Спосіб стерилізації вегетативних бруньок juglans regia l. при введенні в культуру in vitro

Реферат: Спосіб стерилізації вегетативних бруньок Juglans regia L. для введення в культуру in vitro послідовно включає промивку пагонів детергентами та проточною водою, обробку в серії стерилізуючих агентів (один з яких 96 % етанол з додаванням Твін-60 у співвідношенні 1001 2±0,1 хв.), відмивку біологічного матеріалу від них і вилучення ізольованих із бруньок ділянок у розчині стерильної аскорбінової кислоти, висадку на живильне середовище з антиоксидантами. Перед стерилізацією здерев'янілі пагони волоського горіха (ізольовані із дорослої рослини в грудні-січні) попередньо витримують при 4 °С впродовж не менше 2-х тижнів, як другий агент для стерилізації використовують 0,05 % водний розчин хлоргексидину біглюконату (13±0,1 хв.), п'ятиразове відмивання здійснюють по 10±0,1 хв. у 0,2 % розчині стерильної аскорбінової кислоти, вилучення експланту проводять у 5 % розчині аскорбінової кислоти, висаджують його на стерильне модифіковане живильне середовище DKW (містить 0,2 г/л аскорбінової кислоти, 60 мг/л цистеїну, 2,5 г/л цефтріаксону та 2,5 мг/л мірамістину, культивують сім днів у темряві при температурі 22±1 °С і надалі при 16-ти годинному фотоперіоді, перші дві доби експланти двічі переносять на таке ж свіже живильне середовище, відсікаючи за необхідності окислені тканини місця зрізу, а через десять днів культивування з нього виключають протимікробні препарати. UA 116006 U (54) СПОСІБ СТЕРИЛІЗАЦІЇ ВЕГЕТАТИВНИХ БРУНЬОК JUGLANS REGIA L. ПРИ ВВЕДЕННІ В КУЛЬТУРУ IN VITRO UA 116006 U UA 116006 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнології і може бути використана для мікроклонального розмноження волоського горіха Juglans regia L. Відомо, що при введенні в культуру in vitro J. regia через інтенсивне окислення тканин рослини у процесі стерилізації як вихідний матеріал використовують сім'ядолі плоду, які після стерилізації висаджують на середовище Гамборга В5 (Зарнадзе Н.Ж. Микроклональное размножение грецкого ореха (Yuglans regia L.) путём соматического эмбриогенеза/ [Н.Ж. Зарнадзе, Н.Д. Ломтатидзе, Р.Ж. Зарнадзе и др.] // Вісн. Укр. тов-ва генетиків і селекціонерів. 2008. - Т. 6, № 1. - С. 60-64), Мурасіге-Скуга чи Драйвер-Кунжукі (Toosi S. Proliferation of Juglans regia L. by in virto embryo culture / Toosi S., Dilmagani K. // J. Cell Biol. Genet. - 2010. - Vol. 1, № 1. P. 12 19). Оскільки волоський горіх перехресно запильна рослина, суттєвим недоліком даного методу є висока ймовірність отримання рослинного матеріалу, що з відмінними від вихідної рослини властивостями. Уникнути цього можна при використанні як вихідного матеріалу для введення в культуру вегетативних бруньок грецького горіха. Як відомо, обов'язковою умовою методу культури in vitro є стерильність культивованих тканих. Загальні правила, яких дотримуються при стерилізації вихідного матеріалу (Кушнір Г.П. Мікроклональне розмноження рослин. Теорія і практика / Г.П. Кушнір, В.В. Сарнацька - К.: Наукова думка, 2005. - 270 с.), включають наступні послідовні етапи: промивку детергентами та проточною водою, обробку в серії стерилізуючих агентів (найчастіше: етанол, препарати хлору, срібла, ртуті), трикратну відмивку в стерильній дистильованій воді і посадку стерильного матеріалу на живильне середовище для культивування в умовах in vitro. Дана схема є спільною для всіх культур, однак потребує індивідуального підбору стерилізуючих агентів та експозиції стерилізації. Найбільш близьким є спосіб стерилізації сплячих бруньок видів роду Primus (Шелифост А.Е. Микроклональное размножение видов рода Prunus I A.E. Шелифост, С.С. Костышин, Р.А.Волков // Биотехнология. - 1993. - № 5. - С. 19-21), відповідно до якого стерилізації підлягають ретельно вимиті щіткою мильним розчином, прополіснуті у теплій проточній (40-60 хв) і дистильованій воді пагони з бруньками, що знаходяться у стані спокою. Схема стерилізації включає обробку 96 % етанолом, що містить Твін-60, (2±0,1 хв.) та розчином промислового препарату "Білизна" (ТУУ6-05743160.001-93) у співвідношенні 14 (15±0,1 хв.), після чого насіння тричі промивають 0,025 % стерильним розчином аскорбінової кислоти (10±0,1 хв.). Із оброблених таким чином бруньок у 0,2 % розчині аскорбінової кислоти вилучають меристематичну зону з декількома зачатковими листками і висаджують на стерильне живильне середовище, основою для приготування якого служить середовище Мурасіге-Скуга, доповнене 40 мг/л аскорбінової кислоти, 60 мг/л цистеїну, 1 мг/л ІМК та 0,5 мг/л БАП). При такій схемі стерилізації досягали 100 % вихід стерильних життєздатних експлантів. Основним недоліком даного способу (прототипу) є низький вихід стерильного матеріалу J. regia (10 %) та надзвичайно сильне окислення тканин рослини ще на етапі стерилізації, що в кінцевому результаті призводить до 100 % загибелі експлантів. Технічний результат полягає в отриманні життєздатних експлантів J. regia, вільних від мікробної контамінації, генетично однорідних вихідній батьківській формі. Суть корисної моделі полягає в тому, що при стерилізації попередньо витриманих при 4 °C впродовж не менше 2-х тижнів здерев'янілих пагонів волоського горіха (ізольованих із дорослої рослини в грудні-січні) як другий агент для стерилізації використовують фармпрепарат "Хлоргексидин" (0,05 % водний розчин хлоргексидину біглюконату, 13±0,1 хв.), надалі здійснюють п'ятиразове відмивання по 10±0,1 хв. у 0,2 % розчині стерильної аскорбінової кислоти, вилучення експланту проводять у 5 % розчині аскорбінової кислоти, а до складу модифікованого живильного середовища Драйвер-Кунжукі (DKW) вводять 0,2 г/л аскорбінової кислоти та 60 мг/л цистеїну. Особливою умовою етапу введення в культуру є триразове щодобове перенесення експлантів на свіже живильне середовище, під час якого за необхідності відсікають окислені тканини місця зрізу. Перші десять днів культивування потребують наявності у складі середовища 2,5 г/л цефтріаксону та 25 мл/л фармпрепарату "Окомістин" (у перерахунку на мірамістин 2,5 мг/л). Культивування експлантів перший тиждень здійснюють у темряві в кліматичній камері при температурі 22±1 °C, надалі рослини вирощують за тих же умов при 16ти годинному фотоперіоді. Попереднє витримування пагонів на холоді знижує інтенсивність процесів окислення тканин, які індукуються під час стерилізації біологічного матеріалу. Використання для стерилізації біглюконату хлоргексидину замість гіпохлориту натрію дозволяє суттєво уповільнити швидкість окислення тканин, ознаки якого за таких умов стерилізації розвиваються лише в останні 1-2 хвилини обробки. Подальше перешкоджання його 1 UA 116006 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 розвитку забезпечується відмиванням від стерилізуючих агентів у 0,2 % розчині аскорбінової кислоти. Тільки при проведенні вилучення тканин із бруньки у 5 % розчині аскорбінової кислоти вдається перешкодити окисленню місця зрізу. Для пригнічення окислення експланту його двічі щодоби переносять на свіже середовище того ж складу. У середовище необхідно включати антиоксиданти (аскорбінову кислоту та цистеїн), а також протимікробні препарати (цефтріаксон й окомістин - необхідна наявність у складі середовища тільки в перші 10 днів культивування). Тривалість всіх наступних пасажів становить 4-5 тижнів. Спосіб дозволяє отримати стерильні експланти J. regia, що забезпечує можливість подальшого культивування in vitro рослин, генетично ідентичних вихідній батьківській формі. На фото приведено розвиток експланту волоського горіха, ізольованого з пазушної бруньки, на модифікованому живильному середовищі DKW. Спосіб здійснюють наступним чином. Стерилізацію вихідного рослинного матеріалу (ізольованих із дорослої рослини в грудні-січні здерев'янілих пагонів волоського горіха зі сплячими бруньками, попередньо витриманих не менше 2-х тижнів при 4 °C) проводять наступним чином: пагони ретельно миють щіткою мильним розчином, прополіскують у теплій проточній (40-60 хв.) і дистильованій воді та просушують від надлишку води за допомогою фільтрувального паперу. Власне стерилізацію проводять у декілька етапів: спочатку біологічний матеріал, постійно перемішуючи, обробляють 96 % етанолом, що містить Твін 80 (2±0,1 хв., даний детергент підвищує ефективність стерилізації), а потім витримують у хлоргексидині (13±0,1 хв., біглюконат хлоргексидину взаємодіє з фосфатними групами на поверхні клітини мікроорганізмів, зміщуючи таким чином осмотичну рівновагу і викликаючи загибель клітин). Використання хлоргексидину дозволяє суттєво уповільнити розвиток окислення, що є основною перешкодою при роботі з J. regia. Надалі здійснюють п'ятиразове відмивання по 10±0,1 хв. у х 0,2 % розчині стерильної аскорбінової кислоти. Вилучення експланту проводять при 20 збільшенні у 5 % розчині аскорбінової кислоти. Експланти, що являють собою меристематичну ділянку із декількома зачатковими листками, переносять на живильне середовище DKW, яке додатково містить 0,2 г/л аскорбінової кислоти, 60 мг/л цистеїну, 2,5 г/л цефтріаксону та 25 мл/л окомістину. Через добу їх переносять на свіже середовище того ж складу. При цьому за необхідності відсікають окислені тканини ділянок зрізу. Такі дії повторюють двічі, що дозволяє уникнути отруєння тканин експланту продуктами окислення. Через десять днів їх переносять на середовище, в якому відсутні протимікробні препарати; його використовують і надалі. Культивування експлантів перший тиждень здійснюють у темряві в кліматичній камері при температурі 22±1 °C і відносній вологості повітря 70 %, надалі рослини вирощують за тих же умов при 16-ти годинному фотоперіоді та інтенсивності освітлення 500-1000 лк. При такій схемі стерилізації, за умови наявності на першому етапі культивування in vitro у живильному середовищі цефтріаксону і мірамістину, досягали 80 % виходу стерильних життєздатних експлантів. Технологія мікроклонального розмноження рослин потребує дотримання постійної стерильності культивованого матеріалу. Процес введення в культуру in vitro починається зі стерилізації вихідного рослинного матеріалу. Для отримання первинних експлантів вихідний матеріал стерилізують за загально принятою схемою, що включає використання детергентів, стерилізуючих агентів та багаторазове відмивання від них у стерильній дистильованій воді. їх вибір залежить від видових та фізіологічних особливостей вихідного біологічного матеріалу. Це вимагає щоразу апробації цілої серії стерилізуючих речовин на предмет можливості та доцільності їх використання. Для досягнення оптимальних результатів стерилізації рослинного матеріалу, як правило, використовують комбінації декількох стерилізуючи речовин. Нами апробовано різні схеми стерилізації, що відрізнялися як за використаними стерилізуючими агентами, так і за їх концентрацією, співвідношенням та тривалістю обробки (табл. 1). 2 UA 116006 U Таблиця 1 Схеми стерилізації вегетативних бруньок J. regia при введенні в культуру in vitro прототип - 96 % етанол + Твін60(2±0,1хв.); промисловий препарат "Білизна" 14(15±0,1 хв.); - триразова відмивка 0,025 % стерильним розчином аскорбінової кислоти (10±0,1 хв.) 100 % зараження й окислення експлантів 5 10 15 20 25 Схеми стерилізації №1 №2 - 96 % етанол + Твін - 96 % етанол + Твін 80(2±0,1хв.); 80(2±0,1хв.); промисловий препарат l%AgNO3 (8±0,1 хв.); "Білизна" 13(10±0,1 10 %Н2О2 (10±0,1 хв.); хв.); - триразова - триразова відмивка відмивка 0,1 % 0,1 % стерильним стерильним розчином розчином аскорбінової аскорбінової кислоти кислоти (10±0,1 хв.) (10±0,1 хв.) 100 % вихід 10 % вихід стерильних стерильних експлантів, 100 % експлантів, 100 % загибель через загибель через окислення окислення №3 - 96 % етанол + Твін 80(2±0,1 хв.); хлоргексидин (13±0,1 хв.); - п'ятиразова відмивка 0,2 % стерильним розчином аскорбінової кислоти (10±0,1 хв.) 80 % стерильних життєздатних експлантів На першому етапі підбору схеми стерилізації пагонів J. regia нами була застосована схема прототипу, що, однак, абсолютно не придатна для роботи з даним об'єктом. Збільшення концентрації гіпохлориту натрію, хоча і дозволило досягти часткового виходу стерильного матеріалу, однак інтенсифікувало його окислення. При використанні другої схеми стерилізації, не зважаючи на досягнення 100 % стерильності, через інтенсивне окислення тканин експлантів також відбувалася їх загибель. Отримати жизттєздатні експланти вдалося тільки при використання як другої стерилізуючої речовини хлоргексидину. За таких умов розвиток окислення тканин спостерігається тільки в останні 1-2 хв обробки. За основу для приготування поживних середовищ при введенні волоського горіха в культуру in vitro використовували середовища Мурасіге-Скуга (MS) та DKW. Основні перешкоди, що виникали при перенесенні на середовище - це низький відсоток виходу стерильних життєздатних експлантів та неможливість уникнення інтенсивного розвитку їх окислення. Для їх усунення до складу живильних середовищ додавали антиоксиданти та протимікробні засоби (табл. 2). Досягти задовільного позитивного результату вдалося тільки за умови використання третьої схеми стерилізації (див. табл. 1) та модифікованого живильного середовища DKW (табл. 2, № 2). Часткова загибель рослинного матеріалу, що мала місце при культивуванні за таких умов, відбувалася у перші 3-5 днів через розвиток окислення тканин окремих експлантів. Живильне середовище готують за загально прийнятою схемою, додають 60 мг/л цистеїну і доводять рН до 6,2; закривають фольгою й автоклавують 35 хв. при 1,1 атм і температурі 121 °C. При зниженні температури стерильного середовища до 50 °C у нього додають стерильну аскорбінову кислоту, цефтріаксон та окомістин до кінцевих концентрацій 0.2, 2.5 г/л та 25 мл/л відповідно і розливають у стерильні пробірки. Таблиця 2 Склад живильних середовищ, використаних для введення Juglans regia L. в культуру in vitro Схема стерилізації прототип №1 №3 Особливості компонентного складу живильних середовищ MS, доповнене: аскорбіновою кислотою, 0,04 г/л; - цистеїном, 60 мг/л; - ІМК, 1 мг/л; - БАП, 0,5 мг/л DKW, доповнене: аскорбіновою кислотою, 0,2 г/л; цистеїном, 60 мг/л; ІМК, 0,1 мг/л; - БАП, 1 мг/л Результат негативний негативний DKW, доповнене: аскорбіновою кислотою, 0,2 г/л; - цистеїном, 60 мг/л; цефтріаксоном, 2,5 г/л мірамістином, 2,5 мг/л; ГМК, 0,1 мг/л; - БАП, 1 мг/л 80 % життєздатних експлантів 3 UA 116006 U 5 10 Для усунення подальшого розвитку окислення тканин експлантів їх двічі щодобово пересаджують на свіже середовище того ж складу; перший тиждень культивування здійснюють у темряві. Після десяти днів вирощування експланти переносять на живильне середовище, з якого вилучені протимікробні препарати. При дотриманні описаних умов через 15-20 днів спостерігається індукція розвитку пагонів. Джерела інформації:: 1. Зарнадзе Н.Ж. Микроклональное размножение грецкого креха (Yuglans regia L.) путём соматического эмбриогенеза/ [Н.Ж. Зарнадзе, Н.Д. Ломтатидзе, Р.Ж. Зарнадзе и др.] // Вісн. Укр. тов-ва генетиків і селекціонерів. - 2008. - Т. 6, № 1. - С. 60-64. 2. Кушнір Г.П. Мікроклональне розмноження рослин. Теорія і практика / Г.П. Кушнір, В.В. Сарнацька. - К.: Наукова думка, 2005. - 270 с 3. Toosi S. Proliferation of Juglans regia L. by in virto embryo culture / Toosi S., DilmaganiK.//J. Cell Biol. Genet. - 2010. - Vol. 1, № l. - P. 12-19. 15 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 30 Спосіб стерилізації вегетативних бруньок Juglans regia L. для введення в культуру in vitro, що послідовно включає промивку пагонів детергентами та проточною водою, обробку в серії стерилізуючих агентів (один з яких 96 % етанол з додаванням Твін-60 у співвідношенні 1001 2±0,1 хв.), відмивку біологічного матеріалу від них і вилучення ізольованих із бруньок ділянок у розчині стерильної аскорбінової кислоти, висадку на живильне середовище з антиоксидантами, який відрізняється тим, що перед стерилізацією здерев'янілі пагони волоського горіха (ізольовані із дорослої рослини в грудні-січні) попередньо витримують при 4 °С впродовж не менше 2-х тижнів, як другий агент для стерилізації використовують 0,05 % водний розчин хлоргексидину біглюконату (13±0,1 хв.), п'ятиразове відмивання здійснюють по 10±0,1 хв. у 0,2 % розчині стерильної аскорбінової кислоти, вилучення експланту проводять у 5 % розчині аскорбінової кислоти, висаджують його на стерильне модифіковане живильне середовище DKW (містить 0,2 г/л аскорбінової кислоти, 60 мг/л цистеїну, 2,5 г/л цефтріаксону та 2,5 мг/л мірамістину, культивують сім днів у темряві при температурі 22±1 °С і надалі при 16-ти годинному фотоперіоді, перші дві доби експланти двічі переносять на таке ж свіже живильне середовище, відсікаючи за необхідності окислені тканини місця зрізу, а через десять днів культивування з нього виключають протимікробні препарати. Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4