Спосіб оцінки генотоксичних властивостей ветеринарних імунобіологічних засобів, які містять наночастинки металів

Реферат: Спосіб оцінки генотоксичних властивостей ветеринарних імунобіологічних препаратів, що містять наночастинки металів, який включає вибір і підготовку тестової культури клітин та обробку культуральних клітин в інкубаційному середовищі зразком досліджуваного засобу протягом терміну імунізуючої дії з наступним визначенням ступеня пошкодження ДІЖ методом "ДНК-комет". Як тестову культуру клітин використовують перещеплювану культуру клітин тестикул поросят (ST), яку після нарощування ресуспендують в інкубаційному середовищі. UA 117662 U (12) UA 117662 U UA 117662 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до нанобіотехнології та ветеринарної медицини, конкретно, до методів визначення безпеки речовин з використанням як індикатора ступеня ДНК-пошкоджень тестових культур клітин і може бути використана для оцінки генотоксичності різних ветеринарних імунобіологічних засобів, які містять наночастинки металів, у тому числі й на етапах їх розробки. Нанотехнології на сьогоднішній день є одним з провідних напрямків науки і техніки у всьому світі. Нанотехнології - сукупність наукових знань, способів і засобів спрямованого регульованого синтезу різних речовин, матеріалів та виробів (наноматеріалів) з лінійним розміром елементів структури у діапазоні 1-100 нм. Відповідно до загальноприйнятої термінології, до наночастинок -9 відносять частинки розмірами від 1 до 100 нанометрів (10 м). З огляду на унікальну біологічну дію таких наноматеріалів як наночастинки металів, відкриваються широкі перспективи їх використання у ветеринарії, медицині та біотехнології. Відомо, що наночастинки металів займають проміжне положення між окремими атомами й молекулами, їм присутні принципово інші порівняно з макросвітом фізичні та хімічні властивості, специфіка яких визначається відповідними законами квантової фізики: велика питома поверхня; малі розміри та різноманітність форм; збільшення хімічного потенціалу речовини; висока адсорбційна активність; висока здатність до акумуляції. Ультрамалі розміри наночастинок металів обумовлюють підвищення біодоступності, подолання біобар'єрів (гематоенцефалічного, гістогематичного, плацентарного), можливість зв'язування з нуклеїновими кислотами та білками, вбудовування у мембрани клітин, проникнення в органели зі зміною їхніх функцій. Нині наночастинки металів уже розглядають як ветеринарні субстанції та мають високий комерційний потенціал з перспективами широкомасштабного застосування. Однак, особливі фізико-хімічні та біологічні властивості наночастинок металів не тільки відкривають нові перспективи для створення нових матеріалів і застосування їх у різних галузях господарства, але й спричиняють нові ризики для людини та довкілля. Нанорозмірний стан речовини дає підстави розглядати такі об'єкти як особливий тип наноматеріалів, оцінка потенційного ризику яких для здоров'я людини та стану довкілля в усіх випадках є обов'язковою. За оцінки безпеки наноматеріалів у першу чергу варто враховувати їхній вплив на такі найважливіші біологічні характеристики як проникність біомембран, генотоксичність, цитотоксичність, мутагенність, активність окислювально-відновних процесів, біотрансформація і елімінація з організму. Вакцинація тварин - одна з найважливіших процедур у профілактиці інфекційних захворювань сільськогосподарських та домашніх тварин. В останні роки для створення ефективних ветеринарних імунобіологічних препаратів застосовують їх модифікацію наночастинками металів. Тому необхідно приділяти особливу увагу всебічному вивченню безпечності таких вакцин на етапі їх розробки та впровадження у практику ветеринарної медицини. Найважливішим показником визначення біобезпеки наноматеріалів визнано показник генотоксичності, який є надзвичайно інформативним та високопрогностичним у оцінці можливого злоякісного переродження еукаріотичних клітин та можливих змін ДНК у статевих клітинах тварин, що становить небезпеку для здоров'я нащадків. Серед відомих на даний час методів визначення генотоксичності найбільш придатним є метод лужного гель-електрофорезу ізольованих клітин або метод ДНК-комет. [Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений (Методические рекомендации. Рос.Акад.Мед.Наук., Рос.акад.сельхознаук, М.2006]. В основі методу лежить реєстрація відмінностей рухливості у постійному електричному полі ДНК та можливих фрагментів ДНК клітин тестової культури, оброблених досліджуваною речовиною, а потім лізованих та іммобілізованих в агарозний гель. Рухаючись до анода, ДНК формує електрофоретичний слід, що нагадує «хвіст комети», параметри якого залежать від рівня пошкодження молекули ДНК. Метод ДНК-комет є високочутливим і може бути застосований практично до будь-яких еукаріотичних клітин. Тому він застосовується для оцінки генотоксичних властивостей широкого кола речовин. Так, відомо про застосування методу ДНК-комет для визначення генотоксичності колоїдних нанопрепаратів на основі наночастинок золота та срібла [Шмараков І.О., Марченко М.М., Муха Ю.П., Яшан Г.Р., Смірнова Н.П., Єременко Г.М. Цито-і генотоксичний вплив колоїдних нанопрепаратів на основі Ag та Au на первинні культури клітин. Науковий вісник Чернівецького університету. Біологія (Біологічні системи). - Т. 2,Вип. 4. - 2010 - с 13-20]. Як модельні клітинні системи для тестування однониткових розривів ДНК автори вибрали первинні культури лімфоцитів, гепатоцитів та клітин карциноми Герена. Клітини виділяли з організму лабораторних тварин та інкубували у поживному середовищі. Далі у інкубаційне 1 UA 117662 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 середовище додавали наночастинки золота чи/та срібла розміром 5-20 нм та проводили кокультивування протягом 48 годин. Із закінченням культивування отримували суспензію клітин, яку використовували для приготування мікропрепаратів та подальшого виявлення пошкоджуючої дії досліджуваних наночастинок металів на ДНК методом ДНК-комет. Вивчення отриманих комп'ютерних зображень продемонструвало наявність великої кількості клітин з пошкодженою ДНК. Відомо також про застосування методу ДНК-комет для визначення генотоксичності різних наноматеріалів [Патент України на корисну модель №48540 МПК (2009.01) G01N33/00 G01N33/48. Опубл. 25.03.2010; Бюл. № 6. «Спосіб оцінки генотоксичних властивостей наноматеріалів». Автори: С.М. Дибкова, О.В. Годовський, М.Є.Романько, Грузіна Т.Г., Ульберг З.Р., Ушкалов В.О., Головко A.M.]. Спосіб включає підготовку зразка наноматеріалу для дослідження, використання як тестової культури клітин яєчника китайського хом'ячка СНО-К1, обробку підготовленої суспензії культуральних клітин в інкубаційному середовищі досліджуваним зразком протягом 0,3 - 48 годин з наступним визначенням ступеня пошкодження ДНК методом ДНК-комет. При цьому максимальну кількість засобу визначають за показником його цитотоксичності, а мінімальну - за величиною його імунізуючої дози. Автори цього способу показали достовірність визначення генотоксичності як при дослідженні наночастинок металів, так і наноматеріалів органічної природи на прикладі інактивованої вакцини проти сказу та лептоспірозу тварин, яка містила суміш частинок білкової природи зі середнім розміром 7-10 нм. Цей спосіб покладено в основу Методичних рекомендацій Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів «Оцінка біобезпеки наноматеріалів органічної та неорганічної природи методом визначення генотоксичності лужним гель-електрофорезом ізольованих еукаріотичних клітин», К., 2010 р. Спосіб визначення генотоксичності за патентом UA №48540 від 25.03.2010 р. є найбільш близьким аналогом способу, що заявляється (прототип). Задача корисної моделі є розробка способу оцінки генотоксичності імунобіологічних засобів, які містять поряд з компонентами органічної природи також наночастинки металів. Враховуючи особливості структури і властивостей наночастинок металів та їх взаємодії з компонентами ветеринарних імунобіологічних засобів, рівень їх токсичності не можна зводити до токсичності окремих компонентів вакцин, що входять до їх складу. Для об'єктивної оцінки генотоксичних властивостей ветеринарних імунобіологічних засобів, які містять наночастинки металів, необхідно забезпечити можливість безпосередньої взаємодії їх з еукаріотичною клітиною. Поставлена задача вирішене тим, що у відомому способі оцінки генотоксичності in vitro, який включає вибір і підготовку тестової культури клітин, кокультивування наночастинок та клітин у інкубаційному середовищі протягом терміну імунізуючої дії та подальше визначення рівня пошкодження ДНК методом ДНК-комет, у випадку визначення генотоксичних властивостей імунобіологічних засобів, що містять наночастинки металів, відповідно до корисної моделі, що заявляється, як тестову культуру клітин використовують надзвичайно чутливу до потенційної генотоксичної дії вакцини культуру, що отримана з репродуктивних органів сільськогосподарських тварин, а саме перещеплювальну культуру клітин тестикул поросят ST (swine testicles), яка на момент тестування перебуває у стані суспензії. При цьому інкубування суспензії клітин та імунобіологічного засобу проводять протягом не менше ніж 18 годин. Як тест-об'єкт застосовують стандартизовану перещеплювальну культуру клітин тестикул поросят ST, яка за результатами випробувань виявила високу чутливість до дії різних наночастинок металів. Перещеплювальна культура клітин тестикул поросят є доступною для дослідників і зазвичай є наявною у банках культур лабораторій, які займаються проблемами токсикології. Кількість досліджуваного імунобіологічного засобу для введення у контакт із суспензією клітин, вибирають, виходячи з відомої чи попередньо визначеної цитотоксичності in vitro, або, беручи до уваги рекомендовану дозу за його використання. За визначення генотоксичних властивостей ветеринарних імунобіологічних засобів з наночастинками металів способом, який заявляється, тестову культуру клітин у вигляді суспензії клітин у інкубаційному середовищі необхідно обробляти безпосередньо досліджуваним імунобіологічним засобом, що має дуже велике значення для отримання об'єктивних та достовірних результатів. Нижче приведені приклади застосування способу, що заявляється, для визначення генотоксичних властивостей ветеринарних вакцин з вмістом наночастинок срібла. Приклади Визначали генотоксичні властивості асоційованої ветеринарної вакцини "Мультибовісан" за патентом UA №75659 (Бюл. № 23 від 10.12.2012 р.) та вакцин, одержаних модифікацією вакцини "Мультибовісан" наночастинками срібла у кількості 1 % мас та 0,5 % мас за металом: 2 UA 117662 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 "Мультибовісан+AgNP (1 %)» та "Мультибовісан +AgNP (0,5 %)». Для введення у вакцину використовували препарати наночастинок срібла з розміром частинок 30 нм у вигляді стерильних водних колоїдних розчинів в концентрації 0,8мг/мл за металом. Для визначення безпеки вакцини актуальною є оцінка її генотоксичних властивостей у імунізуючих дозах, тому вміст її у зразку для дослідження визначали, виходячи з дози у розрахунку на 1 кг маси тіла тварини, забезпечуючи такий же вміст у 1 л інкубаційного середовища за обробки клітин тестової культури. Досліджували вакцину у товарній формі, пакувальна одиниця якої містила 2 дози. Як тестову культуру клітин використовували перещеплювальну культуру клітин тестикул поросят клітин ST. У роботі використовували одноденні культури клітин, які вирощували на середовищі DMEM+RPMI (Sigma, США) із 7-% вмістом FBS (фетальної бичачої сироватки; Sigma, США) та з додаванням антибіотиків канаміцину (Arterium, ПАТ "Київ медпрепарат", Україна) та гентаміцину (Arterium, AT "Галичфарм", Україна) у розрахунку 50 мкл та 100 мкл на 100 мл середовища відповідно. Клітини ST нарощували в атмосфері з 5 % СО2 при 37 °C до 5 титру 6·10 кл/мл. Далі клітини знімали з поживного середовища сумішшю трипсин-ЕДТА, відмивали свіжим поживним середовищем та ресуспендували в інкубаційному середовищі. Підраховували загальну кількість клітин і визначали за допомогою фарбування 0,3 % розчином трипанового синього відсоток живих клітин в інкубаційній суміші. Кількість живих клітин, визначених за допомогою фарбування 0,3-відсотковим розчином трипанового синього, складала 93 відсотки. 10 мл суспензії перещеплювальної культури клітин тестикул поросят клітин ST у інкубаційному середовищі змішували зі зразком вакцини у концентрації, яка забезпечувала імунізуючу дозу, та витримували 18годин за 37 С. Тривалість контакту визначали за показником часу імунізуючої дії вакцини, який застосовують у ветеринарній практиці, зазвичай 18-24 години. Позитивним контролем слугували клітини культури ST, оброблені розчином Nнітрозометилсечовини у концентрації 1 мМ та інкубовані протягом 18 годин за 37 С до титру 510 кл/мл. Кількість живих клітин позитивного контролю, визначених за допомогою фарбування 0,3-відсотковим розчином трипанового синього, складала 85 відсотків. Як негативний контроль виступали інтактні (не оброблені) клітини культури ST, нарощені за 5 температури 37 С протягом 18 годин до титру 5·10 кл/мл. Кількість живих клітин негативного контролю, визначених за допомогою фарбування 0,3-відсотковим розчином трипанового синього, складала 96 відсотків. Приготування мікропрепаратів клітин, оброблених досліджуваними зразками, а також клітин позитивного і негативного контролів, та їх дослідження проводили за звичайною схемою методу ДНК-комет: отримання гель-слайду, формування мікропрепарату, лізис, лужна денатурація, проведення електрофорезу, нейтралізація/фіксація, фарбування препарату, мікроскопічний аналіз. Мікроскопію мікропрепаратів здійснювали за допомогою флуоресцентного мікроскопа ("ЛЮМАМ Р8", Росія, збуджуючий фільтр 490 нм, дихроїчні дзеркала 510, відтинаючий фільтр 530 нм, збільшення 200-400Х). На кожен мікропрепарат аналізували не менш ніж 200 "ДНКкомет". Аналіз "ДНК-комет" проводили візуально, розподіляючи на п'ять умовних типів з відповідним для кожного числом від 0 до 4. Ступінь пошкодження ДНК при цьому виражали як індекс "ДНК-комет" (IДНК ) , обчислений за формулою: IДНК  0n0  1 1  2n2  3n3  4n4  /  , де n n0  n4 - число "ДНК-комет" кожного типу,  - сума "ДНК-комет" Статистичну оцінку результатів проводили, порівнюючи показники пошкодження ДНК в піддослідній та контрольній групах. Дані двох повторностей поєднували і визначали середній показник групи. Критеріями позитивного результату були статистично достовірні високі (близькі до позитивного контролю) показники пошкодження ДНК або статистично достовірний відтворений ефект. Було проаналізовано біля 200 "ДНК-комет" та одержано статистично достовірні відтворювані результати, які узагальнено та наведено у таблиці. Ці дані свідчать про те, що досліджувані ветеринарні вакцини "Мультибовісан", "Мультибовісан+AgNP (1 %)", "Мультибовісан+AgNP (0,5 %)" у імунізуючій дозі не проявляють генотоксичних властивостей. 55 3 UA 117662 U Таблиця Назва препарату вакцини Негативний контроль Позитивний контроль «Мультибовісан» «Мультибовісан+АgКР (1 %)» «Мультибовісан +AgNP(0,5 %)» Показник генотоксичності " IДНК" 0,17±0,03 1,94±0,11 0,23±0,01 0,31±0,03 0,17±0,03 Висновок про генотоксичність Не генотоксичний Генотоксичний Не генотоксичний Не генотоксичний Не генотоксичний Примітка: результати вірогідні, p