Спосіб виявлення специфічних антитіл у сироватках крові тварин до збудників лептоспірозу методом імуноферментного аналізу з використанням рекомбінантного білка lipl 32 як антигену

Реферат: Спосіб виявлення специфічних антитіл до збудників лептоспірозу родини Desmobacteriacea роду Leptospira у сироватках крові тварин (свиней, ВРХ та собак) полягає у постановці варіанта твердофазного імуноферментного аналізу "сандвіч-методу", який іноді ще називають "подвійним антигенним сандвічем". Як антиген запропоновано використання очищеного рекомбінантного білка зовнішньої оболонки патогенних лептоспір LipL 32. UA 103232 U (12) UA 103232 U UA 103232 U 5 10 15 20 Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини, біотехнології, мікробіології, імунології і виробництва біологічних препаратів, зокрема до лабораторної діагностики призначеної для виявлення специфічних антитіл до збудників лептоспірозу родини Desmobacteriacea роду Leptospira у сироватках крові тварин. Спосіб може бути використаним для проведень скринінгових досліджень тварин на лептоспіроз. Аналог корисної моделі - близьким за технічним рішенням до об'єкта, що заявляється, - є реакція мікроаглютинації та лізису (РМА). РМА, незважаючи на свою трудомісткість, необхідність працювати з живими антигенами та обліку реакції під мікроскопом (суб'єктивність інтерпретації результатів), все ще залишається еталоном ("золотим" стандартом), реакцією, яку найчастіше застосовують для діагностики лептоспірозу та оцінці інших діагностичних методів [1]. При постановці РМА як антиген використовують штами 21 серогрупи лептоспір, рекомендованих для дослідження в державних лабораторіях ветеринарної медицини України. При проведенні досліджень використовують чисті культури лептоспір у віці 5-15 днів без ознак аглютинації і лізису з накопиченням 70-100 мікробних клітин у полі зору мікроскопа при збільшенні 20×10×1,5 або 40×7-10. 3 Реакцію ставлять на планшетах із органічного скла з лунками, змішуючи 0,1 см 3 досліджуваної сироватки крові тварин з кожного розведення з 0,1 см антигену. Сироватки досліджують у чотирьох розведеннях: 1:50, 1:100, 1:500, 1:2500, порядок приготування яких поданий в таблиці 1. Контролем слугує суміш культури лептоспір з фізіологічним розчином по 0,1 мл. Таблиця 1 Схема приготування розведень досліджуваних сироваток Необхідна кількість (мл) фізіологічного розчину сироватки 4,8 0,2 нативної 2,0 2,0 з розведення 1:25 2,0 0,5 з розведення 1:50 2,0 0,5 з розведення 1:250 25 30 35 40 45 Одержані розведення без антигену з антигеном 1:25 1:50 1:50 1:100 1:250 1:500 1:1250 1:2500 Планшети, які містять суміш сироваток з антигеном, поміщають у термостат і інкубують одну годину при температурі 28-30 °С Реакцію враховують під мікроскопом з конденсором "темного поля" при збільшенні 20×10×15 і оцінюють в хрестах: 1. ++++ - чотири хрести - аглютиновані 100 % лептоспір; 2. +++ - три хрести - аглютиновані 75 % лептоспір; 3. ++ - два хрести - аглютиновані 50 % лептоспір; 4. + - один хрест - аглютиновані 25 % лептоспір; 5. - мінус - аглютинація лептоспір відсутня. Позитивним титром вважається найбільше розведення сироватки крові, в якому реакція була оцінена не менше, ніж на два хрести при відсутності аглютинації у контролі. Наявність специфічних антитіл у сироватці крові в титрі 1:50 у невакцинованих, 1:100 - у вакцинованих тварин інтерпретується як позитивна реакція на лептоспіроз, згідно з чинною настановою лабораторної діагностики лептоспірозу [2]. Найближчим аналогом корисної моделі є найбільш близька за технічним рішенням тестсистема діагностична імуноферментна для визначення протилептоспірозних антитіл у сироватках крові людини або тварин (UA 48561 А від 15.08. 2002 р.). Метод являє собою варіант непрямого імуноферментного аналізу (ІФА), в основу якого покладено використання антигенів, виділених із очищених культур штамів лептоспір (493 Poland, Kabura, Perepelicyni, Pomona, Moskva V, Hond Utrecht IV, M 20, Bratislava та Wijnberg), що сорбуються на поверхні полістиролових мікропланшетів, та кон'югатів, у складі яких є антивидові антитіла (анти-IgM людини, анти-ВРХ і т.д.) чи білок А, що містить ферментну мітку. В кожну лунку стрипів чи планшета вносять по 80 мкл розчину для розведення сироваток і по 20 мкл досліджуваних зразків сироваток крові. Як негативний контроль (К ) - виступає + негативна на лептоспіроз сироватка крові, а позитивний (К ) - сироватка, що дає у РМА реакцію на ++1:100 і вище. Планшети інкубують у термостаті за температури 37 °C протягом 60 хв. 1 UA 103232 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Після закінчення періоду інкубації вміст лунок видаляють та відмивають 4 рази розчином для промивання планшетів по 100 мкл. В лунки вносять по 100 мкл антивидового кон'югату (залежно від досліджуваного виду тварин) та інкубують при 37 °C протягом 45 хв. Після закінчення інкубації планшет промивають 6 разів по 100 мкл розчином для промивання та вносять у кожну з лунок по 100 мкл розчину субстрату з хромогеном (ОФД) з наступною інкубацією при 18-22 °C у захищеному від світла місці протягом 10-25 хв до появи синюватого забарвлення вмісту. Ферментативну реакцію зупиняють, вносячи до всіх проб стоп-реагент (розчин сірчаної кислоти) по 50 мкл. Інтерпретацію отриманих результатів проводять відразу ж після припинення ферментативної реакції за зміною оптичної густини зразків на ридері [3]. Даний метод дозволяє проводити дослідження 88 зразків сироваток крові протягом 2 год., що значно зменшує затрати часу обслуговуючого персоналу у порівнянні з постановкою РМА. Також до переваг можна віднести об'єктивність інтерпретації отриманих результатів, адже вона здійснюється інструментально. Однак є і суттєві недоліки: для виготовлення антигенів лаборантам доводиться працювати з живою культурою лептоспір, що створює ризик їх зараження; для постановки використовуються антивидові кон'югати, що є економічно затратними і вимагають окремої валідації під кожен конкретний вид тварин. У порівнянні з РМА метод потребує більшої кількості реактивів та лабораторного обладнання. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб виявлення специфічних антитіл, який би усував перераховані недоліки аналогів і мав нові якісні показники. Поставлено наступну задачу: створити новий спосіб виявлення специфічних антитіл до збудників лептоспірозу (патогенних лептоспір) з родини Desmobacteriacea роду Leptospira у сироватках крові тварин різних видів. Технічний результат корисної моделі полягає в усуненні перерахованих недоліків аналогів і володіння новими якісними показниками, а саме: висока специфічність та чутливість, точна і об'єктивна інтерпретація отриманих результатів реакції, максимальна економічна ефективність (скорочення витрат реагентів, посуду, спрощення постановки реакції) та зниження ризику інфікування персоналу. Поставлена задача вирішується тим, що у досліджуваних зразках сироваток крові виявляємо специфічні лептоспірозні антитіла шляхом постановки варіанта твердофазного імуноферментного аналізу (ТІФА) - "сандвіч-методу", який іноді ще називають "подвійним антигенним сандвічем" з використанням очищеного рекомбінантного білка LipL 32 як антигену. Принцип методу. Особливістю даного варіанта ТІФА є те, що застосовуються однакові антигени (у даному випадку рекомбінантний білок LipL 32) - немічений (сорбований на 96луночні плашки чи стрипи з плоским дном) та мічений ферментом (у складі кон'югату). Внаслідок реакції виникає потрійний комплекс антиген (Аг) - антитіло (Ат) - антиген, мічений ферментною міткою (Аг*), який потім візуалізується шляхом ферментативної реакції після внесення проявника. Як антиген при постановці даного методу використовується рекомбінантний білок LipL 32. За даними літератури, даний ліпопротеїн є одним з найбільших та найпоширеніших білків зовнішньої мембрани патогенних видів лептоспір Leptosipra interrogans. Рекомбінантний білок отримують шляхом виділення за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) відповідних плазмід, що кодують синтез специфічних ділянок гена мембранного протеїну LipL 32 довжиною 264 пари нуклеотидних залишків у мікроорганізмі і поміщають їх у Е. соlі. Остання починає синтезувати даний білок. Ліпопротеїн LipL 32 характеризується наступними ознаками: 1) LipL 32 зустрічається тільки у патогенних видів лептоспір. У непатогенних видів, таких як L. biflexa, ген, який кодує даний ліпопротеїн, відсутній; 2) LipL 32 розміщується на поверхні бактеріальної клітини, де він може безпосередньо взаємодіяти із молекулами макроорганізму; 3) LipL 32 зв'язується (принаймні слабо) із декількома компонентами позаклітинного матриксу; 4) пацієнти, хворі на лептоспіроз, генерують високий рівень антитіл у сироватці крові до LipL 32. 5) послідовність білка LipL 32 серед різних патогенних серогруп лептоспір є практично ідентичною [4]. Зважаючи на вищесказане, рекомбінантний білок LipL 32 є оптимальним для використання у тест-системах, спрямованих на діагностику лептоспірозу, як антиген. 2 UA 103232 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Матеріалом для лабораторної діагностики лептоспірозу "сандвіч-методом" ТІФА є сироватки крові тварин (зокрема свиней, ВРХ та собак). Для правильного виконання імуноферментного аналізу дуже важливою складовою є якість сироваток крові. Відокремлення сироватки від форменних елементів крові здійснюють таким чином: 1) пробірку із зразком крові поміщають у термостат на 30 хв при температурі 37 °C для швидкого формування фібринового згустку (фібриноген, який не потрапив у згусток, може стати джерелом хибно-позитивних реакцій); 2) обводять згусток від стінок пробірки стерильною пастерівською піпеткою і на 1 год. поміщають у холодильник за температури +4…+8 °C; 3) зразки центрифугують 10 хв. при 3 тис. об/хв. Якісна сироватка має солом'яно-жовтий або блідо-червонуватий колір. Вона не повинна мати вираженої гіперліпідемії (хільозу), бактеріемії. Не допускається постановка реакції з пробами, що містять згустки крові, а також з сироватками, до яких додано азид натрію (інгібітор пероксидази) як консервант. Постановка "сандвіч-методу" ТІФА складається із наступних етапів: 1. Внесення у лунки досліджуваних проб сироваток крові, а також негативного та позитивного контролів по 40 мкл/лунку. Додавання кон'югата пероксидази хрону із LipL 32, розведеному на фосфатно-сольовому буфері з умістом 5 % сухого знежиреного молока та 0,05 % Твіну 20 по 60 мкл/лунку. Інкубація в термостаті при +37 °C протягом 1,5 год. 2. Відмивання мікролунок 3 рази по 200 мкл/лунку. Для цього застосовується 30-кратний фосфатний буфер із Tween-20 як детергент. 3. Додавання проявника (застосовується субстрат ТМБ) по 100 мкл/лунку і інкубація в захищеному від світла місці протягом 15-20 хв. 4. Зупинення ферментативної реакції стоп-реактивом (розчин Н3РО4) по 100 мкл/лунку. Як негативний контроль (К ) використовуються негативні за РМА проби сироваток крові, як + позитивний (К ) - проби сироваток крові, що реагують у РМА в титрі ++ 1:50 та вище. Облік реакції здійснюється на 96-луночному електрофотометрі (імуноферментному аналізаторі) з довжиною хвилі 450-620 нм за інтенсивністю забарвлення продукту (оптична густина), яка виникає у результаті дії окисно-відновного ферменту пероксидази хрону на субстрат ТМБ (тетраметилбензидин). 1. Розраховують середнє значення оптичної густини (ОГ) для лунок з негативним контролем + (ОГ сер К ) і позитивним контролем (ОГ сер К ). 2. Проведення аналізу вважають коректним, якщо ОГ сер К" не перевищує 0,115 оптичних + одиниць (о.о.), а значення ОГ сер К ) не нижче за 0,131 о.о. 3. Якщо одне з трьох значень ОГ К перевищує 0,115 о.о., його відкидають, а ОГ сер К розраховують за рештою показників. + + 4. Якщо одне з трьох значень ОГ К нижче за 0,131 о.о., його відкидають, а ОГ сер К розраховують за рештою показників. Інтерпретація результатів: 1. Досліджувані проби сироваток крові, що дали оптичні показники у межах 0-115 о.о. інтерпретуються як негативні. 2. Досліджувані проби сироваток крові, що дали оптичні показники у межах від 0,131 о.о. і вище інтерпретуються як позитивні. 3. Досліджувані проби сироваток крові, що дали оптичні показники у межах 0,116-0,13 о.о. інтерпретуються як сумнівні. Зразки, які мають сумнівний результат, необхідно досліджувати повторно не менш як у двох лунках тест-системи, при цьому: 1) зразки, позитивні в одній або більше лунках, слід вважати позитивними; 2) зразки, негативні в одній або більше лунках, слід вважати негативними; 3) у випадку, коли повторно був отриманий сумнівний результат, тварин необхідно ще раз дослідити на лептоспіроз не раніше як через 14 днів. "Сандвіч-метод" твердофазного імуноферментного аналізу з використанням рекомбінантного білка LipL 32 як антиген, дозволяє проводити дослідження 90 проб сироваток крові тварин (собак, свиней та ВРХ) за 2-2,5 год. і якісно виявляти сумарні антитіла у титрах ++1:50 і вище проти патогенних штамів лептоспір L. interrogans. Діагностична чутливість реакції складає 89,8 %, специфічність - 96,7 %. Дана тест-система має суттєві переваги над аналогами, а саме: 1) використання як антигену очищеного рекомбінантного білка, що усуває потребу роботи обслуговуючого персоналу з живою культурою лептоспір і значно знижує ризик зараження лептоспірозом; 3 UA 103232 U 5 10 15 20 25 2) використання універсального кон'югату для дослідження сироваток різних видів тварин (свиней, ВРХ та собак), що полегшує роботу персоналу, зменшує затрати часу на постановку та є економічно вигіднішим за найближчий аналог (непрямий ІФА), для постановки якого використовуються антивидові кон'югати; 3) зменшення циклів відмивання мікропланшета до одного за рахунок поєднання двох етапів постановки аналізу - внесення досліджуваних проб сироваток крові з контролями та кон'югату; 4) спосіб постановки методу є автоматизованим і не трудомістким. Недоліком даного методу, як і непрямого ІФА, є низька кореляція між титрами в РМА та оптичними показниками імуноферментної тест-системи, що не дозволяє диференціювати вакцинальні титри від діагностичних. Тому "сандвіч-метод" ТІФА пропонується як скринінговий метод для невакцинованих тварин. Спосіб знайде застосування у виробничих лабораторіях ветеринарної медицини та науководослідних установах, а також у господарствах при проведенні оздоровчих заходів за лептоспірозу тварин. Джерела інформації: 1. Уховський В.В. Порівняльна характеристика сучасних методів лабораторної діагностики лептоспірозу с/г тварин та перспектива розробки дот-ІФА з метою її удосконалення / В.В. Уховський [та ін.] // Ветеринарна біотехнологія. - 2013. - № 23. - С. 259-260. 2. Настанова з лабораторної діагностики лептоспірозу. - К., 1996. - 25 с. 3. Декларац. пат. України на корисну модель 2001106918 Україна, МПК А61К39/00. Тестсистема діагностична імуноферментна для визначення протилептоспірозних антитіл у сироватках крові людини або тварин / В.П. Семиноженко, І.Г. Кириленко, П.І. Вербицький, О-р. О. Кучерявенко, О-й. О. Кучерявенко, О.А. Шевчук, М.Я. Співак, Є.В. Резуненко, А.Ф. Ображей, Т.В. Таран [та ін.]. - № 48561; заявл. 11.10.2001; опубл. 15.08.2002; бюл. № 8-9 с. 4. Murray G.L. Major surface protein LipL32 is not required for either acute or chronic infection with Leptospira interrogans / G.L. Murray [et al.] // Infection and Immunity. - 2009 - Vol. 77(3). - P. 952-958. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 Спосіб виявлення специфічних антитіл до збудників лептоспірозу родини Desmobacteriacea роду Leptospira у сироватках крові тварин (свиней, ВРХ та собак) шляхом постановки варіанта твердофазного імуноферментного аналізу "сандвіч-методу", що характеризується високою специфічністю, чутливістю та об'єктивністю отриманих результатів, який відрізняється тим, що як антиген використовують очищений рекомбінантний білок LipL 32, усуваючи потребу роботи обслуговуючого персоналу із живою культурою лептоспір та відсутністю необхідності застосування антивидових кон'югатів для дослідження сироваток крові різних видів тварин (свиней, ВРХ та собак). Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4