N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразид, який виявляє протитуберкульозну дію

Реферат: Винаходом є сполука флуоренового ряду, а саме: N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразид, яка виявляє протитуберкульозну дію. Встановлено, що N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразид активний щодо штамів мікобактерій туберкульозу, які чутливі і стійкі до ізоніазиду, та перевищує активність аналога за дією ізоніазиду. N H N O OMe UA 105237 C2 (12) UA 105237 C2 UA 105237 C2 5 10 15 20 25 Винахід належить до фармацевтичної хімії і стосується нової хімічної сполуки флуоренового ряду, а саме: N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразиду, який виявляє протитуберкульозну дію. Захворювання на туберкульоз займає перше місце в структурі смертності людей від інфекційної патології. Епідемія туберкульозу в Україні визнана ВООЗ у 1995 р. У даний час захворювання характеризується зростанням типової форми, яку спричиняють мікобактерії, стійкі до протитуберкульозних засобів, а також СНІД. Проблеми стандартизації епідеміологічного контролю за резистентністю до антибактерійних препаратів досліджують вчені, епідеміологи і лікарі-фтизіатри. На даний час туберкульоз спричиняє такий вид збудника, який у процесі багатьох пасажів через людський організм набув стійкості до протитуберкульозних препаратів. Найбільш проблемним питанням сьогодні є поширення мультирезистентної (лікарсько стійкої) форми туберкульозу [1]. Пошук нових ефективних протитуберкульозних препаратів є надзвичайно актуальним, особливо у період епідемії туберкульозу в Україні. Основним напрямом у пошуку нових туберкулостатиків є модифікація структури молекул відомих протитуберкульозних препаратів з метою отримати активніші і менш токсичні фармакологічні речовини. Найбільший інтерес як потенційні туберкулостатики представляють групи сполук з високою активністю щодо чутливих і стійких штамів Мус. tuberculosis та низькою токсичністю. Найактивнішим і широко вживаним сьогодні в усіх схемах лікування туберкульозу вважають препарат І ряду - ізоніазид. Нами створені на основі флуорену нові сполуки, які за активністю in vitro та in vivo не поступаються ізоніазиду, значно менш токсичні, пригнічують ріст полірезистентних штамів мікобактерій туберкульозу [2]. Технічна задача полягала у розширенні асортименту ефективних протитуберкульозних засобів, які виявляють високу специфічну дію на різні штами мікобактерій туберкульозу і мають низьку токсичність [3]. Поставлену задачу вирішено таким чином, що одержують N-(9-флуореніліден)-оанісогідразид формули 1 N H N O OMe . 30 35 40 45 50 Сполука формули 1 в літературі не описана. Приклад До розчину 90,1 г (0,5 моля) флуоренону-9 у 1,0 л бензолу додають 1 г птолуолсульфокислоти, 84,0 г (0,5 моля) о-метоксибензойної кислоти і кип'ятять. Через 40 хв. реакційна маса сильно закипає, у насадці Діна-Старка інтенсивно виділяється вода, з реакційної маси виділяється осад. Через 1 год. реакція припиняється. Після охолодження до 20 °C осад відфільтровують, промивають бензолом, толуолом, водою. Отримують 136 г (82,8 %) сполуки у вигляді тоненьких голок світло-жовтого кольору, Тпл. 200,0-200,5 °C (з етанолу). N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразид практично нерозчинний у воді і петролейному ефірі; розчинний в етанолі, ацетоні, льодовій оцтовій кислоті; легко розчинний у хлороформі і ДМФА. C21H16N2O2 мол. м. 328,353. Знайдено, %: С - 76,99, Н - 5,14, N-8,38. Вирахувано, %: С - 76,81, Н- 4,91, N-8,53. УФ-спектр в етанолі, λмакс. (lgε): 240-300 нм - 255(4,43), згин 280 (3,83); 290-340 нм - згин 290 (3,86), згин 305 (3,88), 340 (4,20). Протитуберкульозну ефективність заявленого N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразиду вивчено in vitro із зависсю культури Мус. tuberculosis hominis H37Rν, мікобактерій, виділених від хворих на вперше виявлений туберкульоз легень і мікобактерій, які чутливі й стійкі до ізоніазиду. За еталон порівняння специфічної протитуберкульозної дії взято найактивніший лікарський засіб - туберкулостатик ізоніазид. 1 UA 105237 C2 5 10 15 20 Найближчим структурним аналогом заявленої сполуки визначено синтезований нами N-(9флуореніліден)-м-анісогідразид, який описаний в авторському свідоцтві на винахід. Структурний аналог - мета-ізомер також виявляє протитуберкульозну активність щодо штаму мікобактерій туберкульозу H37Rν у концентрації 12,5 мкг/мл [4]. У мікробіологічному експерименті використано традиційний метод серійних розведень на густому середовищі Льовенштейна-Єнсена: у кожну дослідну і контрольні пробірки засівали по 0,2 мл суспензії мікобактерій за стандартом оптичної мутності. Через 14, 30 і 45 діб інкубації з осаду готували мазки для бактеріологічного дослідження. Забарвлення проведені за ЦільНільсеном. Результати бактеріологічних досліджень оцінювали через 14, 30, 45 діб від моменту посіву матеріалу. Відлік починався з часу, коли в контрольних пробірках (без протибактерійних препаратів) спостерігався ріст колоній мікобактерій туберкульозу. Встановлено, що нова сполука N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразид активна щодо штамів мікобактерій туберкульозу, які чутливі і стійкі до ізоніазиду та перевищує активність аналога за дією - ізоніазиду. Порівняльна ефективність заявленої речовини N-(9-флуореніліден)-оанісогідразиду та ізоніазиду на Мус. tuberculosis hominis H37R подана в таблиці 1. З таблиці 1 видно, що на 14 добу експерименту заявлена сполука ефективна щодо: - штаму мікобактерій туберкульозу H37R у концентрації 10,0 мкг/мл; структурний аналог мета-ізомер менш активний і діє на штам мікобактерій туберкульозу H37R у концентрації 12,5 мкг/мл; - штаму мікобактерій туберкульозу, стійкого до ізоніазиду в концентрації 20,0 мкг/мл; - штаму мікобактерій туберкульозу, чутливого до ізоніазиду в концентрації 10,0 мкг/мл. Таблиця 1 Чутливість Мус. Tuberculosis hominis H37R, виділених від хворих на вперше виявлений туберкульоз легень, до заявленого N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразиду та ізоніазиду на 14 день Досліджені сполуки Штами МБТ МБТ H37R N-(9-флуореніліден)-оСтійкий до анісогідразид ізоніазиду Чутливий до ізоніазиду К. Культури Стійкий до ізоніазиду Ізоніазид Чутливий до ізоніазиду К. Культури 25 30 35 20 Термін росту на поживному середовищі Концентрація сполук мкг/мл 10 5 2,5 1,25 0,625 0,313 0,156 0,078 + ++ ++ +++ ++++ ++++ ++++ + ++ +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ + +++ ++ + +++ ++++ ++++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ Таким чином, нова сполука вигідно відрізняється від ефективності самого ізоніазиду щодо штаму мікобактерій туберкульозу, стійкого до ізоніазиду, який у даному випадку ефективний лише у концентрації 20 мкг/мл. З таблиці 2 видно, що на 30 добу експерименту заявлена сполука ефективна щодо: - штаму мікобактерій туберкульозу H37RV у концентрації 10,0 мкг/мл; активність зберігається; - штаму мікобактерій туберкульозу, стійкого до ізоніазиду в концентрації 20,0 мкг/мл; - штаму мікобактерій туберкульозу, чутливого до ізоніазиду в концентрації 10,0 мкг/мл; Таким чином, ефективність заявленої сполуки на 30 добу експерименту вигідно відрізняється від дії ізоніазиду щодо штаму мікобактерій туберкульозу стійкого до ізоніазиду, який ефективний у концентрації 20 мкг/мл. 2 UA 105237 C2 Таблиця 2 Чутливість Мус. tuberculosis hominis H37R, виділених від хворих на вперше виявлений туберкульоз легень, до заявленого N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразиду та ізоніазиду на 30 день Досліджені сполуки N-(9-флуореніліден)-оанісогідразид Ізоніазид Термін росту на поживному середовищі Концентрація сполук мкг/мл 10 5 2,5 1,25 0,625 0,313 0,156 0,078 ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ Штами МБТ МБТ H37R Стійкий до ізоніазиду Чутливий до ізоніазиду К. Культури Стійкий до ізоніазиду Чутливий до ізоніазиду К. Культури 20 + +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ ++++ +++ + ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ Таблиця 3 Чутливість Мус. tuberculosis hominis H37R, виділених від хворих на вперше виявлений туберкульоз легень, до заявленого N-(9-флуоренілден)-о-анісогідразиду та ізоніазиду на 45 день Досліджені сполуки N-(9-флуореніліден)-оанісопдразид Ізоніазид 5 10 15 20 Термін росту на поживному середовищі Концентрація сполук мкг/мл 10 5 2,3 1,25 0,625 0,313 0,156 0,078 + ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ Штами МБТ МБТ H37R Стійкий до ізоніазиду Чутливий до ізоніазиду К. Культури Стійкий до ізоніазиду Чутливий до ізоніазиду К. Культури 20 ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + ++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + ++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ З таблиці 3 видно, що на 45 добу експерименту заявлена сполука ефективна щодо: - штаму мікобактерій туберкульозу H37R у концентрації 20,0 мкг/мл; - штаму мікобактерій туберкульозу, стійкого до ізоніазиду в концентрації 20,0 мкг/мл; - штаму мікобактерій туберкульозу, чутливого до ізоніазиду в концентрації 20,0 мкг/мл. Таким чином, ефективність заявленої сполуки N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразид на 45 добу експерименту вигідно відрізняється від дії ізоніазиду щодо штаму мікобактерій туберкульозу, стійкого до ізоніазиду. Заявлена сполука N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразид на 14, 30 і 45 добу експерименту стабільно ефективна відповідно в концентраціях 10,0 мкг/мл; 10,0 мкг/мл; 20,0 мкг/мл. Ізоніазид, як видно з таблиць 1-3, діє виключно на штами мікобактерій туберкульозу, які чутливі до нього. Результати експерименту показали перевагу заявленої сполуки над ізоніазидом саме відносно штаму МБТ, стійкого до ізоніазиду, що особливо важливо на сьогоднішній день. N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразид виявляє низьку токсичність в експерименті in vivo на білих безпородних мишах при внутрішньочеревному способі введення. Визначення гострої токсичності нової сполуки N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразиду проведено відповідно до "Вимог щодо вивчення загальнотоксичної дії нових фармакологічних речовин" Фармакологічного комітету МОЗ України (1993 p.). Розрахункова доза ЛД50 для білих 3 UA 105237 C2 безпородних мишей при внутрішньочеревному способі введення становить 2900 мг/кг маси тварини. Нова сполука належить до малонебезпечних (таблиця 4). Таблиця 4 Порівняльні дані гострої токсичності N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразиду та ізоніазиду Препарати Спосіб введення внутрішньовенно підшкірно внутрішньочеревинно внутрішньочеревинно ізоніазид N-(9-флуореніліден)-м-анісогідразид N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразид 5 10 15 20 ЛД50, мг/кг 150 160 2900 3150 З таблиці 4 видно, що заявлена сполука менш токсична, порівняно зі своїм мета-ізомером, а за співвідношенням ЛД50 приблизно у 21 раз менш токсична, ніж ізоніазид. Таким чином, N-9-флуореніліден)-о-анісогідразид формули 1 вигідно відрізняється від ізоніазиду за ефективністю дії на штам мікобактерій туберкульозу, який стійкий до ізоніазиду. Запропонована речовина N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразид, що належить до класу флуоренів, представляє інтерес як потенційний протитуберкульозний засіб, безпечний для організму і перспективний для впровадження у медичну практику. Джерела інформації: 1. Білогорцева О.І., Фещенко Ю.І. Епідеміологічна ситуація щодо туберкульозу у дітей та показники протитуберкульозної роботи серед дитячого населення України у 2010 р. - Київ: Укр. пульмон. журн., № 4, 2011. - С 11-15. 2. Петрух Л.І. Флуорени як туберкулостатики. Флуренізид: мікробіологічні, фармакологічні та клінічні аспекти/ Монографія. - Львів, 2008. - 464 с 3. Петрух Л.І. Актуальність створення і впровадження у промислове виробництво нових лікарських засобів. 3б. описів винаходів / За ред. Петрух Л.І., Петрух В.М. - Львів, ЛвЦНТЕІ, 2003. - 198 с 4. Флуореніліденгідразиди заміщеної бензойної кислоти, які мають протитуберкульозну дію/ SU №1469805 А1, пріор. 16.12.85; опубл. 01.12.87// Маслова Л.І., Калмикова Г.Н., Зміяк Н.В. та ін. 25 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ N-(9-флуореніліден)-о-анісогідразид формули (1) N H N O 30 OMe , (1) який виявляє протитуберкульозну дію. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4