Спосіб одержання комплексу полісахаридів з імуномодулюючою активністю

Реферат: Спосіб одержання комплексу полісахаридів з імуномодулюючою активністю шляхом багаторазової екстракції рослинної сировини гарячою водою, фільтруванням, упарюванням під вакуумом, відділенням комплексу, центрифугуванням, сушінням та подрібненням, причому як рослинну сировину використовують листки та квітки вероніки широколистої (Veronica teucrium L.), екстракцію проводять при загальному співвідношенні сировина:екстрагент 1:18-1:27, тричі по 30 хвилин при температурі 60 °C, а відділення комплексу шляхом висаджування за допомогою 90-96 % спирту етилового. UA 117540 U (12) UA 117540 U UA 117540 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до хіміко-фармацевтичної галузі, а саме до способів одержання з рослинної сировини біологічно активних комплексів з імуномодулюючою активністю, які можуть бути використані як субстанції для створення лікарських засобів зазначеної фармакологічної активності у різних лікарських формах. На фармацевтичному ринку України представлено невелику кількість препаратів рослинного походження, що коригують процеси імунітету, серед яких широко відомі препарати на основі ехінацеї пурпурової та ехінацеї вузьколистої [1]. Тому, для медицини та фармації є актуальним пошук та розробка вітчизняних ефективних лікарських засобів рослинного походження з м'якою імуномодулюючою активністю та низькою токсичністю. Відомий спосіб одержання засобу з антимікробною та імуностимулюючою активністю з листя або кореня лопуха великого [2] шляхом багаторазової екстракції рослинної сировини спиртом етиловим. Незважаючи на досить високий вихід цільового продукту (30-40 %), автори використовують 40 % спирт етиловий, тобто одержують екстракт, який містить не тільки білково-полісахаридний комплекс (БПК), а також фенольні сполуки, крім того, час екстракції триває досить довго - 12 год. Відомий спосіб комплексної переробки трави маренки восьмилисткової [3] з метою отримання імуномодулюючого засобу шляхом попередньої багаторазової послідовної обробки рослинної сировини органічними розчинниками - хлороформом та сумішшю етилацетат:спирт (8:2), з наступною екстракцією шроту водою тричі по 30 хв. Видаленням БПК шляхом висаджування за допомогою 96 % етанолу та упарювання отриманого фільтрату до видалення екстрагенту. Незважаючи на всі безперечні переваги корисної моделі, він містить складний технологічний процес з використанням органічних розчинників, який неможливо скоротити задля отримання цільового продукту, а саме БПК. Відомий спосіб одержання комплексу полісахаридів протиалергійної дії [4], який полягає в трикратній екстракції листя смородини чорної водою протягом 3 год. при постійно підтримуваній температурі (90 °C) та при перемішуванні, полісахаридний комплекс виділяють 92-95 % етанолом, очищають, сушать та подрібнюють. Відомий також спосіб одержання БПК з фіалки триколірної та/або фіалки польової [5, 6] методом дробної мацерації: сировину екстрагують десятикратною кількістю води при температурі 90 °C протягом 6-8 год. з наступним осадженням суми полісахаридів 96 % спиртом етиловим та сушкою. Недоліком вищезазначених способів можна вважати проведення екстракції при високій температурі протягом декількох годин, що потребує додаткових витрат енергії на підігрів екстрагента і підтримання постійної високої температури у екстракторі. Найближчім аналогом корисної моделі є спосіб одержання полісахаридів гемостатичної та протизапальної дії [7] шляхом двократної екстракції листя акації білої водою при постійній температурі 90 °C та співвідношенні сировина:екстрагент 1:14-15 протягом 2-3 год. Об'єднані зливи концентрують до 1/15 початкового об'єму, до упареного екстракту додають трикратну кількість 95 % спирту етилового і залишають на добу до повного висадження. Осад відфільтровують, промивають спиртом етиловим, сушать і подрібнюють. Вихід готового продукту складає 5,5-7 %. Проте, спосіб потребує певних енергозатрат для підтримання досить високої температури під час екстракції. До того ж спосіб не забезпечує високий вихід готового продукту. Задачею корисної моделі є розробка способу отримання БПК з листків або з квіток вероніки широколистої для отримання засобів з вираженою імуномодулюючою активністю. Поставлена задача вирішується таким чином, що у способі одержання комплексу полісахаридів з імуномодулюючою активністю шляхом багаторазової екстракції рослинної сировини гарячою водою, фільтруванням, упарюванням під вакуумом, відділенням БПК, центрифугуванням, сушінням та подрібненням, корисною моделлю передбачено, що як рослинну сировину використовують листки та квітки вероніки широколистої (Veronica teucrium L.), екстракцію проводять при загальному співвідношенні сировина:екстрагент 1:18-1:27, тричі по 30 хвилин при температурі 60 °C, а відділення комплексу шляхом висаджування за допомогою 90-96 % спирту етилового. Згідно з умовами корисної моделі, як рослинну сировину використовують листки або квітки вероніки широколистої. Вероніка широколиста (Veronica teucrium L.) - багаторічна рослина родини Подорожникові - Plantaginaceae Juss. (раніше Scrophulariaceae Juss.), має значну сировинну базу на території України та культивується як декоративна рослина [8]. Рослина є неофіцинальною, проте широко використовується у народній медицині багатьох країн світу і проявляє відхаркувальну, протизапальну, антисептичну, кровоспинну, жовчогінну, аналгетичну 1 UA 117540 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 та ранозагоювальну активність. В народній медицині рослину частіше використовують у вигляді спиртових настойок або настоїв [9]. Відомо, що рослина містить іридоїди, флавоноїди, дубильні речовини, фенолкарбонові кислоти, кумарини та слиз. Авторами вперше встановлено виражену імуномодулюючу активність двох БПК, одержаних з листя та квіток вероніки широколистої, невідомих з джерел інформації. Експериментальним шляхом встановлено, що ефективним при здійсненні заявленого способу є використання трикратної екстракції сировини водою, при співвідношенні сировина: вода 1:18-1:27. При цьому, якщо співвідношення менше 1:18, то не забезпечується достатня екстракція БАР, що призводить до зниження фармакологічної активності та виходу цільового продукту. Якщо співвідношення більше 1:27, то це призводить до ускладнення та подовження технологічного процесу, збільшення енерговитрат. Екстракція протягом 90 хв. забезпечує максимальне вилучення сполук з сировини. Даний екстрагент забезпечує повне виділення БПК з вероніки широколистої. З метою зменшення витрат спирту етилового доцільним є концентрування водного витягу до об'єму, який рівний або в 2 рази більший ніж початкова маса сировини. Одержують субстанції рослинного походження з імуномодулюючою активністю, нетоксичні, придатні до тривалого застосування. В результаті одержують два БПК: перший з квіток темновишневого або темно-коричневого кольору, в середині темно-сірий, солодкого смаку; інший - з листків коричневого кольору та солодкого смаку [10]. БПК легко розчинні у гарячій та холодній воді, в низьких концентраціях спирту етилового (до 50 %), нерозчинні в 96 % спирті етиловому та хлороформі. Активною діючою речовиною оригінальних лікарських субстанцій є комплекс полісахаридів, одержаних з квіток та листків вероніки широколистої. БПК квіток представлений галактозою, глюкозою, фруктозою, арабінозою та ксилозою; БПК листків - глюкозою, арабінозою та в мінорній кількості галактозою, фруктозою та ксилозою. Спектрофотометричним методом встановлено кількісний вміст полісахаридів у БПК: з квіток - у перерахунку на глюкозу (λ=463 нм) складає 36,51 %; з листків - 12,54 %. Всі ознаки заявленого способу були визначені дослідним шляхом з урахуванням біологічної активності одержаних засобів, ефективності, доступності та нешкідливості реактивів, практичного відтворення за простою технологією у промислових умовах на стандартному обладнанні. Корисну модель виконують наступним чином. Заготовлену у фазі цвітіння подрібнену сировину (листки або квітки) вероніки широколистої екстрагують гарячою водою у співвідношенні сировина: екстрагент 1:18-1:27 та витримують на водяному нагрівнику при температурі 60 °C протягом 30 хв. Екстракцію проводять ще двічі. Отримані водні витяги об'єднують, фільтрують та концентрують під вакуумом до об'єму, який рівний або в 2 рази більший, ніж маса сировини. При більшому упарюванні залишок має більшу в'язкість та зменшується його текучість, що ускладнює роботу з екстрактом та збільшує його витрати в процесі виробництва. Концентрат додають до трикратного об'єму 90-96 % спирту етилового. Здійснюють центрифугування, осад відфільтровують, промивають спиртом етиловим, сушать до видалення екстрагенту та подрібнюють до гомогенної маси. Вихід цільових комплексів становить: близько 7,5-9 % з квіток, з листків - 5-6 %. Одержують субстанцію рослинного походження з вираженою імуномодулюючою активністю, нетоксичну, придатну до тривалого застосування. Для здійснення заявленого способу існує достатня вітчизняна сировинна база. Корисна модель пояснюється прикладами. Приклад 1. 1 кг заготовленої у фазу цвітіння і подрібненої сировини (квіток, листків) вероніки широколистої завантажують в екстрактор, додають 30 л гарячої води (1:27, з урахуванням коефіцієнтів поглинання) та витримують на водяному нагрівнику при температурі 60 °C протягом 30 хвилин. Екстракцію проводять ще двічі, додаючи по 20 л води. Отримані водні витяги об'єднують, фільтрують та концентрують під вакуумом до об'єму 1-2 л. Концентрат додають до 3-6 л 90-96 % спирту етилового. Здійснюють центрифугування (4500-6000 об/хв), осад відфільтровують, промивають спиртом етиловим та сушать до видалення екстрагенту (залишкова вологість до 5 %). Вихід цільового продукту становить: з квіток: 84 г, з листків - 59 г. Приклад 2. 1 кг заготовленої у фазу цвітіння і подрібненої сировини (квіток, листків) вероніки широколистої завантажують в екстрактор, додають 27 л гарячої води (1:24, з урахуванням коефіцієнтів поглинання) та витримують на водяному нагрівнику при температурі 60 °C протягом 30 хвилин. Екстракцію проводять ще двічі, додаючи по 17 л води. Отримані водні витяги об'єднують, фільтрують та концентрують під вакуумом до об'єму 1,5 л. Концентрат 2 UA 117540 U 5 10 15 20 25 30 додають до 4,5 л 90-96 % спирту етилового. Здійснюють центрифугування (4500-6000 об./хв), осад відфільтровують, промивають спиртом етиловим та сушать до видалення екстрагенту (залишкова вологість до 5 %). Вихід цільового продукту становить: з квіток: 81 г, з листків - 56 г. Приклад 3. 1 кг заготовленої у фазу цвітіння і подрібненої сировини (квіток, листків) вероніки широколистої завантажують в екстрактор, додають 24 л гарячої води (1:21, з урахуванням коефіцієнтів поглинання) та витримують на водяному нагрівнику при температурі 60 °C протягом 30 хвилин. Екстракцію проводять ще двічі, додаючи по 14 л води. Отримані водні витяги об'єднують, фільтрують та концентрують під вакуумом до об'єму 1 л. Концентрат додають до 3 л 90-96 % спирту етилового. Здійснюють центрифугування (4500-6000 об./хв), осад відфільтровують, промивають спиртом етиловим та сушать до видалення екстрагенту (залишкова вологість до 5 %). Вихід цільового продукту становить: з квіток: 78 г, з листків - 53 г. Приклад 4. Імуномодулюючу активність субстанцій з листків та квіток вероніки широколистої, одержаних за заявленим способом, вивчали in vitro в реакції макрофагальної трансформації мононуклеарів периферичної крові [11]. Первинні культури імунокомпетентних клітин одержували з гепаринізованої крові донорів шляхом відстоювання при температурі 4-8 °C. Мононуклеарні клітини крові культивували в середовищі 199 з 10 % фетальної сироватки. До живильного середовища додавали по 100 ОД/см натрієвої солі бензилпеніциліну та стрептоміцину, а також амфотеріцин В. Субстанції вносили до первинних культур імунокомпетентних клітин у кількості 5 мкг/мл, 50 мкг/мл і 100 мкг/мл та інкубували при 37 °C протягом 23 годин. З метою оцінки фагоцитарної активності макрофагів і їх попередників через 23 години культивування в культуру вносили референтний штам Staphylococcus aureus-209Р, інактивований прогріванням. Оцінку імуномодулюючої дії комплексів на імунокомпетентні клітини проводили за наступними показниками: показник макрофагальної трансформації мононуклеарів (ПМТМ), фагоцитарний індекс (ФІ) та фагоцитарне число (ФЧ) [11, 12]. Контроль об'єднував постановку реакції макрофагальної трансформації мононуклеарів периферичної крові без додавання досліджуваних субстанцій. Випробування проводили п'ятикратно. Одержані показники статистично обробляли за допомогою програми "Microsoft Excel". Результати досліджень наведено в таблиці 1. Таблиця 1 Вплив БПК листків та квіток вероніки широколистої на показники макрофагальної трансформації й фагоцитарної активності гематогенних попередників макрофагів, n=5 БПК Квіток Листків Контроль Концентрація, мкг/мл 5 50 100 5 50 100 ПМТМ, % 39,0±3,2 55,3±3,1* 52,7±4,1 34,7±4,0 51,3±4,3* 34,9±3,8 32,6±3,4 ФІ, % 56,4±4,0 68,6±3,1* 62,8±2,4 46,2±2,2 54,7±2,2* 46,8±2,5 46,4±2,8 ФЧ 11,4±1,3 12,6±1,5* 9,3±0,5 9,2±0,3 10,6±1,3* 9,3±0,5 7,6±0,6 Примітка. * - Ρ