv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv-Fc і діател або будь-якого фрагмента, тривалість існування якого була б збільшена, наприклад ПЕГільованих фрагментів. Переважно, щоб антитіло за даним винаходом, переважно, являло собою антитіло або один з його функціональних фрагментів, що секретується однією з гідридом, описаних вище, тобто гібридомами I-3612, I-3613, I-3614, I-3615 або I-3616. Згідно з наступним втіленням винаходу вказане антитіло являє собою химерне антитіло і додатково містить константні ділянки легкого ланцюга і важкого ланцюга, що походять з антитіла гетерологічного мишам виду. Переважно, вказаним гетерологічним видом є людський вид. Ще більш переважно, що вказане химерне антитіло або один з його функціональних фрагментів за винаходом характеризується тим, що константні ділянки легкого ланцюга і важкого ланцюга, що походять з людського антитіла, є ділянками каппа і гамма 1, гамма 2 або гамма 4 відповідно. І нарешті, ще більш переважно, що вказане антитіло являє собою гуманізоване антитіло і містить легкий ланцюг і/або важкий ланцюг, при цьому сегменти FR1-FR4 остову вказаного легкого ланцюга і/або важкого ланцюга походять із сегментів FR1-FR4 остову, відповідно, легкого ланцюга і/або важкого ланцюга людських антитіл. Також в конкретному аспекті даний винахід стосується химерного антитіла або одного з його функціональних фрагментів за винаходом, що характеризується тим, що вказане антитіло додатково містить константні ділянки легкого ланцюга і важкого ланцюга, що походять з антитіла гетерологічного мишам виду, особливо людини, і переважно, що константні ділянки легкого ланцюга і важкого ланцюга, що походять з людського антитіла, є ділянками каппа і гамма 1, гамма 2 або гамма 4, відповідно. Згідно з наступним аспектом винаходу описана виділена нуклеїнова кислота, що характеризується тим, що вона вибрана з наступних нуклеїнових кислот: а) нуклеїнової кислоти, ДНК або РНК, що кодує антитіло або один з його функціональних фрагментів за винаходом; b) нуклеїнової кислоти, комплементарної нуклеїновій кислоті, визначеній в a); c) нуклеїнової кислоти, що складається щонайменше з 18 нуклеотидів, здатних гібридизуватися в умовах жорсткої строгості щонайменше з одним з CDR з послідовностей SEQ ID No 41-46, 49-54, 57-62, 65-70, 73-78 або з послідовністю, що має щонайменше 80 % ідентичності після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No 41-46, 49-54, 5762, 65-70, 73-78; і d) нуклеїнової кислоти, яка складається щонайменше з 18 нуклеотидів, здатних гібридизуватися в умовах жорсткої строгості щонайменше з одним з легких ланцюгів з послідовностей SEQ ID No 48, 56, 64, 72 або 80 і/або одним з важких ланцюгів з послідовностей SEQ ID No 47, 55, 63, 71 або 79, або з послідовністю, що має щонайменше 80 % ідентичності після оптимального вирівнювання з послідовностями SEQ ID No 47, 48, 55, 56, 63, 64, 71, 72, 79 або 80. Зміст термінів нуклеїнова кислота, нуклеїнова послідовність або нуклеїновокислотна послідовність, полінуклеотид, олігонуклеотид, полінуклеотидна послідовність, нуклеотидна послідовність, які будуть однаково використані в даному описі, полягає у вказівці на специфічне зв'язування нуклеотидів, або модифікованих, або ні, за допомогою яких можна визначити фрагмент або ділянку нуклеїнової кислоти, які або включають неприродні нуклеотиди, або ні, і які можуть відповідати як дволанцюжковий ДНК, так і одноланцюжковий ДНК і продуктам транскрипції вказаних ДНК. Тут також слід розуміти, що даний винахід не стосується нуклеотидних послідовностей в їх природному хромосомному оточенні, тобто в природних умовах. Ними є послідовності, які виділені і/або очищені, тобто відібрані як зразки прямо або опосередковано, наприклад шляхом копіювання, при цьому їх оточення щонайменше частково модифікується. Зміст полягає також у позначенні в даному описі виділених нуклеїнових кислот, одержаних за допомогою генетичної рекомбінації за допомогою клітин хазяїна, наприклад, або одержаних хімічним синтезом. Нуклеїнові послідовності, які мають відсоток ідентичності щонайменше 80 %, переважно, 85 %, 90 %, 95 % та 98 % після оптимального вирівнювання з переважною послідовністю, призначені для позначення нуклеїнових послідовностей, які мають відносно еталонної нуклеїнової послідовності деякі модифікації, такі як зокрема делеція, укорочення, вставка, химерне злиття і/або особливо заміна типу точкової (point-like substitution). Ними є, переважно, послідовності, в яких закодовані ті самі послідовності амінокислот, що і у еталонної послідовності, причому це пов'язано з виродженістю генетичного коду, або комплементарні послідовності, які здатні специфічно гібридизуватися з переважними еталонними 16 UA 102812 C2 5 10 15 20 послідовностями в умовах жорсткої строгості, особливо як визначено далі. Гібридизація в умовах жорсткої строгості означає, що умови температури та іонної сили вибрані таким чином, що дозволяють підтримувати гібридизацію між двома комплементарними фрагментами ДНК. Як ілюстрація, умови жорсткої строгості стадії гібридизації з метою визначення полінуклеотидних фрагментів, описаних вище, переважно, є наступними. ДНК-ДНК або ДНК-РНК гібридизацію проводять в дві стадії: (1) передгібридизація при 42 °C протягом 3 годин у фосфатному буфері (20 мМ, pH 7.5), який містить 5 x SSC (1 x SSC відповідає 0,15 М NaCl+0,015 М розчин цитрату натрію), 50 % формаміду, 7 % додецилсуфату натрію (SDS), 10 x розчин Денхардта, 5 % декстрансульфату та 1 % ДНК з молочко лососевих; (2) реальна гібридизація протягом 20 годин при температурі, яка залежить від розміру зонда (тобто: 42 °C, для зонда розміром > 100 нуклеотидів) з наступними двома 20-хвилинними промиваннями при 20 °C в 2 x SSC+2 % SDS, 20-хвилинного промивання при 20 °C в 0,1 x SSC+0,1 % SDS. Останнє промивання проводять в 0,1 x SSC+0,1 % SDS протягом 30 хвилин при 60 °C для зонда розміром > 100 нуклеотидів. Умови гібридизації жорсткої строгості, описані вище для полінуклеотиду визначеного розміру, можуть бути адаптовані фахівцем в даній галузі техніки для олігонуклеотидів крупнішого або дрібнішого розміру відповідно до керівництва Sambrook і ін. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor). Для внесення більшої чіткості, відповідність між антитілами за винаходом, більш конкретно, послідовностями CDR, а також варіабельними ланцюгами та їх нуклеотидними послідовностями також викладені в Таблиці 5, нижче. Таблиця 5 Антитіло 1А6 1A9 2E11 3C11 3G7 1А6 1A9 Важкий ланцюг Легкий ланцюг CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3 ціла ціла ціла ціла 17 SEQ ID No 41 42 43 44 45 46 49 50 51 52 53 54 57 58 59 60 61 62 65 66 67 68 69 70 73 74 75 76 77 78 47 48 55 56 UA 102812 C2 Продовження таблиці 5 2E11 3C11 3G7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 ціла ціла ціла ціла ціла ціла 63 64 71 72 79 80 Винахід також стосується вектора, який містить нуклеїнову кислоту за даним винаходом. Винахід особливо стосується клонування і/або експресії векторів, які містять нуклеотидну послідовність за винаходом. Вектори за винаходом, переважно, включають елементи, які дозволяють здійснювати експресію і/або секрецію нуклеотидних послідовностей у визначеній клітині хазяїна. Тому вектор повинен включати промотор, сигнали ініціації і термінації трансляції, а також відповідні ділянки для регуляції транскрипції. Він повинен стабільно підтримуватися в клітині хазяїна і можливо може мати конкретні сигнали для специфічної секреції трансльованого білка. Ці різні елементи вибираються та оптимізуються фахівцем в даній галузі техніки залежно від клітини хазяїна, що використовується. З цією метою нуклеотидні послідовності за винаходом можуть бути вставлені у вектори, що самореплікуються, у вибраному хазяїні або являти собою інтеграційні вектори вибраного хазяїна. Такі вектори одержують способами, які використовуються в даний час фахівцем в даній галузі техніки, і одержаний клон може бути введений відповідному хазяїну стандартними способами, такими як ліпофекція, електропорація, температурний шок або хімічні способи. Векторами за винаходом, наприклад є вектори плазмідного або вірусного походження. Вони корисні для трансформації клітин хазяїна з метою клонування та експресії нуклеотидних послідовностей за винаходом. Винахід також включає клітини хазяїна, які трансформовані вектором або містять вектор за винаходом. Клітина-хозяїн може бути вибрана з прокаріотичної або еукаріотичної систем, наприклад бактерійних клітин, але також клітин дріжджів або клітин тварин, зокрема клітин ссавців. Також можна використовувати клітини комах або клітини рослин. Крім того, винахід стосується тварин, за винятком людей, які містять трансформовану клітину за винаходом. В іншому аспекті задачею винаходу є спосіб одержання антитіла або одного з його функціональних фрагментів за винаходом, що характеризується тим, що він включає наступні стадії: а) культивування клітини хазяїна за винаходом в середовищі і в підходящих умовах культивування; і b) виділення одержаних таким чином вказаних антитіл або одного з їх функціональних фрагментів з культурального середовища або з вказаних культивованих клітин. Трансформовані клітини за винаходом можуть бути використані в способах одержання рекомбінантних поліпептидів за винаходом. Самі способи одержання поліпептиду за винаходом в рекомбінантній формі, які характеризуються тим, що в них застосовується вектор і/або клітина, трансформована вектором за винаходом, включені в даний винахід. Переважно, клітину, трансформовану вектором за винаходом, культивують в умовах, які дозволяють експресуватися вказаному поліпептиду, і вказаний рекомбінантний пептид виділяють. Як встановлено, клітина-хозяїн може бути вибрана з прокаріотичної або еукаріотичної систем. Зокрема, можна ідентифікувати нуклеотидні послідовності за винаходом, які полегшують секрецію в такій прокаріотичній або еукаріотичній системі. Отже, вектор за винаходом, що несе таку послідовність, може бути, переважно, використаний для продукування рекомбінантних білків, призначених для секреції. Дійсно, очищення цих рекомбінантних білків, що представляють інтерес, буде полегшена, оскільки вони присутні більшою мірою в супернатанті культури клітин, ніж всередині клітин хазяїна. Поліпептиди за винаходом також можуть бути одержані шляхом хімічного синтезу. Такий спосіб одержання також являє собою задачу винаходу. Фахівець в даній галузі техніки обізнаний про способи хімічного синтезу, наприклад про методики, в яких застосовують тверді фази (див. особливо Steward et al Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed. (1984)), або про методики, в яких використовують частково тверді фази, 18 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 конденсацію фрагментів або синтез в звичайному розчині. Поліпептиди одержані хімічним синтезом і які можуть включати відповідні неприродні амінокислоти, також включені в даний винахід. Антитіла або один з їх функціональних фрагментів, які можуть бути одержані способом за винаходом, також включені в даний винахід. Біспецифічні або біфункціональні антитіла утворюють друге покоління моноклональних антитіл, у яких в одній і тій самій молекулі об'єднані дві різні варіабельні ділянки (Hollinger and Bohlen, 1999, Cancer and metastasis rev. 18: 411-419). Їх застосовність була продемонстрована як в сфері діагностики так і в сфері терапії через їх здатність до рекрутингу нових ефекторних функцій або до направленої доставки до різних молекул на поверхні пухлинних клітин. Ці антитіла могуть бути одержані хімічними способами (Glennie MJ et al., 1987, J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al., 1995, J. Hemat. 377-382) або фізичними (Staerz U.D. and Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457; Suresh M.R. et al., 1986, Method Enzymol., 121: 210-228), але також і, переважно, із застосуванням методик генетичної інженерії, за допомогою яких гетеродимеризація може бути форсована і які тому полегшують спосіб очищення шуканого антитіла (Merchand et al., 1998, Nature Biotech., 16: 677-681). Ці біспецифічні антитіла можуть бути сконструйовані у вигляді цілих IgG, у вигляді біспецифічних Fab'2, у вигляді Fab'-ПЕГ або у вигляді діател або навіть у вигляді біспецифічних scFv, а також у вигляді тетравалентного біспецифічного антитіла або (антитіла) з двома сайтами зв'язування для кожного антигену-мішені (Park et al., 2000, MOI. Immunol., 37(18): 112330) або його фрагментів, як описано вище. Окрім економічної користі від того, що одержання і введення біспецифічного антитіла є менш дорогим, ніж одержання двох специфічних антитіл, застосування таких біспецифічних антитіл має перевагу, яка полягає в зниженні токсичності лікування. Дійсно, застосування біспецифічного антитіла дозволяє знизити загальну кількість циркулюючих антитіл і, отже, можливу токсичність. У переважному втіленні винаходу біспецифічне антитіло являє собою бівалентне або тетравалентне антитіло. На практиці користь від використання тетравалентного біспецифічного антитіла полягає в тому, що воно має більшу авідність в порівнянні з бівалентним антитілом через наявність двох сайтів зв'язування для кожної мішені. Аналогічно, для вибору функціональних фрагментів антитіла, описаного вище, вказану другу структуру вибирають з фрагментів Fv, Fab, (Fab') 2, Fab', Fab'-ПЕГ, scFv, scFv-Fc і діател або будь-якої форми, тривалість існування якої була б збільшена. У ще одному іншому аспекті задачею винаходу є антитіло або один з його функціональних фрагментів за винаходом як лікарський засіб, переважно, гуманізоване антитіло, яке визначене раніше. В рамках даного опису під антитілом розуміють як антитіло, одержане із застосуванням визначеного вище способу за винаходом, так і антитіло, вибране з ідентифікованих антитіл, що одержали назви 1A6, 1A9, 2E11, 3C11 або також 3G7. Винахід також стосується фармацевтичної композиції, яка містить як активний інгредієнт сполуку, яка являє собою антитіло або один з його функціональних фрагментів за винаходом, переважно, з доданим фармацевтично прийнятним ексципієнтом і/або носієм. Більш конкретно, винахід охоплює композицію, яка містить як активний інгредієнт сполуку, яка являє собою антитіло, або один з його функціональних фрагментів, як наприклад описане вище або продуковане гібридомою I-3612, I-3613, I-3614, I-3615 або I-3616. Згідно з ще одним іншим втіленням даний винахід також стосується фармацевтичної композиції, описаної вище, яка додатково містить як комбінований продукт для одночасного, роздільного застосування або рознесеного в часі застосування хіміотерапевтичний агент, агент променевої терапії або антитіло. Під "одночасним застосуванням" розуміють введення обох сполук композиції за винаходом, які містяться в разовій і одній і тій самій фармацевтичній формі. Під "роздільним застосуванням" розуміють введення в один і той самий момент часу обох сполук композиції за винаходом, які містяться в окремих фармацевтичних формах. Під "рознесеним за часом застосуванням" розуміють послідовне введення обох сполук композиції за винаходом, кожна з яких міститься в окремій фармацевтичній формі. Під хіміотерапевтичним агентом розуміють будь-яку сполуку, що підпадає під визначення і список, показаний вище в даному описі і становить невід'ємну частину винаходу. У конкретному переважному втіленні вказана композиція як комбінований продукт за винаходом характеризується тим, що вказаний цитотоксичний агент зв'язаний хімічним зв'язком з вказаним антитілом для одночасного застосування. У конкретному переважному втіленні вказана композиція за винаходом характеризується 19 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тим, що вказаний цитотоксичний/цитостатичний агент вибраний з агентів, які інгібують або стабілізують веретено, переважно з вінорелбіну і/або вінфлуніну. З метою полегшення утворення зв'язку між вказаним цитотоксичним агентом і вказаним антитілом за винаходом між обома зв'язуваними сполуками особливо можуть бути введені спейсерні молекули, такі як поліалкіленгліколі, як наприклад поліетиленгліколь, або навіть амінокислоти або в іншому втіленні можуть бути використані активні похідні вказаних цитотоксичних агентів, в яких введені функціональні групи, здатні взаємодіяти з вказаним антитілом за винаходом. Ці методики поєднання добре відомі фахівцеві в даній галузі техніки і не будуть розкриті в даному описі. Винахід в іншому аспекті стосується композиції, яка характеризується тим, що щонайменше одне з вказаних антитіл або один з їх функціональних фрагментів являє собою кон'югат з клітинним токсином і/або радіоактивним елементом. Переважно, вказаним токсином є токсин з ентеробактерій, особливо екзотоксин A з Pseudomonas. Кон'югат токсину або радіоактивного елементу щонайменше з одним антитілом або одним з його функціональних фрагментів за винаходом призначений для позначення будь-яких засобів, за допомогою яких вказаний токсин або вказаний радіоактивний елемент можуть бути пов'язані щонайменше з одним вказаним антитілом, особливо за допомогою утворення ковалентного зв'язку між обома сполуками, з введенням або без введення зв'язуючої молекули. Інша форма зв'язування може полягати у застосуванні хелатної сполуки з іоном (ion chelator), що забезпечує нековалентне комплексоутворення, такої як, наприклад EDTA, DOTA або навіть комплекс типу 99m Tc. Також переважно, щоб вказане щонайменше одне антитіло, яке бере участь в утворенні вказаного кон'югата за винаходом, було вибране з його функціональних фрагментів, особливо фрагментів, відокремлених від їх Fc-компонента, таких як фрагменти scFv. Даний винахід додатково включає застосуваннякомпозиції за винаходом для виготовлення ліків. Задачею даного винаходу також є застосування антитіла, яке описане вище або навіть одержане згідно із способом за винаходом, також описаному вище, для приготування ліків, призначених для запобігання або лікування раку. Крім того, задачею даного винаходу є застосування антитіла, яке описане вище або навіть одержане згідно із способом за винаходом, і також описаному вище, для виготовлення ліків, призначених для інгібування стійкості пухлини до протипухлинного лікування у пацієнта в рамках запобігання і лікування раку у цього пацієнта. Переважно, вказаний рак являє собою рак стійкого типу, вибраний з раку товстої кишки, передміхурової залози, молочної залози, легені, яєчок або підшлункової залози. Згідно з іншим втіленням винаходу також заявлено застосування антитіла або одного з його функціональних фрагментів за винаходом для виготовлення ліків, призначених для специфічно направленої доставки біологічно активної сполуки до резистентних пухлин і/або пухлин, виявлених на пізній стадії. Мічені антитіла за винаходом або їх функціональні фрагменти, наприклад включають так звані імунокон'юговані антитіла, які можуть бути, наприклад кон'юговані з такими ферментами, як пероксидаза, лужна фосфатаза, α-D- галактозидаза, глюкозооксидаза, глюкоамілаза, карбоангідраза, ацетилхолінестераза, лізоцим, малатдегідрогеназа або глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа, або з такою молекулою, як біотин, дигоксигенін або 5-бромдезоксіуридин. З антитілами або їх функціональними фрагментами за винаходом також можуть бути кон'юговані флуоресцентні маркери, і вони особливо включають флюоресцеїн і його похідні, флюорохром, родамін і його похідні, GFP (зелений флюоресцентний білок), дансил, умбеліферон тощо. Такі кон'югати з антитілами за винаходом або їх функціональні фрагменти можуть бути одержані способами, відомими фахівцеві в даній галузі техніки. Вони (антитіла) можуть бути зв'язані з ферментами або флюоресцентними маркерами безпосередньо або через спейсерну групу або зв'язуючу групу, таку як поліальдегід, наприклад глутаровий альдегід, етилендіамінтетраоцтова кислота (EDTA), діетилентриамінпентаоцтова кислота (DPTA), або у присутності агентів поєднання, таких як періодат тощо. Кон'югати, які включають маркери флюоресцеїнового типу можуть бути одержані в результаті реакції з ізотіоціанатом. Інші кон'югати також можуть включати хемілюмінесцентні маркери, такі як люмінол і діоксетани, біолюмінесцентні маркери, такі як люцифераза і люциферин, або навіть радіоактивні маркери. Біологічно активна сполука розуміється для позначення в даному описі будь-якої сполуки, здатної до модуляції, особливо до інгібування активності клітин, зокрема їх ріст, їх проліферації, 20 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 генної транскрипції або трансляції. У даному описі фармацевтично прийнятний розчинник розуміється для позначення сполуки або комбінації сполук, які входять у фармацевтичну композицію, який не викликає побічних реакцій і який, наприклад може сприяти введенню активної сполуки(к), може збільшувати тривалість його існування і/або його ефективність в організмі, може підвищувати його розчинність в розчині або навіть може покращувати його збереження. Ці фармацевтично прийнятні носії загальновідомі і будуть адаптовані фахівцями в даній галузі техніки залежно від природи і способу введення вибраної активної сполуки(к). Переважно, ці сполуки будуть введені системно, зокрема внутрішньовенним шляхом, внутрішньом'язовим, інтрадермальним, внутрішньочеревинним або підшкірним шляхом, або перорально. Більш переважно, композиція, яка містить антитіла за винаходом, буде введена неодноразово, з рознесенням за часом. Способи їх введення, лікарські форми та оптимальні галенові форми можуть бути визначені відповідно до критеріїв, що звичайно приймаються на розгляд при встановленні лікування, адаптованого до пацієнта, як, наприклад, вік або маса тіла пацієнта, важкість його/її стану, переносимість лікування і відмічені побічні ефекти. Інші ознаки і переваги винаходу будуть очевидні з наступного опису у вигляді прикладів і графічних матеріалів, включаючи підписи, які наведені далі. І нарешті, згідно з останнім аспектом винаходу запропоноване застосування способу за винаходом для ідентифікації нових терапевтичних і/або діагностичних внутрішньо- або позаклітинних мішеней, залучених в явище стійкості. І нарешті, вказаний спосіб ідентифікації нових терапевтичних і/або діагностичних внутрішньо- або позаклітинних мішеней, залучених в явище стійкості, характеризується тим що він являє собою застосування описаного вище способу за винаходом з метою одержання моноклонального антитіла і подальшої ідентифікації сполуки, зокрема білка, що розпізнається вказаним моноклональним антитілом. Така ідентифікація сполуки, особливо білка, може бути проведена за будь-якою методикою, відомою фахівцеві в даній галузі техніки, такою як, наприклад імунопреципітація і/або імуноочищення клітинного лізату та ідентифікація білка з використанням методик вестернблотінгу у поєднанні із стандартними протеомними методиками. Підписи до графічних матеріалів і приклади, що йдуть далі, призначені для ілюстрації винаходу без обмеження яким-небудь чином його обсягу. Підписи до графічних матеріалів Фіг. 1: на Фіг. 1 проілюстрована зміна в часі об'єму пухлини після проведення потрійної терапії з використанням h4D5, 225 та 7C10 і показана поява стійкості до такого лікування. Фіг. 2: на Фіг. 2 проілюстрована, в першій ілюстративній формі, діаграма, яка пояснює втілення винаходу. 1. Відбір зразків контрольних пухлин, ділення на дві частини. 2. Толеризація мишей. Підготовка клітин для імунізації: лізат, клітинна суспензія тощо. Толеризація шляхом в/ч (внутрішньочеревинної) ін'єкції циклофосфаміду або іншого толеризуючого агента. 3. Предметні стекла для IHC(імуногістохімічного)-скринінгу. Заморожування або включення (у парафін) пухлин: підготовка предметних стекол для мічення = негативні контрольні предметні стекла. 4. Відбір зразків резистентних пухлин, ділення на дві частини. 5. Підготовка клітин для імунізації: лізат, клітинна суспензія тощо. 6. Заморожування або включення (у парафін) пухлин: підготовка предметних стекол для мічення = тестовані предметні стекла. 7. Відбір зразків контрольних пухлин. 8. Імунізація мишей: підготовка клітин з контрольних пухлин. 9. Контрольні IHC-предметні стекла. 10. Толеризація шляхом ін'єкції(й) імуносупресивного агента. 11. Відбір зразків сироваток для контролю відсутності відповіді на нативні клітини. 12. Відбір зразків резистентних пухлин. 13. Імунізація толеризованих мишей: підготовка клітин з резистентних пухлин. 14. Тестовані IHC-предметні стекла. 15. Відбір зразків сироваток для IHC-мічення пухлин порівняно з резистентними пухлинами. 16. Селекція гібридом: відсутність мічення на предметних стеклах з контрольними пухлинами, позитивне мічення на резистентних пухлинах (відсутність мічення на стромальних клітинах, мічення пухлинних клітин). 21 UA 102812 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 3: на Фіг. 3 також проілюстровано, але цього разу у вигляді діаграми втілення способу за винаходом. Фіг. 4: на Фіг. 4 проілюстрований профіль антитіл за винаходом на предметних стеклах типу "тканинного масиву", створених з пухлин, які використані для толеризації та імунізацій. Фіг. 5: на Фіг. 5 проілюстрована оцінка протипухлинної активності антитіл 1A6 та 2E11 в моделі ксенотрансплантанта товстої кишки HT29. Фіг. 6: на Фіг. 6 показані відповідні послідовності важких і легких ланцюгів антитіл 1A6, 1A9, 2E11, 3C11 та 3G7. Відповідні CDR виділені підкресленням і жирним шрифтом. Фіг. 7: на Фіг. 7 проілюстрована оцінка протипухлинної активності антитіла 2E11 в моделі ксенотрансплантанта підшлункової залози BxPC3. Приклад 1. Демонстрація стійкості пухлинних клітин A549 до потрійної терапії антитілами проти IGF-1R, EGFR та Her/2neu Проводили трансплантацію A549-клітин мишам. Після введення пухлини мишей піддавали лікуванню двічі в тиждень сумішшю, яка містить по 300 мкг кожного з наступних антитіл, тобто: h4D5 (герцетин, наданий ICR, Institut Claude Regaud, service pharmacie, 20-24, rue du Pont SaintPierre, 31052 Toulouse), 225 (ATCC № HB-8508) та 7C10. Не пізніше першого тижня лікування у деяких мишей можна спостерігати регресію пухлинного росту до повного зникнення пухлини. Лікування підтримують, не дивлячись на повну або часткову регресію пухлини. Згодом спостерігають повторну появу таких пухлин, не дивлячись на безперервність лікування, що показує утворення пухлин, стійких до потрійної терапії. На Фіг. 1 наведена ілюстрація прикладу, в якому продемонстрована пухлинна регресія до 15-ої доби і повторна поява пухлин, починаючи з 15-ої доби, яка вказує на розвиток стійкості. Приклад 2. Створення активних моноклональних антитіл, направлених проти антигену, залученого в стійкість до комбінованої терапії антитілами проти IGF-1R, EGFR та Her/2neu Проводили трансплантацію A549-клітин двом партіям з 10 мишей. Перша партія одержує кожні два тижні ін'єкції PBS (забуферений фосфатом фізіологічний розчин). Другу партію обробляють комбінацією антитіл (7C10, 225 та h4D5), направлених проти рецепторів IGF-1R, EGFR та Her/2neu, відповідно. Ця комбінація антитіл викликає пухлинну регресію, що призводить до зникнення цих пухлин у 60 % лікованих тварин. Не дивлячись на такий радикальних ефект, пухлини знову виникають у всіх тварин. 3 У тварин, оброблених PBS, A549-пухлини витягують, коли вони досягають 100-200 мм . Кожну їх цих пухлин ділять на дві частини: одну заморожують при низьких температурах з метою створення імуногістохімічних предметних стекол типу "тканинного масиву", іншу частину використовують для толеризації BALB/c мишей. Цю толеризацію виконують шляхом внутрішньочеревинної ін'єкції подрібненого гомогената клітин з пухлини з подальшим введенням циклофосфаміду, і її метою є повне викорінювання відповіді, направленої проти нелікованих "вихідних" A549-пухлин. Під час цього пухлинного рецидиву також збирають 3 пухлини, коли вони досягають об'єму 100-200 мм . Потім їх ділять на дві рівні частини. Одна частина буде заморожена при низьких температурах з метою створення імуногістохімічних предметних стекол типу "тканинного масиву", як описано вище для контрольних пухлин з використанням PBS. З другої частини буде приготований подрібнений гомогенат і використаний для імунізації мишей, толеризованих завчасно нелікованими A549-пухлинами. Для всіх цих мишей всі 3 одержані внутрішньочеревинні ін'єкції подрібнених гомогенатів пухлин, стійких до потрійної терапії, були посилені повним ад'ювантом Фрейнда для першої ін'єкції і неповним ад'ювантом Фрейнда для подальших ін'єкцій. Потім здійснюють злиття клітин і для одержаних в результаті цього злиття гібридом проводять скринінг із застосуванням імуногістохімічного аналізу на предметних стеклах типу "тканинного масиву", приготованих завчасно. Гібридоми, що секретують антитіла, які розпізнають резистентні тканини і не розпізнають ні пухлини з контрольної партії з PBS, ні ненативну A549-клітину, яка була використана для створення пухлини in vivo, клонують і заморожують. Потім антитіла продукуються в асцитичну рідину, їх очищують, повторно тестують імуногістохімічно, після чого тестують in vivo на клітинах, що експресують на поверхні структуру або антиген, які розпізнаються антитілами (ці клітини були відібрані завчасно з використанням FACSCAN-аналізу неінвазивної панелі пухлинних ліній, яка є для кожного антитіла). На Фіг. 4 показаний профіль антитіл, що утримуються. У наведеній нижче Таблиці 6 в цьому відношенні згруповані клітини, які розпізнаються цими антитілами (Розпізнавання антитіл, вибраних за (даними) гістології з використанням пристрою FACSCAN, різних клітинних ліній). 22 UA 102812 C2 Таблиця 6 Гібридома 1A6 1A9 2E11 2E11 3C11 3G7 5 10 15 20 25 30 Клон C7 D10 E11 F1 A2 B11 A8 B9 E8 E9 A7 B2 Ізотип IgM k IgG1 k IgG1 k IgG1 k IgM k IgM In vivo модель MCF7/Colo205 LnCap/HT29 HepG2/H69/LnCap Ht29/BxPC3/H69 Ht29/BxPC3/H69 Colo205 DU145 Приклад 3. Оцінка протипухлинної активності антитіл, створених згідно з винаходом, (більш конкретно 1A6 та 2E11) в моделі ксенотрансплантанта прямої кишки HT29 . 6 5 10 клітин HT29 трансплантують мишам "Swiss-Nude". Через п'ять діб після трансплантації пухлини стають вимірними, і мишей розділяють на три партії по шість мишей з пухлинами однорідного вигляду. Мишей піддають лікуванню з використанням або PBS (негативний контроль), або 0,5 мг антитіла 1A6 або 2E11 три рази в тиждень (ін'єкція першої дози для презентації: 1 мг/миша). Контроль об'єму пухлини здійснюють двічі в тиждень, беручи до уваги, що об'єм пухлини звичайно підраховують згідно з наступною формулою: (π/6)x(l)x(L)x(e), де l = виміряна ширина, L = виміряна довжина та e = виміряна товщина. Результати проілюстровані на Фіг. 5. HT29-клітини можуть розглядатися як клітини агресивного фенотипу. Одержані результати демонструють можливість використання антитіл безпосередньо проти антигенів пухлинних клітин, що походять з пухлини, лікованої протипухлинною композицією (див. Приклад 2) і до того ж стійкою, як протипухлинна сполука для лікування пухлин з агресивним фенотипом. Результати, одержані в цьому експерименті, підтверджують правильність даного оригінального підходу створення антитіл і концепції створення антитіл для терапевтичної мети на основі індукованої у мишей стійкості. Цей спосіб можна застосувати до будь-якої іншої комбінації лікарських засобів, включаючи хіміотерапевтичні лікарські засоби або окремо, або в комбінації один з одним або з антитілами, або з інгібіторами тирозинкінази, або з протеасомними інгібіторами, діючи таким саме чином. Приклад 4. Оцінка протипухлинної активності антитіла 2E11, створеного згідно з винаходом, в моделі ксенотрансплантанта підшлункової залози BxPC3 . 6 10 10 клітин BxPC3 трансплантують бестимусним "голим" мишам. Через п'ять діб після трансплантації пухлини стають вимірними, і мишей розділяють на дві партії по шість мишей з пухлинами однорідного вигляду. Потім мишей піддають лікуванню або PBS (негативний контроль), або антитілом 2E11 (1 мг/доза), двічі в тиждень. Контроль об'єму пухлини здійснюють двічі в тиждень. Результати проілюстровані на Фіг. 7. Результати, одержані в цьому експерименті, обгрунтовують функціональну активність антитіла 2E11, а також концепцію створення антитіл для терапевтичної мети на основі індукованої у мишей стійкості. 35 23 UA 102812 C2 24 UA 102812 C2 25 UA 102812 C2 26 UA 102812 C2 27 UA 102812 C2 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMethod for generating active antibodies against a resistance antigen, antibodies obtained by said method and their uses
Автори англійськоюGoetsch, Liliane, Jouhanneaud, Alexandra
Назва патенту російськоюСпособ генерирования активных антител к антигену устойчивости, антитела, полученные этим способом, и их применение
Автори російськоюГетш Лилиан, Жуанно Александра
МПК / Мітки
МПК: G01N 33/577, A61K 39/395, C12P 21/08, A61P 35/00, C12N 5/20, C12N 15/13, C07K 16/30
Мітки: одержані, активних, застосування, антигену, генерування, цим, антитіла, стійкості, антитіл, спосіб, способом
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/53-102812-sposib-generuvannya-aktivnikh-antitil-do-antigenu-stijjkosti-antitila-oderzhani-cim-sposobom-ta-kh-zastosuvannya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб генерування активних антитіл до антигену стійкості, антитіла, одержані цим способом, та їх застосування</a>
Спосіб виготовлення біологічно активних кормових добавок на основі ехінацеї пурпурової і кормові добавки, одержані вищезазначеним способом
Номер патенту: 55979
Опубліковано: 15.04.2003
Автори: Бегма Дарія Анатоліївна, Гордієнко Петро Валентинович, Ковальчук Оксана Федорівна, Буркат Валерій Петрович, БЕГМА Анатолій Андрійович, Романчук Віктор Станіславович, Бородай Віра Віталіївна
Мітки: способом, добавок, добавки, пурпурової, ехінацеї, основі, вищезазначеним, активних, біологічно, кормові, кормових, одержані, виготовлення, спосіб
Формула / Реферат:
1. Спосіб виготовлення біологічно активних кормових добавок шляхом рівномірного змішування рідкого екстракту ехінацеї пурпурової з субстратом для адсорбції її біологічно активних речовин, подальшою сферонізацією та висушуванням, який відрізняється тим, що субстратом для адсорбції використовують мікроцелюлозу ретельно подрібненої сухої трави ехінацеї пурпурової.2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що крім ехінацеї пурпурової в...
Тест-система імуноферментна “dia-hbcore-igg-igm” для визначення антитіл класів igg ta igm до корового антигену вірусу гепатиту в
Номер патенту: 72506
Опубліковано: 27.08.2012
Автори: СОФРОНОВ АНДРІЙ ІВАНОВИЧ, Коршун Людмила Миколаївна, Кисельова Олена Костянтинівна, Ганова Лариса Олександрівна, Гураль Анатолій Леонтіївич, Мойса Лариса Миколіївна, Троянський Василь Васильович, Міхалап Світлана Віталіївна, Вудмаска Марія Іванівна, Семиноженко Володимир Петрович, Горлов Юрій Іванович, Сердюк Володимир Григорович, Терещенко Михайло Іванович, Іванська Наіля Валєєвна
МПК: A61K 39/29, G01N 33/53
Мітки: dia-hbcore-igg-igm, корового, антигену, визначення, антитіл, тест-система, гепатиту, вірусу, класів, імуноферментна
Формула / Реферат:
Тест-система імуноферментна для визначення антитіл класів IgG та IgM до корового білка вірусу гепатиту В, в якій використовується імуносорбент, в лунки якого внесено рекомбінантний поліпептид core - аналог антигену вірусу гепатиту В і кон'югат, яка відрізняється тим, що в складі кон'югатів використовуються моноклональні антитіла проти IgG та IgM людини, мічені ферментом, а як проявник - однокомпонентний розчин хромогену.
Спосіб очищення кремнієвмісного матеріалу низької чистоти, застосування барабанної печі у ньому, розплав кремнієвмісного матеріалу, відхідні гази та твердий полікристалічний кремній, одержані цим способом
Номер патенту: 97488
Опубліковано: 27.02.2012
Автори: Леблан Домінік, Буасвер Рене
МПК: C01B 33/037, C01B 33/02, C30B 29/06, F27B 7/06
Мітки: ньому, кремнієвмісного, матеріалу, розплав, спосіб, газі, низької, кремній, печі, очищення, способом, одержані, цим, твердий, чистоти, застосування, відхідні, полікристалічний, барабанної
Формула / Реферат:
1. Спосіб очищення кремнієвмісного матеріалу низької чистоти, який включає етапи, на яких:(a) забезпечують плавильний пристрій, обладнаний кисневим пальником, і(b) в цьому плавильному пристрої плавлять кремнієвмісний матеріал низької чистоти з одержанням розплаву кремнієвмісного матеріалу більш високої чистоти.2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що плавильний пристрій з етапу (а) включає в себе барабанну...
Тест-система імуноферментна для одночасного виявлення антигену р24 вірусу імунодефіциту людини першого та другого типів (віл- 1/2) та анти-віл антитіл (dia-hiv1/2-ag/at)
Номер патенту: 68845
Опубліковано: 16.08.2004
Автори: Ліщенко Людмила Петрівна, Терещенко Михайло Іванович, Ніколаєнко Ігор Васильович, Раєвська Галина Євгенівна, Пилипенко Віталій Григорович, Шевчук Олександр Анатолійович, Іванська Наіля Валєєвна, Костенко Оксана Георгіївна, Семиноженко Володимир Петрович, Гураль Анатолій Леонтійович, Касьяненко Тетяна Вальтерівна, Троянський Василь Васильович, Горлов Юрій Іванович
МПК: A61K 39/21
Мітки: виявлення, першого, одночасного, віл, людини, анти-віл, другого, типів, імуноферментна, вірусу, імунодефіциту, антитіл, антигену, тест-система
Формула / Реферат:
Тест-система імуноферментна для одночасного виявлення антигену р24 вірусу імунодефіциту людини першого та другого типів (ВІЛ-1/2) та анти-ВІЛ антитіл (DIA-HIVl/2-Ag/AT), в якій на полістироловий планшет сорбовані антитіла проти антигену р24 ВІЛ та очищені ВІЛ-1 і ВІЛ-2 антигени, а як кон'югат використовують біотинільовані анти-ВІЛ-1 антитіла та стрептавідин, зв'язаний з пероксидазою, яка відрізняється тим, що імуносорбент включає...
Тест-система для одночасного виявлення антигену р24 вірусу імунодефіциту людини першого та другого типів (віл 1/2) та анти-віл антитіл “dia-hiv 1/2-ag /ab-biotin”
Номер патенту: 72004
Опубліковано: 10.08.2012
Автори: Мельник Анатолій Іванович, Семиноженко Володимир Петрович, Мойса Лариса Миколаївна, Трохимчук Тетяна Юріївна, СОФРОНОВ АНДРІЙ ІВАНОВИЧ, Вудмаска Марія Іванівна, Іванська Наіля Валєєвна, Співак Микола Якович, Терещенко Михайло Іванович, Ганова Лариса Олександрівна, Сердюк Володимир Григорович, Коршун Людмила Миколаївна, Шевчук Олександр Анатолійович, Міхалап Світлана Віталіївна, Горлов Юрій Іванович
МПК: A61K 39/00
Мітки: людини, віл, антигену, імунодефіциту, другого, вірусу, тест-система, першого, dia-hiv, ab-biotin, виявлення, анти-віл, одночасного, типів, антитіл
Формула / Реферат:
Тест-система для одночасного виявлення антигену р24 вірусу імунодефіциту людини першого та другого типів (ВІЛ ½) та анти-ВІЛ антитіл "DIA-HIV Vi-Ag/Ab-biotin," в якій на полістироловий планшет сорбовані антитіла проти антигену р24 ВІЛ-1 та очищені ВІЛ-1 і ВІЛ-2 антигени, а як кон'югат використовують біотинільованої анти-ВІЛ-1-антитіла та стрептавідин, зв'язаний з пероксидазою, яка відрізняється тим, що імуносорбент...
Попередній патент: Протимікробні міцели для застосування у харчових продуктах
Наступний патент: Пігментний концентрат
Випадковий патент: Ваговимірювальний датчик