2-(морфолін-4-іл)хіназолін-4(3н)-тіону, що проявляє нейропротекторну активність

Сполука 2-(морфолін-4-іл)хіназолін-4(3H)тіону, 3 64800 головного мозку, морфофункціональний стан нейронів IV-V шарів кори головного мозку щурів з ГПМК. Тварини були розділені на 4 експериментальних групи по 20 тварин у кожній. Перша група несправжньооперовані (інтактні) тварини, друга тварини з ГПМК (контрольна), третя - тварини з ГПМК, яким вводили сполуку NC-224(25 мг/кг), четверта - тварини з ГПМК, яким вводили пірацетам (500 мг/кг). Введення сполук проводили внутрішньоочеревинно, одразу після наркозу та один раз на добу впродовж 4 (гострий період ішемії) та 18 діб (відновлювальний період). Щоденно впродовж 18 діб визначали виразність неврологічного дефіциту за шкалою McGrow [2] (табл. 1). Біохімічні дослідження проводили на 4 добу від початку експерименту. Визначали вміст продуктів окислювальної модифікації білків (ОМБ) за рівнем альдегідних (АФГ) і карбоксильних (КФГ) продуктів в реакції з 2,4-динітрофенілгідразином [5]. Також визначали вміст дієнових кон'югатів (ДК), триєнкетонів (ТК) і малонового диальдегіду (МДА) [6]. Стан АО-системи визначали за активністю глутатіонпероксидази (ГПР) в тканині мозку [2] (табл. 2). 4 Для вивчення морфофункціонального стану нейронів IV-V шарів кори головного мозку проводили морфометричний аналіз клітин мозку у автоматичному режимі за допомогою макропрограми, яка розроблена у спеціалізованому середовищі програмування VIDAS-2,5 [1]. Визначали концентрацію РНК у нейронах за [7] (табл. З, 4). Приклади конкретного виконання. Приклад 1. Синтез 2-(морфолін-4-іл)хіназолін-4(3H)-тіону (NC-224). Сполука NC-224 отримана шляхом взаємодії 2-(морфолін-4-іл)хіназолін-4(3H)-ону (І) з пентасульфідом фосфору (II) у ксилолі за схемою 1: До розчину 17,2 г (0,074 М) 2-(морфолін-4іл)хіназолін-4(3H)-ону (І) у 150 мл ксилолу додають 16,44 г (0,074 М) пентасульфіду фосфору (II), перемішують і кип'ятять протягом 9 годин. Розчинник видаляють у вакуумі. До сухого залишку додають 100 мл 10 % розчину натрію гідроксиду і доводять до кипіння, додають 20 г активованого вугілля, кип'ятять 5 хвилин і фільтрують. Охолоджують, підкислюють хлороводневою кислотою до pH 5-6. Утворений осад відфільтровують. Сушать. Кристалізують із суміші пропанол-вода (1:2). Схема 1 O N N O P2S5 (II) N NH NH O I 2-(Морфолін-4-іл)хіназолін-4(ЗН)-тіон – C12H13N3OS(NC-224) - продукт являє собою жовту кристалічну речовину, яка розчинна у воді, спиртах, діоксані, ДМФА, розчинах гідроксидів лужних металів та мінеральних кислот. Вихід 86,5 % з температурою плавлення 203-205 °C, молекулярною масою 247D. Будову та ідентичність синтезованої сполуки доводили за допомогою елементного аналізу, тонкошарової хроматографії, ІЧта ПМР1 спектроскопії. Н NMR:  = 3.68 (с, 8Н, морфоліл), 7.22 (т, 1Н, J=7.7, Н-6), 7.34 (д, 1Н, J=7.9, Н-8), 7.64 (т, 1Н, J=7.7, Н-7), 8.41 (д, 1Н, J=7.9, Н-5), + 12.28 (уш.с, 1Н, 3-NH3); LC-MS, m/z=248([М+1] ). N S NC-224 Емпірична формула C12H13N3OS: С, 58; Н, 5.30;N, 16.99;S, 12,96. Знайдено: С, 58.26; Н, 5.26;N, 16.97;S, 12,95. Приклад 2. Вивчення нейропротекторної активності 2(морфолін-4-іл)хіназолін-4(3H)-тіону (C12H13N3OS). Введення щурам з ГПМК як NC-224, так і пірацетаму призводило до нейропротекторного ефекту - зменшення летальності та розвитку неврологічного дефіциту: вірогідно знижувался середній бал за шкалою С. Р. McGrow при застосуванні сполуки NC-224, як на 4 добу, так і на 18 добу; летальність знижувалась в 2 рази у порівнянні з контролем (вижило 60 % тварин), більше, ніж при застосуванні пірацетаму (табл.1). Таблиця 1 Вплив сполук на виживання тварин та розвиток неврологічного дефіциту після ГПМК Кількість тварин, що вижили, Групи тварин Середній бал за шкалою С. Р. McGrow % 4 доба 18 доба Несправжньооперовані тва0,88±0,11 0,00±0,00 100 рини Тварини з ГПМК (контроль) 19,7±2,15 7,3±0,77 30* Тварини з ГПМК + пірацетам 15,8±2,80 5,6±0,72 50 Тварини з ГПМК + NC-224 11.0±1,00** 3,0±0,25** 60** Примітка: * - р < 0,05 відносно несправжньооперованих тварин; ** - р < 0,05 відносно контролю. 5 64800 При застосуванні NC-224 і пірацетаму відбувалося зниження кількості продуктів ОМБ (АФГ, КФГ), значень біохімічних показників (МДА, ТК, ДК) у тканинах головного мозку з ГПМК, в той час коли активність ферменту антиоксидантного захисту 6 ГПР збільшувалась. Тобто, сполука NC-224 як і пірацетам за умов експерименту інгібували різні ланки оксидативного стресу, а за силою антиоксидантної дії сполука NC-224 перевершувала дію пірацетаму (табл.2). Таблиця 2 Вплив сполук на показники антиоксидантної системи в мозку щурів на 4 добу ГПМК Показники Тварини з Несправжньооперовані Тварини з ГПМК Тварини з ГПМК + піГПМК (конттварини + NC-224 рацетам роль) Продукти ОМБ, АФГ 0,87±0,07 5,77±0,50 2,75±0,50** 4,87±0,70 ум.од./г білку Продукти ОМБ, КФГ 0,62±0,07 4,21±0,50 2,11±0,20** 3,25±0,30 ум.од./г.білку ГПР, мкмоль/мг білку/хв. 78,4±3,80 31,1+1,90 65,00±2,10** 34,5±3,10 ТК, мкмоль/г тканини 0,44±0,071,41+0,11 0,84±0,05** 1,27±0,07 ДК, мкмоль/г тканини 1,23±0,08 2,57±0,11 2,00±0,11** 1,12±0,02** МДА, мкмоль/г тканини 0,52±0,07 1,37±0,03 0,83±0,02** 1,12±0,02** Примітка: *- р  0,05 по відношенню до несправжньооперованих тварин; ** - р  0,05 по відношенню до контролю. Терапія тварин з ГПМК NC-224 і пірацетамом призводила до покращення морфофункціонального стану клітин кори головного мозку (збільшення щільності нейронів, підвищення вмісту РНК), а дія сполуки NC-224 перевершувала дію пірацетаму. Таблиця 3 Характеристика нейронів IV-V шарів кори головного мозку щурів з експериментальною ішемією Щільність нейронів Площа тіл нейронів Вміст РНК у нейронах 2 2 (клітин/мм ) (мкм ) (ЕОП) 4-а доба 18-а доба 4-а доба 18-а доба 4-а доба 18-а доба Несправжньооперовані 1281±34 1292±31 75,21±1,12 74,87±1,32 9,69±0,15 9,72±0,14 Тварини з ГПМК (контроль) 1065±27* 1082±19* 63,15±0,90* 63,12±0,80* 5,4±0,20* 5,50±0,60* Тварини з ГПМК + піраце1060±38 1163±26* 63,46±0,8 68,71±0,93** 5,73±0,18 8,03±0,23** там Тварини з ГПМК+NC-224 1108±21** 1233±28** 69,97±0,80** 72,12±0,90** 6,87±0,15** 8,91±0,21** Примітка:* - р  0,05 по відношенню до інтактних тварин; ** - р  0,05 по відношенню до контролю. Експериментальні групи Застосування як NC-224, так і пірацетаму вірогідно знижувало кількість деструктивно й апоптично змінених нейронів в корі мозку щурів з ГПМК. При цьому, сполука NC-224 виявляла дію вже у гострий період ішемії (4 доба), тоді як пірацетам - лише на 18 добу (табл.4). Таблиця 4 Щільність апоптичних і деструктивно змінених клітин IV-V шарів кори головного мозку щурів з експериментальною ішемією Відносна апоптич- кількість деструктиЕкспериментальні групи Щільність клітин (клітини / мм) них і змінених вно клітин (%) 4-а доба 18-а доба 4-а доба 18-а доба Несправжньооперовані 52±9 53±7 2,5±0,1 2,8±0,2 Тварини з ГПМК (контроль) 394±18* 287±18* 18,45±0,80* 14,36±0,70* Тварини з ГПМК+ пірацетам 438±29* 153±18** 16,3±1,7 7,40±0,50** Тварини з ГПМК +NC-224 15717** 11712** 8,700,40** 5,300,40** Таким чином, за досліджуваними показниками дія сполуки NC-224 перевершує нейропротекторну дію пірацетаму. Джерела інформації: 1.Halliwell В. Molecular Biology of free Radicals in Human Diseases. - London:St.Lucia:OICA, 1999.410p. 7 2.McGrow С. Р. Experimental Cerebral Infarction Effects of Pentobarbital in Mongolian Gerbils // Arch.Neurol.-1977. - V.34,N 6. - P.334-336. 3. Руководство по доклиническому изучению лекарственных средств / Под редакцией чл.-корр. АМН Украины Стефанова А. В. - Киев: "Авиценна", 2001.-426 с. 4. Бєленічев І. Ф., Бухтіярова Н. В., Громов Л. О. Експериметальні моделі ішемії головного мозку Комп’ютерна верстка І. Скворцова 64800 8 у фармакологічних дослідженнях // Ліки.-2006. - № 3,4. – С11–19. 5. Гусев Е. И., Скворцова В. И. Ишемия головного мозга. - М.Медицина, 2001.-328 с. 6. Андреева Л. И., Кожемякин Л. А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело.-1988.-№ 11.-С. 41-46. 7. Пирс Э. Гистохимия. - Москва, 1962.-962 с. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601