Спосіб стерилізації насіння ligularia sibirica (l.) cаss. для введення в культуру in vitro

Реферат: Спосіб стерилізації насіння Ligularia sibirica (L.) Cass. для введення в культуру in vitro, що послідовно включає промивку насіння детергентами та проточною водою, обробку насіння в серії стерилізуючих агентів, трикратну відмивку насіння в стерильній дистильованій воді і висадку насіння на поживне середовище; при якому насіння, після промивки детергентом та протічною водою, знезаражують 1 % розчином KМnO4 (30±1 хв.) і залишають для набухання в дистильованій воді (24±0,1 год.), почергово обробляють замочене насіння стерилізуючими агентами: 96 % етанолом з додаванням Твін-80 у співвідношенні 100×1 (3±0,1 хв.), розчином гіпохлориду натрію, збагаченим активним хлором (промисловий препарат "Білизна", ТУУ605743160.001-93) у співвідношенні 1×3 (10±0,1 хв.) та розчином 10 % Н2О2 (10±0,1 хв.), причому, після обробки другим стерилізуючим агентом насіння додатково промивають у стерильному 0,025 % розчині аскорбінової кислоти (2±0,1 хв.), трикратну відмивку насіння від дії стерилізуючих агентів проводять у стерильному 0,025 % розчині аскорбінової кислоти (по 10±0,1 хв.) та висаджують стерильне насіння на безгормональне поживне середовище Мурасіге-Скуга, що містить 60 мг/л цистеїну. UA 81681 U (54) СПОСІБ СТЕРИЛІЗАЦІЇ НАСІННЯ LIGULARIA SIBIRICA (L.) CАSS. ДЛЯ ВВЕДЕННЯ В КУЛЬТУРУ IN VITRO UA 81681 U UA 81681 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології і може бути використана для масового розмноження рідкісного вразливого виду Ligularia sibirica (L.) Cass. Для більшості трав'янистих культур відомий спосіб стерилізації насіння (Кушнір Г.П. Мікроклональне розмноження рослин. Теорія і практика / Г.П. Кушнір, В.В. Сарнацька - К.: Наукова думка, 2005. - 270 с.), що включає наступні послідовні етапи: промивку насіння детергентами та протічною водою, обробку насіння в серії стерилізуючих агентів (найчастіше етанол, препарати хлору, срібла, ртуті), трикратну відмивку насіння в стерильній дистильованій воді і посадку стерильного насіння на поживне середовище для культивування в умовах in vitro. Дана схема є загальною для всіх культур і потребує індивідуального підбору стерилізуючих агентів та експозиції стерилізації. Найбільш близьким є спосіб стерилізації насіння L. sibirica (L.) Cass. (Klavina D., Gailite A. Tissue culture technology in conservation of threatened plant species of Latvia // Acta Universitatis Latvienses, Biology.-2004. - Vol. 676. - P. 183-188), відповідно до якого сухе (попередньо незамочене) насіння промивають детергентом, обробляють стерилізуючим агентом концентрованим промисловим хлорвмісним препаратом АСЕ (7-20 хв.), надалі насіння тричі (по 10 хв.) промивають стерильною дистильованою водою. Для проростання насіння висаджують на безгормональне та/або доповнене фітогормонами середовище Мурасіге-Скуга. При такій схемі стерилізації автори спостерігали 67 % виходу стерильного насіння, яке проростало протягом 30 перших діб після висадки на поживне середовище. Основним недоліком даного способу (прототипу) є його низька відтворюваність і 100 % окислення проростків, що поступово призводить до загибелі матеріалу. При нашій спробі застосувати дану схему стерилізації для насіння L. sibirica (L.) Cass. відмічено негативний вплив високих концентрацій хлорвмісного препарату АСЕ на насіння, що проявлялось у низькому відсотку виходу життєздатних експлантів. Технічний результат полягає в підвищенні виходу життєздатного стерильного насіння, вільного від контамінантної мікрофлори. Суть корисної моделі полягає в тому, що для стерилізації насіння L. sibirica, яка включає промивку насіння детергентами та протічною водою, обробку насіння в серії стерилізуючих агентів та трикратну відмивку насіння в стерильній дистильованій воді і висадку стерильного насіння на поживне середовище для культивування in vitro, насіння після промивки детергентом та протічною водою попередньо знезаражують 1 % розчином KМnО4 (30±1 хв.) і витримують в дистильованій воді для набухання (24±0,1 год.), обробку стерилізаційними агентами проводять послідовно за допомогою 96 % етанолу з додаванням Твін-80 100×1 (3±0,1 хв.), розчину гіпохлориду натрію, збагаченого активним хлором (промисловий препарат "Білизна", ТУУ605743160.001-93) у співвідношенні 1×3 (10±0,1 хв.), після чого насіння промивають 0,025 % стерильним розчином аскорбінової кислоти (2±0,1 хв.), надалі насіння стерилізують 10 % Н2О2 (10±0,1 хв.) і повторно промивають тричі у 0,025 % стерильному розчині аскорбінової кислоти (по 10±0,1 хв.), оброблене таким чином насіння висаджують на безгормональне поживне середовище Мурасіге-Скуга, що обов'язково повинно містити 60 мг/л цистеїну. Культивування експлантів здійснюють у кліматичній камері при 16-годинному фотоперіоді та температурі 21±2 °C. Застосування 1 % розчину KМnО4 для попереднього знезаражування насіння дозволяє уникнути подальшої оброки сильнодіючими стерілізуючими агентами, зокрема сполуками ртуті. Замочування у воді призводить до набухання насіння, що забезпечує вирівнювання насіннєвих покривів і забезпечує рівномірне проникнення стерилізуючих агентів та високу ефективність їх дії. Введення додаткового проміжного етапу відмивки рослинного матеріалу (насіння) дозволяє зменшити вплив хлорвмісних препаратів на насіннєві покриви та попередити окислення біологічного матеріалу. При культивуванні L. sibirica потрібно застосовувати, як антиоксидант, цистеїн у кількості 60 мг/л, що запобігає загибелі експлантів від окислення. Збільшення температурних меж культивування до 25-27 °C призводить до зниження росту експлантів та зменшення коефіцієнту розмноження. Спосіб дозволяє отримати стерильне насіння для введення в культуру in vitro та подальше культивування вільних від інфекцій рослин. На фігурі 1 приведено проростання насіння і отримання первинних експлантів L. sibirica на безгормональному середовищі Мурасіге-Скуга. На фігурі 2 приведено ріст експлантів L. sibirica на середовищі з 0,1 мг/л IOК та 1 мг/л БАП. Спосіб здійснюють наступним чином. У вимиті і висушені ємкості наливають 20 мл агаризованого середовища, закривають фольгою та автоклавують 35 хв. при 1,1 атм і 1 UA 81681 U 5 10 15 20 25 30 температурі 121 °C. Стерилізацію проводять в умовах ламінар-боксу, у стерильних хімічних склянках, накриваючи їх чашками Петрі. Стерилізацію вихідного рослинного матеріалу (насіння) L. sibirica проводять наступним чином: насіння попередньо обробляють 1 % розчином KМnО4 протягом 30 хв., а потім замочують у дистильованій воді для набухання на одну добу. Власне стерилізацію проводять у декілька етапів: спочатку насіння обробляють 96 %-м етанолом, що містить Твін 80 (даний детергент підвищує ефективність стерилізації), а надалі витримують у розчині препарату "Білизна" (розведення 1:3). На цьому етапі необхідно прополіскувати матеріал стерильним 0,025 % розчином аскорбінової кислоти. Це дозволяє зменшити окислення насіння, що виникає за дії гіпохлориду натрію. Промиті стерильною водою мішечки з насінням просушують від надлишку води за допомогою стерильного фільтрувального паперу. Надалі застосовують останню стерилізуючу речовину - 10 %-й розчин Н2О2 (10±0,1 хв.). Простерилізоване насіння тричі (по 10 хв.) промивають стерильним 0,025 % розчином аскорбінової кислоти. Оброблене таким чином насіння висаджують на безгормональне середовище Мурасіге-Скуга, доповнене 60 мг/л цистеїном. Тільки при дотриманні таких рекомендацій вдається досягти стовідсоткової стерильності посадкового матеріалу, що забезпечило у подальшому виживання проростків in vitro. Після проростання первинні експланти для індукції утворення конгломерату пагонів пересаджують на середовище Мурасіге-Скуга, що містить 1 мг/л БАЛ та 0,1 мг/л IOК. Культивування проводять в кліматичній камері (21±1 °C, відносна вологість повітря 70 %, інтенсивність освітлення 2000-3000 лк і 16-годинний фотоперіод) при тривалості пасажу 28 днів. Технологія мікроклонального розмноження рослин потребує підтримки постійної стерильності культивованого матеріалу. Процес введення в культуру in vitro починається зі стерилізації вихідного рослинного матеріалу. Для отримання первинних експлантів насіння стерилізують за загально прийнятою схемою, що включає залучення детергентів, стерилізуючих агентів та багатократну промивку у стерильній дистильованій воді. Однак для кожного нового виду рослин, з яким починає працювати дослідник, існує необхідність попереднього підбору стерилізуючих агентів та експозиції стерилізації. Для досягнення оптимальних наслідків стерилізації рослинного матеріалу, як правило, використовують комбінації декількох стерилізуючих речовин. Нами апробовано різні схеми стерилізації, що відрізнялися як за використаними стерилізуючими агентами, так і за їх концентрацією, співвідношенням та тривалістю обробки (табл. 1). Таблиця 1 Схеми стерилізації насіння L. sibirica прототип промисловий препарат АСЕ (7-20 хв.) дистильована вода (тричі по 10 хв.) 50 % виходу стерильного матеріалу, 100 % окислення матеріалу 35 Схеми стерилізації №1 №2 96 % етанол + Tвін- 96 % етанол + Tвін-80 80 (2 хв.) (2 хв.) промисловий промисловий препарат "Білизна" 1:4 препарат "Білизна" (15 хв.) 1:4 (10 хв.) 1 % AgNO3 (15 xв.) дистильована вода + 10 % Н2О2 (15 хв.) аскорбінова кислота дистильована вода + (тричі по 10 хв.) аскорбінова кислота (тричі по 10 хв.) 100 % зараження 100 % зараження насіння, 100 % насіння, 100 % окислення матеріалу окислення матеріалу №3 1 % KМnО4 (30 хв.) дистильована вода (24 год.) 96 % етанол + Tвін-80 (3 хв.) промисловий препарат "Білизна" 1:3 (10 хв.) дистильована вода + аскорбінова кислота (2 хв.) 10 % Н2О2 (10 хв.) дистильована вода + аскорбінова кислота (тричі по 10 хв.) 100 % стерильного матеріалу На першому етапі підбору схеми стерилізації насіння L. sibirica нами були застосовані прототип та схема стерилізації, наведена у таблиці під прописом № 1. Однак, при такій обробці не вдалося досягти стерильності насіння та спостерігалось його окислення, що призводило до 100 % загибелі рослинного матеріалу. Заміна окремих стерилізуючих компонентів, зміна їх 2 UA 81681 U 5 10 15 20 концентрації та тривалості обробки не дозволила досягти позитивного результату. При використанні схеми-прототипу тільки для 50 % насіння вдалося досягти повної стерилізації, однак при його проростанні (30-40 днів) спостерігалось окислення експлантів та їх поступова загибель. На нашу думку, тільки додаткова попередня стерилізація 1 % розчином KМnО4 та подальше замочування насіння у дистильованій воді, дозволило досягти значного підвищення дії стерилізуючих речовин. Крім того, нами запропонована додаткова проміжна промивка стерильним 0,025 % розчином аскорбінової кислоти після першого етапу стерилізації, що дозволили різко знизити інтенсивність окислення на наступному етапі стерилізації. Саме при застосуванні схеми стерилізації № 3 вдалося досягти 100 % виходу асептичного матеріалу. Така тривалість обробки насіння забезпечує мінімально можливе окислення матеріалу при досягненні його максимальної стерилізації. За основу приготування поживного середовища, нами було вибране середовище МурасігеСкуга, яке є оптимальним для індукції морфогенезу у більшості рослин і містить іони двовалентного заліза. Стерильне насіння висаджують на поживне середовище, що містить макро- і мікроелементи за Мурасіге-Скугом, Fe-хелат, 30 г/л сахарози, вітаміни за Уайтом агар-агар і доповнене 60 мг/л цистеїну та фітогормонами (табл. 2). Появу пагонів L. sibirica з двома справжніми листками спостерігали на 10-14 день культивування (Фіг. 1), тоді як при застосуванні для схеми стерилізації насіння прототипу цей термін становить близько 30 днів. Таблиця 2 Гормональний склад поживних середовищ, використаних для культивування L. sibirica Середовище S0 S1 25 30 35 IOK 0,1 мг/л БАП 1 мг/л Застосування для введення в культуру для формування конгломерату пагонів Впродовж першого пасажу висаджені експланти формували конгломерат пагонів. Частота регенерації рослин на цих середовищах становила 100 %. Наприкінці першого пасажу коефіцієнт розмноження експлантів L. sibirica, культивованих на поживних середовищах з 0,1 мг/л IOК на фоні 1 мг/л БАП, зафіксований у межах 3 (Фіг. 2). Із урахуванням виснаження середовища та накопичення в ньому фенольних сполук та з метою усунення окислення рослинного матеріалу у поживне середовище необхідно додавати цистеїн у концентрації 60 мг/л. Отримані проростки L. sibirica легко адаптуються до умов in vitro, що забезпечує їх ефективне розмноження та тривале субкультивування. Джерела інформації: 1. Кушнір Г.П. Мікроклональне розмноження рослин. Теорія і практика / Г.П. Кушнір, В.В. Сарнацька. - К.: Наукова думка, 2005. - 270 с. 2. Klavina D., Gailite A. Tissue culture technology in conservation of threatened plant species of Latvia // Acta Universitatis Latvienses, Biology.-2004. - Vol. 676. - P. 183-188. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 45 50 Спосіб стерилізації насіння Ligularia sibirica (L.) Cass. для введення в культуру in vitro, що послідовно включає промивку насіння детергентами та проточною водою, обробку насіння в серії стерилізуючих агентів, трикратну відмивку насіння в стерильній дистильованій воді, і висадку насіння на поживне середовище; який відрізняється тим, що насіння, після промивки детергентом та протічною водою, знезаражують 1 % розчином KМnO4 (30±1 хв.) і залишають для набухання в дистильованій воді (24±0,1 год.), почергово обробляють замочене насіння стерилізуючими агентами: 96 % етанолом з додаванням Твін-80 у співвідношенні 100×1 (3±0,1 хв.), розчином гіпохлориду натрію, збагаченим активним хлором (промисловий препарат "Білизна", ТУУ6-05743160.001-93) у співвідношенні 1×3 (10±0,1 хв.) та розчином 10 % Н2О2 (10±0,1 хв.), причому, після обробки другим стерилізуючим агентом насіння додатково промивають у стерильному 0,025 % розчині аскорбінової кислоти (2±0,1 хв.), трикратну відмивку насіння від дії стерилізуючих агентів проводять у стерильному 0,025 % розчині аскорбінової кислоти (по 10±0,1 хв.) та висаджують стерильне насіння на безгормональне поживне середовище Мурасіге-Скуга, що містить 60 мг/л цистеїну. 3 UA 81681 U Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4