Спосіб комплексного хроматографічного встановлення наявних рослинних жирів в молокопродуктах

УКРАЇНА (19) UA (11) 102548 (13) C2 (51) МПК G01N 33/03 (2006.01) G01N 33/04 (2006.01) G01N 33/06 (2006.01) ДЕРЖАВНА СЛУЖБА ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ УКРАЇНИ ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (21) (22) (24) Номер заявки: Дата, з якої є чинними права на винахід: 25.07.2013 (41) Публікація відомостей про заявку: 25.06.2012, Бюл.№ 12 (46) Публікація відомостей про видачу патенту: 25.07.2013, Бюл.№ 14 (72) Винахідник(и): Чмиленко Федір Олександрович (UA), Дронь Микола Михайлович (UA), Сидорова Лариса Петрівна (UA), Мінаєва Наталія Петрівна (UA) (73) Власник(и): ДНІПРОПЕТРОВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ОЛЕСЯ ГОНЧАРА, пр. Гагаріна, 72, м. Дніпропетровськ, 49010 (UA) a 2010 15585 Дата подання заявки: 23.12.2010 (56) Перелік документів, взятих до уваги експертизою: Чміленко Ф.О. та інш. Встановлення фальсифікацій молока жирами рослинного походження. Харчова промисловість, 2008, №7, С.20-23. Про вміст трансізомерів в харчовій продукції A.J. Sheppard, C.-S.J. Shen, T.S. Rudolf Detection of Vegetable Oil Adulteration in Ice Cream1 and 2. Journal of Dairy Science, Volume 68, Issue 5, May 1985, Pages 1103– 1108. Ulberth F. Detection of milk fat adulteration by linear discriminant analysis of fatty acid data. J AOAC Int. 1994 Sep-Oct;77(5):1326-34. R. Gutierrez*, S. Vega*, G. Diaz*, J. Sanchez†, M. Coronado*, A. Ramirez*, J. Perez*, M. Gonzalez*, B. Schettino* Detection of non-milk fat in milk fat by gas chromatography and linear discriminant analysis. Journal of Dairy Science. Volume 92, Issue 5, May 2009, Pages 1846–1855. UA 67470 C2, 10.04.2007. RU 2279071 C2, 27.06.2006. CN 101762654 A, 30.06.2010. US 2009197340 A1, 06.08.2009. UA 94223 C2, 26.04.2011. UA 93825 C2, 10.03.2011. ГОСТ Р 51471-99 «Жир молочный. Метод обнаружения растительных жиров газожидкостной хроматографией стеринов» ДСТУ ISO 6799- 2002 "Жири та олії тваринні й рослинні. Визначення складу стеринової фракції. Газохроматографічний метод". (54) СПОСІБ КОМПЛЕКСНОГО ХРОМАТОГРАФІЧНОГО ВСТАНОВЛЕННЯ НАЯВНИХ РОСЛИННИХ ЖИРІВ В МОЛОКОПРОДУКТАХ (57) Реферат: Винахід належить до галузі молочної промисловості й призначений для визначення наявних жирів рослинного походження шляхом одночасного визначення вмісту жирних кислот та їх транс-ізомерів, а також складу стеринової фракції в молочному жирі. Спосіб хроматографічної ідентифікації молочної продукції включає зважування наважки аналізованого продукту, з частки наважки проводять омилювання відібраної проби, вилучення неомильних речовин, подальше відокремлювання стеринів від неомильних речовин за допомогою тонкошарової хроматографії та подальше визначення розділених стеринів методом газової хроматографії. З більшої частки UA 102548 C2 (12) UA 102548 C2 наважки проводять лужний гідроліз тригліцеридів та отримання метилових естерів жирних кислот реакцією етерифікації і подальше визначення жирнокислотного складу з половини цієї наважки методом газорідинної хроматографії та з іншої половини частки наважки проводять визначення вмісту транс-ізомерів жирних кислот методом газової хроматографії. UA 102548 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід стосується галузі молочної промисловості й призначений для визначення наявних жирів немолочного походження та транс-ізомерів жирних кислот в молочному жирі. Відомі способи кількісного визначення жирів немолочного походження в молочному жирі, що передбачають виділення жирової фракції, визначення оптичної густини її та досліджуваного зразка при довжині хвилі 430-450 нм та розрахунок вмісту немолочного жиру за допомогою запропонованих формул. Однак способи передбачають тільки сумарне визначення жирів немолочного походження [1], застосовані тільки до деяких продуктів [2], не перевірені на великій кількості сучасних рослинних жирів. Відомий спосіб ідентифікації, що включає екстрагування немолочного жиру сумішшю спиртів і ефірів, змішування отриманого жиру з розчинником, термостатування до 90 °C, розгін отриманої суміші на капілярній колонці з температурою нагрівання колонки до 90 °C для поділу жирних кислот і ідентифікації за допомогою газового хроматографа при довжині хвилі 150-300 нм [3]. При екстрагуванні молочного жиру він зазнає хімічних змін. Недоліками даного способу є: складність виконання, метод вимагає спеціальної кваліфікації персоналу; використання складного й дорогого обладнання; тривалість по виконанню (тимчасові витрати становлять від 1,5-2,0 год.). Найбільш близьким до способу, що пропонується, є спосіб визначення складу стеринової фракції жирів тваринного й рослинного походження газохроматографічним методом, який включає зважування наважки аналізованого продукту, омилювання відібраної проби, вилучення неомильних речовин та відокремлювання стеринів від інших неомильних речовин за допомогою тонкошарової хроматографії. Аналіз розділених стеринів методом газової хроматографії з використанням насадних або капілярних колонок [4]. Недоліком даного способу є неможливість "однозначно" ідентифікувати рослинні жири, що вміщують транс-ізомери жирних кислот (ТІЖК), шкідливі для людини, та неможливість їх ідентифікації. Задачею винаходу, що пропонується, є розробка способу комплексного хроматографічного однозначного встановлення фальсифікації молокопродуктів за рахунок одночасного визначення вмісту жирних кислот та їх транс-ізомерів, а також складу стеринової фракції. Поставлена задача вирішується тим, що в способі хроматографічної ідентифікації молочної продукції, що включає зважування наважки аналізованого продукту, з частки 1/3 наважки проводять омилювання відібраної проби, вилучення неомильних речовин, подальше відокремлювання стеринів від неомильних речовин за допомогою тонкошарової хроматографії та подальше визначення розділених стеринів методом газової хроматографії, який відрізняється тим, що з іншої 2/3 наважки проводять лужний гідроліз тригліцеридів та отримання метилових естерів жирних кислот реакцією етерифікації і подальшим визначенням жирнокислотного складу з половини цієї наважки методом газорідинної хроматографії та з іншої половини частки наважки проводять визначення вмісту транс-ізомерів жирних кислот методом газової хроматографії. Суть винаходу пояснюється хроматограмами складу стеринової фракції (фіг. 1а, б), жирнокислотного складу (ЖКС) та ТІЖК (фіг. 2). На фіг. 1а показана хроматограма складу стеринової фракції фальсифікату вершкового масла, на фіг. 1б - хроматограма нефальсифікованого вершкового масла, на фіг. 2 - хроматограма ЖКС з ТІЖК фальсифікату вершкового масла. Приклад 1 Зважують наважку продукту, виділяють жирову фазу. Потім проводять лужний гідроліз отриманої жирової фракції з наступним екстрагуванням неполярним розчинником, виділенням стеринової фракції з неомильних речовин методом тонкошарової хроматографії [4]. Аналізування розділених стеринів проводиться методом газової хроматографії з розділенням на насадних або капілярних колонках в ізотермічному режимі з полум'яно-іонізаційним детектуванням. Ідентифікація здійснюється за часом утримання стеринів у стандартних хроматографічних умовах. Наявність на хроматограмі піка бета-ситостерина говорить про присутність рослинних жирів у продукції. Інші фітостерини додатково підтверджують наявність жирів немолочного походження. Визначення стеринової фракції проводили на газорідинному хроматографі як у способі [4]. Типову хроматограму фальсифікату вершкового масла показано на фіг. 1а., нефальсифікований продукт має на хроматограмі тільки пік холестерину (фіг. 1б) Якщо на хроматограмі спостерігають піки з часом утримання, характерним для бетаситостерину і їхня висота становить більше ніж 2 % повної шкали, то це підтверджує наявність бета-ситостерину в досліджуваній пробі, тобто підтверджує наявність рослинного жиру в 1 UA 102548 C2 5 10 15 20 досліджуваному продукті. Наявність на хроматограмі піків інших фітостеринів, а саме кампастерину або стигмастерину підтверджує цей висновок. Для визначення ТІЖК в масложировій продукції також зважують наважку продукту, виділяють жирову фазу та проводять лужний гідроліз тригліцеридів з отриманням реакцією етерифікації метилових естерів жирних кислот. Наважку 50-100 мг (попередньо розплавлену) вміщують в скляну пробірку і розчиняють в 1 мл толуолу. В толуольний розчин вводять 1 мл метилату натрію в метанолі молярної концентрації 1 М, гріють до 70-80 °C 15-20 хвилин. Суміш охолоджують до кімнатної температури і додають 1 мл дистильованої води і 1 мл гексану, перемішують 10 сек. Відокремлюють верхній органічний шар і вміщують в герметичну ємність (віала з тефлоновою пробкою) з безводним сульфатом натрію. Отриманий фільтрат вводять в 3 хроматограф в кількості 1 мм за допомогою мікрошприца. Ідентифікація транс-ізомерів проводилася нами на газорідинному хроматографі "Shimadzu" GC-14 В з полум'яно-іонізаційним детектуванням за часом утримання ТІЖК в стандартних хроматографічних умовах. Капілярна колонка SP-2560 (сорбент бісціанопропілполісилоксан), довжина 100 м, внутрішній діаметр 0,25 мм, товщина нерухомої фази 0,2 мкм. Температури інжектора и детектора -220 °C, термостата колонки - 180 °C, ізотермічний режим. Газ-носій 3 водень (25 см /с). Об'єм проби - 0,5 мкл, розподіл потоку 100:1. Тиск газа-носія на вході в інжектор 0,2 МПа, розподіл потоку на вході в колонку (1:20). Обробка хроматограм проводилась з використанням програмного продукту Мультихром 1,5х для Windows (Амперсенд, Росія). Як стандарт використовувалась суміш жирних кислот С18:1, С18:2, і С18:3 в розчині метиленхлориду. Обробка результатів Відносну масу кожного компоненту Wк , %, розраховують за формулою Ах 100 , Аt 2 де A x - площа піку, що відповідає компоненту х, мм ; 2 A t - сума площ усіх піків, виключаючи пік розчинника, мм . Розрахунок масової частки транс-ізомерів жирних кислот Для масел і жирів, рафінованих за високих температур, а також для інших жирових продуктів, що не містять молочний жир, розраховують масову частку ТІЖК як суму відносних мас С18:1 транс, С18:2 транс і С18:3 транс-метилових естерів жирних кислот. Максимально можливі піки транс-ізомерів, які можуть утворюватися: С18:1 транс (1 пік), С18:2 транс (2 піки) і С18:3 транс (4 піки). Для жирових продуктів, що містять молочний жир і/або частково гідрогенізовані масла і жири масову частку ТІЖК розраховують zк суму відносних мас усіх метилових естерів жирних кислот, що вміщують подвійні зв'язки в транс-конфігурації. Інші приклади наведені в табл. Wх  25 30 35 Таблиця Визначення вмісту рослинних жирів (РЖ) за різними критеріями Критерій ЖКС Стерини ТІЖК ЖКС + стерини ЖКС + ТІЖК Стерини + ТІЖК ЖКС + стерини + ТІЖК 40 45 Вміст РЖ, який можливо встановити, % Можливість ідентифікації РЖ >10 >2 >5 >2 >5 + >2 >1 + Позитивний ефект запропонованого способу полягає в тому, що можлива однозначна ідентифікація рослинних жирів, а також визначення вмісту ТІЖК при виявленні фальсифікації молочної продукції, шляхом введення додаткової стадії хроматографічного визначення складу жирних кислот та ТІЖК. Це дозволяє виявити фальсифікацію при введенні до 1 % рослинних жирів, що неможливо іншими відомими хроматографічними методами. Джерела інформації: 1.Патент Росії RU 2279071 С2, G01N 33/03, 1 2006. 2. Патент України UA 67 470 С2, G01N 33/03, 1 2007. 2 UA 102548 C2 3. ГОСТ Р 51471-99 "Жир молочный. Метод обнаружения растительных жиров газожидкостной хроматографией стеринов" 4. ДСТУ ISO 6799-2002 "Жири та олії тваринні й рослинні. Визначення складу стеринової фракції. Газохроматографічний метод". 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 Спосіб комплексного хроматографічного встановлення наявності рослинних жирів в молокопродуктах, що включає зважування наважки аналізованого продукту, омилювання відібраної проби, вилучення з частки наважки неомильних речовин, подальше відокремлювання стеринів від інших неомильних речовин за допомогою тонкошарової хроматографії та подальше визначення розділених стеринів методом газової хроматографії, який відрізняється тим, що з більшої частки наважки проводять лужний гідроліз тригліцеридів та отримують метилові естери жирних кислот реакцією етерифікації і визначають жирнокислотний склад з половини цієї наважки методом газорідинної хроматографії, з іншої половини частки наважки проводять визначення вмісту транс-ізомерів жирних кислот методом газової хроматографії і порівнюють вміст рослинних жирів з їх граничними значеннями. 3 UA 102548 C2 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4