Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак

Реферат: Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак включає одержання еритроцитів, осадження еритроцитів центрифугуванням, відділення плазми, обробку еритроцитів кріопротектором, заморожування, зберігання у рідкому азоті, відмивання. Одержують еритроцити на глюкозоцитратному консерванті, як кріопротектор використовують 17,5 % розчин гідроксіетилкрохмалю (ГЕК). UA 110268 U (12) UA 110268 U UA 110268 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної медицини, а саме до низькотемпературного консервування еритроцитів тварин для тривалого зберігання, та може використовуватись у ветеринарних лікарнях. Розробка методів низькотемпературного консервування та довгострокового зберігання еритроцитів домашніх тварин, зокрема собак, є однією із актуальних проблем ветеринарної медицини. Інтерес до проблеми обумовлений зростанням гематологічних захворювань у тварин, низькою кількістю тварин-донорів, складністю підбору крові за фенотипічними характеристиками, а також нетривалим терміном її зберігання при температурі 4 °C. Існує спосіб консервування еритроцитів людини [А. С. № 596202, МПК A01N 1/02, 09.02.1978 р. Способ консервирования эритроцитов]. Але цей спосіб не забезпечує високої життєздатності еритроцитів, так як відмивання еритроцитів проводять в два етапи. Найбільш близьким за технічною суттю до способу, що заявляється, є спосіб консервування еритроцитів людини [Патент RU № 1775882, МПК A01N 1/02, 10.09.1995 р. Способ консервирования эритроцитов]. За цим способом відділяють плазму шляхом центрифугування еритроцитів, обробляють еритроцити кріопротектором 1,2-пропандіол, заморожують при (-170)(180 °C), занурюють у рідкий азот і зберігають при -196 °C. Після цього заморожені еритроцити відтаюють і відмивають. Це рішення може бути прототипом. Недоліком цього способу є те, що після відмивання в еритромасі зостається велика кількість кріопротектора 1,2-пропандіол, що не дозволяє переливати великі об'єми крові. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб кріоконсервування еритроцитів собак, що включає одержання еритроцитів, осадження еритроцитів центрифугуванням, відділення плазми, обробку еритроцитів кріопротектором, заморожування, зберігання у рідкому азоті, відмивання шляхом одержання еритроцитів на глюкозо-цитратному консерванті, використання як кріопротектора - 17,5 % розчину гідроксіетилкрохмалю (ГЕК), щоб забезпечити ефективність способу. Порівняльний аналіз з прототипом дозволяє зробити висновок, що використання як кріопротектора - 17,5 % розчину гідроксіетилкрохмалю (ГЕК) та одержання еритроцитів на глюкозо-цитратному консерванті сприяло підвищенню життєздатності еритроцитів за рахунок зниження токсичності кріоконсерванта. Спосіб виконується таким чином. Спочатку одержують еритроцити від здорових собак. Для цього кров заготовляють на глюкозо-цитратному консерванті і зберігають не більш як 4 години при температурі 4 °C до проведення дослідження. Потім еритроцити осаджують центрифугуванням при 3500 об./хв. протягом 5 хв. Після цього плазмо-лейкоцитарний шар збирають, еритроцити відмивають триразово п'ятикратним об'ємом ізотонічного сольового розчину. Одержану еритроцитарну масу обробляють кріопротектором, який містить 17,5 % гідроксіетилкрохмаль (ГЕК). Розчин кріопротектора змішують з еритромасою в співвідношенні 1:1. Тривалість експозиції еритроцитів собак в кріозахисному розчині становить 30 хв. при температурі 22 °C, а при температурі 37 °C – 10 хв. Дослідні зразки заморожують в мікротюбиках "EPINDORFF" об'ємом 10 і 15 мл шляхом швидкого занурення контейнера в рідкий азот при температурі (-196 °C). Потім еритроцити відтаюють на водяній бані при температурі 40-42 °C, після чого видаляють кріопротектор, додаючи до суспензії розморожених еритроцитів рівний об'єм 0,6 М розчину NaCl. Приклад 1. Для одержання еритроцитів кров собак заготовляли на глюкозо-цитратному консерванті і зберігали не більш як 4 години при температурі 4 °C до проведення дослідження. Потім еритроцити осаджували центрифугуванням при 3500 об./хв. протягом 5 хв. Після цього плазмолейкоцитарний шар збирали, еритроцити відмивали триразово п'ятикратним об'ємом ізотонічного сольового розчину (150 мМ NaCl, 10 мМ трис - НСl, рН 7,4). Одержану еритроцитарну масу обробляли кріопротектором, який містить 17,5 % ГЭК, 150 мМ NaCl, 10 мМ трис - НСl, рН 7,4. Розчин кріопротектора змішували з еритромасою в співвідношенні 1:1. Тривалість експозиції еритроцитів собак в кріозахисному розчині становила 30 хв. при температурі 22 °C. Дослідні зразки заморожували в мікротюбиках "EPINDORFF" об'ємом 10 і 15 мл шляхом швидкого занурення контейнера в рідкий азот при температурі (-196 °C). Потім еритроцити відтаювали на водяній бані при температурі 40-42 °C. Відтаювання проводили в один етап, щоб покращити реологічні властивості еритроцитів. Після цього видаляли кріопротектор, додаючи до суспензії розморожених еритроцитів рівний об'єм 0,6 М розчину NaCl. Рівень гемолізу визначали за допомогою спектрофотометра при 543 нм: % гемолiзу = [А1/А2] х 100 %, де: А1 - оптична щільність досліджуваної проби; А2 - оптична щільність при повному гемолізі контрольної проби. 1 UA 110268 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Рівень гемолізу становив не більше 16 %, тобто така концентрація кріопротектора дозволила зберегти більше 80 % клітин після розморожування. Приклад 2. За викладеним вище прикладом 1 визначали рівень гемолізу еритроцитів в залежності від концентрації кріопротектора ГЕК. Результати наведені в таблиці 1. Із матеріалів таблиці 1 видно, що зміна концентрації нижче або вище 17,5 % приводить до підвищення гемолізу в клітинах. Приклад 3. За викладеним вище прикладом 1 визначали рівень гемолізу еритроцитів в залежності від часу інкубації кріопротектора з еритроцитами. Результати наведені в таблиці 2. Із матеріалів таблиці 2 видно, що оптимальним часом для інкубації еритроцитів собаки з розчином ГЕК є 30 хвилин. Приклад 4. За викладеним вище прикладом 1 визначали рівень гемолізу еритроцитів собаки і кішки в залежності від часу експозиції при температурі 37 °C після заморожування - відтавання відмивання. Результати наведені в таблиці 3. Із матеріалів таблиці 3 видно, що оптимальним часом для експозиції еритроцитів з кріопротектором при температурі 37 °C є 10 хвилин, з подальшим збільшенням часу інкубації клітин з кріопротектором зростає ріст гемолізу. Приклад 5. За викладеним вище прикладом 1 заготовляли еритроцитарну масу, при цьому кров забирали від собаки - донора. Розморожену еритроцитарну масу переливали собакам, хворим на гостру та хронічну форму бабезіозу. Розрахунок необхідної кількості еритроцитів для трансфузії проводили за формулою: К×МТ×(НbТ-НbР) НbД, де К - постійний коефіцієнт (К=70); МТ - маса тіла реципієнта (кг); НbТ (г/л) - необхідний гемоглобін для реципієнта; НbР (г/л) - гемоглобін реципієнта; НbД - гемоглобін донора. Переливання здійснювали внутрішньовенно за допомогою спеціальної системи для переливання крові і внутрішньовенного катетера. Еритроцитарна маса попередньо була підігріта до 37 °C, а також розведена 1:1 розчином NaCl, гематокрит якої складав 45 %. Основними критеріями ефективності застосування еритроцитарної маси служили показники приросту гемоглобіну, гематокриту, загальної кількості еритроцитів. Результати дослідів наведені у таблиці 4. Із матеріалів таблиці 4 видно, що в першій групі тварин після лікування і гемотрансфузії ЕМ рівень гемоглобіну і гематокриту зріс на 11,4 % і 16,4 %, а кількість еритроцитів на 26,3 %, однак на 10 добу рівень гемоглобіну і гематокриту зріс на 12,5 і 28,6 %, тоді як приріст еритроцитів склав 27 %. Отже всі показники зросли в 2 рази у порівнянні з результатами, одержаними після специфічного лікування без гемотрансфузії. У другій групі хворих тварин після першої доби лікування у комплексі з гемотрансфузією спостерігалось підвищення рівня гемоглобіну і гематокриту на 24,6 і 14,9 % відповідно, тоді як кількість еритроцитів зросла на 83,6 %. На 10 добу після початку курсу лікування і трансфузії кріоконсервованої ЕМ спостерігалось підвищення рівня гемоглобіну і гематокриту на 16,4 і 24,7 % відповідно, тоді як приріст еритроцитів склав 113 %. Одержані дані свідчать про те, що комплексна схема лікування тварин, хворих на бабезіоз, яка включає переливання кріоконсервованої еритроцитарної маси, є ефективною. Таким чином, запропонований спосіб дозволяє зберігати більше 80 % непошкоджених клітин після розморожування, спрощує процес заморожування - відтавання відмивання. Спосіб можна використовувати у ветеринарних клініках і на практиці ветеринарної гематології. 2 UA 110268 U Таблиця 1 Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак Концентрація ГЕК, % 6,25 10 17,5 20 Рівень гемолізу, % 57,7±1,55 42,1±1,98 15,7±2,15 30,3±2,31 Таблица 2 Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак Рівень гемолізу, % Час експозиції, хв. 20 69,8±1,29 69,7±1,76 29,1±2,01 41,4±2,22 Концентрація ГЕК, % 6,25 10 17,5 20 10 73,4±1,21 73,4±1,58 33,9±1,96 56,8±2,20 30 57,7±1,55 42,1±1,98 15,7±2,15 30,3±2,31 Таблица 3 Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак Рівень гемолізу, % Час експозиції, хв. 20 55,9±1,96 45,9±1,81 33,8±2,25 Концентрація ГЕК, % 6,25 10 17,5 10 45,3±1,89 32,4±1,88 8,9±2,04 30 88,3±1,78 78,9±1,91 79,3±1,87 Таблиця 4 Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак Показник Піддослідні групи тварин Перша (рання стадія) Контрольна Друга (пізня стадія) захворюваності захворюваності група До До 1 доба 10 доба 1 доба 10 доба лікування лікування Гематокрит 40,5±0,35 19,56±0,34 22,7±0,74* 29,2±0,77 10,6±0,77* 12,18±0,61* 15,1±0,64 (Ht), % Гемоглобін 140,5±0,87 71,8±0,94 80,03±1,81* 90,1±1,91* 45,40±0,28* 56,6±1,80* 65,9±0,154 (Hb), г/л Еритроцити (RBC), 5,86±0,82 1,9±0,09 2,4±0,09* 3,03±0,09* 0,55±0,09* 1,01±0,10* 2,15±0,21 12 10 /л 5 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 Спосіб кріоконсервування еритроцитів собак, що включає одержання еритроцитів, осадження еритроцитів центрифугуванням, відділення плазми, обробку еритроцитів кріопротектором, заморожування, зберігання у рідкому азоті, відмивання, який відрізняється тим, що одержують еритроцити на глюкозо-цитратному консерванті, використовують як кріопротектор - 17,5 % розчин гідроксіетилкрохмалю (ГЕК). 3 UA 110268 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4