Сполука 5-(2-(2-(2-гідроксибензоїл)гідразоно)етилтіо)-3-феніл-1н-1,2,4-триазол-1-іум хлорид, що проявляє нейропротекторну активність

Реферат: Винахід належить до 5-(2-(2-(2-гідроксибензоїл)гідразоно)етилтіо)-3-феніл-1Н-1,2,4-тріазол-1іуму хлориду. Заявлена сполука демонструє виражений нейротропний ефект: здатність підвищувати виживаність тварин в умовах гострого порушення мозкового кровообігу; здатність UA 100043 C2 (12) UA 100043 C2 впливати на вміст аденілових нуклеотидів, а саме підвищувати рівень АДФ, АТФ, АМФ та знижувати рівень ВВ-КФК; впливати на показники вуглеводного обміну в головному мозку, а саме підвищувати рівень пірувату та знижувати рівень лактату і малату; впливати на показники окислювальної модифікації білка в головному мозку на фоні ГПМК, а саме знижувати рівень продуктів окислювальної модифікації білка АФГ та КФГ; впливати на активність антиоксидантних ферментів, а саме підвищувати активність СОД, каталази, ГПР, та вміст альфа-токоферолу. CH3 O O H2 CH3 H2 H2 H2 CH3 H3C C C C C C (H2C2) C H H CH O 3 CH3 CH3 UA 100043 C2 5 10 15 Винахід стосується фармацевтичної хімії і медицини та може бути використаний у створенні нових біологічно активних сполук, а також оригінальних лікарських засобів у ряді похідних 3-тіо1,2,4-триазолу, і застосований для лікування ішемічних порушень функції головного мозку. В умовах ішемії головного мозку активні форми кисню (АФК), за допомогою активації редокси-чутливих каскадів синтезу чинників ядерної транскрипції білка, підсилюють експресію прозапальних цитокінів, беруть участь у формуванні локального запального осередку в головному мозку, тим самим, підсилюючи явища набряку, головного мозку, ініціюють явища апоптозу і некрозу. Найбільш близькими структурними аналогами речовин, що заявляються, є 4-метил-1,2,4триазол-3-тіон, 4-феніл-1,2,4-триазол-3-тіон, 4-(2-толіл)-1,2,4-триазол-3-тіон, 4-(2метоксифеніл)-1,2,4-триазол-3-тіон, 5-(4-нітрофеніл)-4-феніл-1,2,4-триазол-3-тіон, 5-(4нітрофеніл)-4-(2-метоксифеніл)-1,2,4-триазол-3-тіон, 5-(фуран-2-іл)-4-(2-толіл)-1,2,4-триазол-3тіон, 5-(фуран-2-іл)-4-(3-толіл)-1,2,4-триазол-3-тіон, 5-(фуран-2-іл)-4-(2-метоксифеніл)-1,2,4триазол-3-тіон, що мають антиоксидантну активність (Пат. України № 43771; Заявл. 27.04.2009; Опубл. 25.08.2009, Бюл. № 16.) Прототипом для речовини, що заявляється, є токоферолу ацетат (вітамін Е), що виявляє нейропротективну дію (нейропротектор антиоксидантного типу) (Машковский М.Д. Лекарственные средства. - X.: Торсинг, 1998. - Т. 2.-592 с. (С. 95-96)) і має формулу: O H3C CH3 O H2 C O 20 25 30 35 CH3 H2 C H2 C CH3 C H H2 C (H2C2) CH3 CH3 C H CH 3 . Токоферолу ацетат, хоча і має нейропротективну дію, однак не є основним засобом, що застосовується при ішемічних ушкодженнях мозку. Крім того, даний препарат обмежено застосовують для лікування осіб, хворих на тяжкий кардіосклероз чи інфаркт міокарда. Суттєві ознаки прототипу і винаходу, що збігаються, є такі: - наявність в структурі циклічних органічних фрагментів ароматичного і гетероциклічного характеру; - молекули даних речовин містять атоми вуглецю, що мають ступінь окислення -3,-2 і -1. В основу винаходу поставлено задачу створення нових біологічно активних сполук, що можуть знайти своє застосування як оригінальні лікарські засоби в ряду похідних 3-тіо-1,2,4триазолу і проявляють нейропротекторну активність у порівнянні з контролем. Поставлена задача вирішується тим, що 5-(2-(2-(2-гідроксибензоїл)гідразоно)етилтіо)-3феніл-1Н-1,2,4-триазол-1-іум хлорид містить в положенні 5 ядра 1,2,4-триазолу фенільний радикал, а також має в своєму складі двовалентний атом сірки, азометинову групу і залишок гідразиду саліцилової кислоти і має формулу: + H N H N N C N H H2 C S Cl NH C O OH . 40 45 Така структура сполуки забезпечує виражений нейротропний ефект: здатність підвищувати виживаність тварин в умовах гострого порушення мозкового кровообігу; здатність впливати на вміст аденілових нуклеотидів, а саме підвищувати рівень АДФ, АТФ, АМФ та знижувати рівень ВВ-КФК; впливати на показники вуглеводного обміну в головному мозку, а саме підвищувати рівень пірувату та знижувати рівень лактату і малату; впливати на показники окислювальної модифікації білка в головному мозку на фоні ГПМК, а саме знижувати рівень продуктів окислювальної модифікації білка АФГ та КФГ; впливати на активність антиоксидантних ферментів, а саме підвищувати активність СОД, каталази, ГПР, та вміст альфа-токоферолу. Нейропротективну активність вивчали на білих щурах лінії Вістар обох статей, масою 150200 г. Всі тварини утримувалися на стандартному раціоні харчування віварію, при природній 1 UA 100043 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зміні дня і ночі. Щури отримані з інституту фармакології і токсикології АМН України. Всі експериментальні процедури і оперативні втручання здійснювали відповідно до "Положення про використання тварин в біомедичних дослідженнях" [Стефанов О.В. Доклінічні дослідження лікарських засобів (методичні рекомендації) // Київ: "Авіцена", 2002.-527 с.]. Двобічну перев'язку загальних сонних артерій виконували під етамінал-натрієвим наркозом (40 мг/кг), з використанням хірургічного доступу шляхом виділення сонних артерій і одномоментного накладення на них шовкової лігатури [Стефанов О.В. Доклінічні дослідження лікарських засобів (методичні рекомендації) // Київ: "Авіцена", 2002.-527 с.]. Двобічна перев'язка загальних сонних артерій спричиняла тяжкі неврологічні зміни у тварин: паралічі, парези, птоз, з максимальним проявом через 4 доби. Так, в ці терміни спостереження в групі нелікованих тварин середній бал за шкалою C.P. mcgrow складав 17,66 балу, що відповідає тяжкому ступеню неврологічної симптоматики (таблиця. 1). Для вивчення дії препаратів окремим групам тварин вводили внутрішньочеревно сполуку, що заявляється в дозі 50 мг/кг, одну групу залишали для контролю. З метою вивчення результатів фармакокорекції, у експериментальних тварин через 4 доби після операції забирався головний мозок. Для біохімічних досліджень використовувалися лобові долі кори. Для біохімічних досліджень тканини мозку гомогенізувалися на холоді, в сольовому ізотонічному середовищі (0,15 М КСl) при температурі +4 °C, за допомогою скляного гомогенізатора, в співвідношенні тканина - сольовий розчин 1:40. Після чого методом диференціального центрифугування виділялася цитозольна фракція (15000 g). Екстракцію ліпідів проводили по методу Кейтса [Прохорова М.И. Современные методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) - Л.: Изд-во Ленинградского университета.1982.-272 с.]. Безбілковий екстракт отримували додаванням точної навіски гомогенату тканини мозку в хлорну кислоту (0,6 М) із подальшою нейтралізацією 5,0 М розчином калію карбонату. Стан антиоксидантної системи оцінювали по активності СОД, каталази, ГПР, рівню токоферолу, показникам окислювальної модифікації білка в тканинах головного мозку [Прохорова М.И. Современные методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) - Л.: Изд-во Ленинградского университета.-1982.-272 с.; Чевари Сюб Чаба И., Секей И. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах в клетки и метод определения ее в биологических материалах // Лаб. дело.-1988. - № 11. - С. 678-681.; Захарова Н.Б., Рубин В.И. Тонкослойная хромотография нуклеотидов эритроцитов на пластинках "Силуфол" // Лаб. дело.-1980. - № 12. - С. 735-738]. Результати наведені в табл. 5. Стан вуглеводно-енергетичного обміну визначали по рівню найбільш важливих интермедіантів - АТФ, АДФ, АМФ. Про ішемічне пошкодження тканин головного мозку судили по гіперферментомії креатинфосфокінази (ВВ-КФК) [Захарова Н.Б., Рубин В.И. Тонкослойная хромотография нуклеотидов эритроцитов на пластинках "Силуфол" // Лаб. дело.-1980. - № 12. С. 735-738]. Результати наведені в табл. 2. Важливими показниками вуглеводного обміну є рівень пірувату, лактату і малату (табл. 2). Визначення активності СОД проводили по методиці, описаній Чеварі із співавторами. СОД конкурує з нітросинім тетрозолієм (НСТ) за супероксидрадикали, що утворюються в внаслідок аеробної взаємодії НАДН і феназинметасульфату (ФМС). Внаслідок цієї реакції НСТ відновлюється до гідразинтетразолію. У присутності СОД відсоток відновлення НСТ змінюється. Активність СОД виражали в у.о./мг білка/хв. Результати наведені в табл. 5. Активність каталази визначали спектрофотометрично. Каталаза, що знаходиться в пробі, розкладає гідроген пероксид, залишок пероксиду визначали по реакції з амонію молібдатом. Активність ферменту оцінювали за мірою розкладання водню пероксиду. Активність каталази виражали в мкат/мг білка/хв. Результати наведені в табл. 5. Активність глутатіонпероксидази (ГПР) визначали по методиці. ГПР відновлює за допомогою глутатіону відновленого (FSH) гідроперекис терт-бутилу. Залишок відновленого терт-бутилу визначали по інтенсивності забарвлення з натрій нітропрусидом, що має максимум поглинання при довжині хвилі 540 нм. Активність ГПР оцінювали по спаду FSH. Активність ГПР виражали в мкмоль FSH/мг білка/хв. Результати наведені в табл. 5. 3+ 2+ Вміст ос-токоферолу визначали спектрофотометрично, -токоферол відновлює Fe до Fe 2+ в еквівалентному співвідношенні. Fe , що утворився, утворює забарвлений комплекс ,'дипіридилом, з максимумом поглинання при довжині хвилі 540 нм. Вміст -токоферолу виражали в мкм/г тканини. Результати наведені в табл. 5. Показники окислювальної модифікації білка в тканинах головного мозку визначали по методу В. Halliwell [Halliwell В. Molecular Biology of free Radicals in Human Diseases. - London: St. Lucia: OICA, 1999.-410 p.]. При взаємодії окислених амінокислотних залишків з 2,4 2 UA 100043 C2 5 10 15 динітрофенілгідразином (2,4-ДНФГ) утворюються 2,4-динітрофенілгідразони - альдегідні і карбоксильні угрупування амінокислотних залишків. Для альдегідфенілгідразонів спектр поглинання зареєстрований при довжині хвилі 274 нм, а для карбоксилфенілгідразону - при 363 нм. При спектрі хвиль 254, 272 і 280 нм визначали відповідно крупні, середні та дрібні фрагменти - ступінь дефрагментації білка. Активність ВВ-КФК визначали після поділу, на сефадексі ДЕАЕ-А-50 по оптичному тесту Варбурга. Принцип методу: креатинфосфокіназа КФК каталізує наступну реакцію: креатинфосфат + АДФ креатин + АТФ. Креатин, що утворюється в процесі реакції, може бути визначений по реакції з -нафтолом. Активність ферменту прямо пропорційна креатину, що утворився. Активність ВВ - КФК виражали в мкм/л/год. Результати наведені в табл. 4. Неврологічний дефіцит у тварин визначали за шкалою stroke-index С.P. McGrow. Важкість стану визначали по сумі відповідних балів: до 3 балів - легкий ступінь, з 3 до 7 балів - середній ступінь і з 7 балів і вище - тяжкий ступінь. Відзначали парези, паралічі кінцівок, тремор, манежні рухи, птоз, положення на боці, рухливість як прояв неврологічного дефіциту розглядали утримування щурів на стрижні, що обертався, діаметром 15 см (швидкість 3 об/хв). Тварин тестували щодня, виставляючи суму балів [McGrow С.Р. Experimental Cerebral Infarction Effects of Pentobarbital in Mongolian Gerbils // Arch. Neurol.-1977. - Vol.34, № 6. - P. 334-336]. Статистичну обробку даних проводили параметричним критерієм t-Стьюдента за допомогою програми "Biostat" і MS Excell. 20 Таблиця 1 Вплив сполуки, що заявляється, на виживаність і розвиток неврологічного дефіциту тварин в різні терміни після ГПМК Група тварин Контроль (ГПМК) Сполука Середній бал за шкалою С.Р. McGrow Через 24 Через 48 Через 72 4-а доба години годин години К-ть тварин, що вижили, на 4-у добу % 16,5±1,32 17,0±1,59 19,12±0,52 16,66±1,02 32 13,55±2,02 11,5±2,18 9,2±0,67 9,8±0,3 54 Примітка: * - р