Спосіб визначення стійкості мікроорганізмів до антибіотику

Способ определения устойчивости микроорганизмов к антибиотику, включающий инкубацию микроорганизма с антибактериальным препаратом при 37°С, о т л и ч з ю щи й с я тем, что дня инкубации используют суспензию микроорганизма к которой дополнительно добавляют радиоактивные изотопы /J-излучения, а устойчивость микроорганизма определяют по уровню включения радиоактивной метки в структуру микробной клетки через 50-60 минут инкубации причем уровень включения прямо пропорционален устойчивости микроорганизма к антибиотику. Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике лекарственной устойчивости микроорганизмов, этиологически определяющих инфекционные, септические и гнойно-воспалительные заболевания. Наиболее близким к заявляемому способу является способ определения устойчивости микроорганизмов к антибиотику методом серийных разведений в жидкой питательной среде, согласно которому к серийным разведениям антибактериальных препаратов в мясопептонном бульоне добавляют взвесь бактерий, выращенных на мясопелтонном агаре при 37°С в течение 16-18 часов и смытых мясопептонным бульоном до конечной концентрации 10 -10 клеток/мп. Результаты учитывают, определяя наличие или отсутствие роста бактерий в пробирках, содержащих различные разведения антибактериальных препаратов по мутности среды. Однако, вышеперечисленные способы обладают рядом существенных недостатков к которым относятся длительность проведения бактериологического исследования (до 20-24 чассв, а в случае определения бактерицидной активности до 48-72 часов), громоздкость методической постановки, необходимость использования специализированных кадров и аппаратуры Одновременно данный способ рассчитан на определение антибиотикоустоичиоости лишь изолированных из микробных ассоциаций компонентов и не позволяет проводить комплексную оценку антибиотикорезистентности ассоциантов и смешанных культур. Кроме этого, известный способ не позволяет непосредственно исследовать клинический материал (раневой биоптат гнойное отделяемое и т д.), что затрудняет оперативное применение этиотропной терапии при лечении гнойно-воспалительных заболеезнии. Недостатком способа является отсутствие со о 11213 возможности устанавливать механизм действия антибактериальных препаратов. Целью изобретения является повышение эффективности определения лекарственной устойчивости микроорганизмов в 5 нативном клиническом материале, с исключением бактериологических исследований и существенным сокращением сроков для получения результатов, Суть заявляемого способа составляет 10 дифференцированное использование меченых радиоактивным изотопом аминокислот и нуклеотидов в зависимости от механизма действия антибиотика на бактериальную клетку для определения степени устойчиво- 15 сти микроорганизмов к антибиотику по угнетению уровня включения метки в структуру микробной клетки по сравнению с контролем. Предварительными экспериментами 20 были обоснованы оптимальные параметры и моделирующие состояния, используемые в качестве контролен в способе. Эксперимен тально обоснованы оптимальные времен ные параметры инкубации в предложенном 25 способе. На рис. 1 представлен график зави симости включения Н-тимидина и 14С-глицина в структуру золотистого стафилококка (штамм 209) в зависимости от времени инку бации. Как видно из графика, процесс вклю- 30 чения 3Н-тимидина выходит на плато к 40 мин, в то время как максимальное включе ние С-глицина наступает к 50 минуте. Та ким образом оптимальное время инкубации 50-60 минут. 35 На рис.2 (столбик 1) сорбция метки на поверхности микробных клеток после их разрушения 1,5% раствором детергента тритона Х-100 (20 мкл, 5 мин) по сравнению с включением метки интактными стафило- 40 кокками (рис.2 ст.4) и после криовоздейст-вия (рис.2 ст.2). При посеве на чашки с плотной питательной средой и инкубации 18-24 часа при 37°С 0,1 мл взвеси золотистого стафилококка после воздействия детер- 45 гентом, отмечено отсутствие роста бактерий, что позволяет использовать уровень сорбции метки на бактериях после воздействия на них тритона Х-100 (20 мкл, 5 мин) как контрольный, моделирующий бак50 терицидное воздействие препаратов на микробные клетки. На рис.2 ст.2, 3 графически представлено 3 угнетение включения Н-тимидина в структуру золотистого стафилококка после 55 криовоздействия (5 мин жидким азотом) и отсутствие угнетения включения метки в структуру микробной клетки после воздействия дистиллированной водой в течение 5 мин по сравнению с включением того же изотопа интактными бактериальными клетками (рис.2 ст 4). Одновременно уровень включения метки в структуру стафилококка при криовоздействии отличается от сорбции метки на его поверхности при воздействии детергентом (рис.2 ст, 1), что указывает на наличие активного включения радиоактивной метки в структуру микробной клетки, как признак ее жизнедеятельности при криовоздействии. При посеве 0,1 мл взвеси золотистого стафилококка после криовоздействия на чашки с плотной питательной средой и инкубации 18-24 часа при 37°С наблюдается рост единичных колоний, что подтверждает выбор оптимального моделирования бактериостатического воздействия на микроорганизм с ингибированием их ферментных систем при воздействии на них жидким азотом в течение 5 минут. Способ осуществляется следующим образом: раневой экссудат в объеме 1 мл или 1 г гомогенизированного биоптата из раны разводят изотоническим раствором поваренной соли из расчета 1:10 и центрифугируют при 1,5-2 тыс.об/мин в течение 5—10 мин при Т+4+6°С. Надосадочную жидкость декантируют и используют для исследования лекарственной устойчивости микроорганизмов. К супернатанту добавляют меченую изотопом аминокислоту или нуклеотид в зависимости от механизма действия исследуемого антибиотика из расчета 2 мккюри/мл и антибиотик в лимитной терапевтической концентрации. Полученную смесь инкубируют в термостате при 37-37,5°С в течение 50-60 мин. Невключившуюся метку удаляют трехкратным центрифугированием при 10 тыс.об/мин по 10 мин. В полученном осадке определяют уровень радиоактивности. В качестве контролен берут: ~ максимальное включение метки микробной клеткой за время инкубации, которое определяют без внесения антибиотика в систему; - минимальное включение метки при ингибировании ферментных систем стафило кокка определяют после криовоздействия на него (5 мин. жидким азотом) и инкубации 50-60 мин; - сорбцию метки на поверхности стафи лококка определяют после его разрушения 1,5% раствором детергента тритона Х-100 (20 мкл) и инкубации с меткой 50-60 мин. Учет результатов проводят следующим образом: - минимальная подавляющая концент рация антибиотика - первая доза в пробе с угнетением уровня включения радиоактив ной метки, соответствующим минимальному ее включению после ингибирования фер 11213 ментных систем стафилококка в результате криовоздейстеия; - минимальной бактерицидной концентрацией препарата является первая доза в пробе с уровнем включения, соответствую- 5 щим сорбции метки на поверхности микробной клетки после ее разрушения детергентом (пробы с серийными разведениями антибиотика). При соответствии определяемых бакте- 10 рицидных и бзктериостатических концентраций терапевтическим, культура чувствительна к антибиотику. В случае, если уровень включения в структуру исследуемых бактерий в пробах с 15 терапевтическими концентрациями антибиотиков достоверно не отличается от максимального уровня включения метки микробной клеткой в пробе с отсутствием антибиотика, можно говорить об устойчиво- 20 сти исследуемых культур к антибиотику, когда он не угнетает включение метки в структуру бактерии. Изучение лекарственной устойчивости золотистого стафилококка к гентамицину 25 проводилось параллельно предложенным способом и методом серийных разведений в жидкой питательной среде. Результаты хорошо коррелировали между собой. Таким образом, временные затраты, не- 30 обходимые для определения лекарственной устойчивости микроорганизмов, сокращены до 1,5-2 часов (в 12-13 раз), а при определении бактерицидной концентрации - в 34 раза по сраопению с прототипом, причем 35 бактериологические исследования исключены. Заявляемый метод позволяет в отличие от прототипа количественно оценить за короткое время влияние антибактериального препарата на жизнедеятельность микроор- 40 ганизмов, а также оценить антимикробное действие близких доз антибактериальных препаратов. Способ высоко эффективен, характеризуется объективностью результатов, позво- 45 ляет исследовать как монокультуру, так и ассоциации микроорганизмов в нативном клиническом материале. Способ экономически эффективен. Пример!. 50 Исходя из того, что основным механизмом действия рифампицина на микроорганизмы является торможение зависимой от ДНК- и РНК-полимеразы и торможение включения урацила и других нуклеотидов в 55 структуры микробной клетки, для определения устойчивости к рифампицину золотистого стафилококка в качестве радиоактивной метки выбора Н-тимидин. Для определения устойчивости стафилококка к рифампицину к суспензии золотистого стафилококка (штамм 209) в конечной концентрации 10 в мп в объеме 0,2 мл с рифампицинсм в серийных разведениях добавляли по 5 мкл !Н-тимидина (2 мккюри на мл; уд.активностью 350 ГБК на мл) и инкубировали 50-60 мин при 37°С. Максимальное включение метки стафилококком за время инкубации определяли без внесения антибиотика в систему. Минимальное включение метки при ингибировании ферментных систем стафилококка определяли после криовоздействия на него в течение 5 мин жидким азотом Сорбцию метки на поверхности стафилококка определяли после ею разрушения 1,5% раствором детергента тритона Х-100 (20 мкл). Невключившуюся метку удаляли трехкратным центрифугированием при 10 тыс. об/мин по 10 мин. Во все пробы вносили по20мкл 1,5% раствора детергента тритона Х-100 и образцы количественно переносили в сцинтиляционные флаконы, содержащие по 10 мл сцинтилятора ЖС-8. Пробы просчитывали на сцинтиляционном счетчике LS-7800 Весгпап (Австрия) вычитанием фона флаконов. Захват метки бактериями получали в имп/мин. Как видно нз рис 3, стафилококк (штамм 209) не обладает лекарственной устойчивостью к рифампицину, так как определяемые бактериостатические и бактерицидные дозы соответствуют терапевтическим. Бактериостатическая доза рифампицина по отношению к золотистому стафилококку шт.209 0,0005 мг (столбик 5 на рис.3), так как захват метки стафилококком в пробе с 0,0005 мг соответствует минимальному включению метки после ингибирования ферментных систем криовоздействием Бактерицидная доза препарата 0,01 мг (рис.3 ст.8), так как уровень радиоактивности в пробе 0,01 мг соответствует сорбции метки на поверхности стафилококка. П р и м е р 2. Для сравнительной характеристики лекарственной устойчивости золотистого стафилококка шт.209 к гентамицину и его липосомальной форме (получена согласно методу А.Д Базавлюка, 1989) осуществляли манипуляции, описанные в примере 1, в результате которых по учету незначительной динамики в активности микроорганизмов было установлено, что стафилококк более устойчив к действию гентамицина, чем его липосомальной формы. Из рис.4 видно, что бактериостатическая и бактерицидная концентрации липосомальной формы гентамицина (ст.4 и 8 на рис 4) в 5 раз ниже, 11213 8 чем его нелипосомальной формы (ст.5 и 9 на биоптата раны разводят изотоническим расрис.4). твором поваренной соли из расчета '\'Ю и Изучение лекарственной устойчивости центрифугируют при 1,5-2 тыс. оборотов в золотистого стафипококка к гентамицину течение 10-15 мин приТ+4+6°С, надосадочпроводилось параллельно методом серий- 5 ную жидкость декантируют, образуя из нее ны< разведений в жидкой питательной сресуспензионную систему (объем 0,2 мл) с теде. Результаты хорошо коррелировали рапевтической концентрацией стрептомимежду собой. цина и 5 мкл (2 мккюри на мл) 3Н-тимидина П р и м е р 3. и инкубируют 50-60 минут, Обработку и подДля определения антибиотикорезистен- 10 счет проб производят аналогично описаннотности микрофлоры в ране у больного Г. с му в примере 1. Из рис.5 видно, что диагнозом острый парапроктит к стрептомимикрофлора в ране у больного Г. является цину (при бактериоскопии нативного матерезистентной к стрептомицину, так как терариала установлено наличие Грам палочек и певтическая концентрация его не действует кокков), 1 г гомогенизированной ткани из 15 на микроорганизмы. имлДг г І0С0'; LOCO "С О Г" J_____ 0,0001 0,OL05 l,0l'I 0,005 0,01 0,05 КОНЦ.'-'Г Рис.Ь имп/мин Г г* v ' f 1ІЄ "... OvJMcJi орма 1 _ !_- ли .JOOM-JII наг. , ~ 5 " - г ? м т - in ' г * ' ' J. - г ~f-, f 5| 0,0001 0,0 ( 0 і ^ і Рис. " O h Li . 'T 11213 1 —І У.ЯКС мин Ї-ІГ Рис. Упорядник Замовлення 4053 Техред М.Моргентал Коректор Я. Филь Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.Гагаріна, 101