Спосіб препаративного електрофорезу протеїнів сироватки молока

Реферат: Спосіб препаративного електрофорезу протеїнів сироватки молока включає виділення сироваткових білків електрофорезом із використанням поліакриламідного гелю, як підтримуючого середовища. Електрофорез проводять у системі диск-електрофорезу. UA 120890 U (54) СПОСІБ ПРЕПАРАТИВНОГО ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ ПРОТЕЇНІВ СИРОВАТКИ МОЛОКА UA 120890 U UA 120890 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі біотехнології і може бути використана для моделювання біохімічних процесів утворення біоактивних пептидів з сироваткових білків молока, вивчення специфічності дії молокозгортальних препаратів та протеолітичних систем молочнокислих мікроорганізмів. Відомі способи виділення концентратів білків сироватки і їх очищення способами диференційного осадження, гель-фільтрацією, фільтрацією на мембранах, іонообмінною хроматографією [Fundamentals of Dairy Chemistry / N.P.Wong, R. Jenness, M. Keeney, E.H. Marth. - Aspen Publishers, Inc: Maryland, 1999. - 787 p.] (додається). Основними недоліками зазначених способів є нездатність забезпечити ефективне розділення сироваткових білків та отримання чистих, електрофоретично гомогенних фракцій, а також використання екстремальних значень рН, високих концентрацій солей, які можуть впливати на структуру і хімічний склад протеїнів сироватки. Окрім цього диференційне осадження протеїнів є багатостадійним й довготривалим процесом, що призводить до значних втрат і змін структури фракцій сироваткових білків. Для ефективного розділення протеїнів молочної сироватки із використанням іонообмінної хроматографії виникає необхідність у великогабаритному та високовартісному обладнанні. За рахунок відмінностей електрофоретичної рухливості кожної із фракцій білків молока, електрофорез можна розглядати як один із найбільш підходящих способів фракціонування протеїнів сироватки молока. Найбільш близьким технічним рішенням до запропонованого є спосіб електрофорезу протеїнів сироватки молока передбачає виділення сироваткових білків електрофорезом із використанням поліакриламідного гелю як підтримуючого середовища [Handbook of dairy foods analysis / Leo M.L. Nollet, Fidel Toldra. - CRC Press, Taylor & Francis Group: NY, 2010. - 900 p.] (додається). Недоліком даного способу є те, що у процесі підготовки препарату передбачено теплове оброблення за температур, близьких 100 °C та додавання денатуруючого реагента додецилсульфат натрію (ДСН), що спричинює денатурацію термолабільних сироваткових білків. Даний спосіб забезпечує розділення білкових фракцій молока, проте лише для аналітичного оцінювання фракційного складу. А для отримання чистих біологічних препаратів з метою їх подальшого застосування у процесах біотехнологічних виробництв чи дослідженнях цей спосіб не є доцільним. Оскільки виділені фракції сироваткових білків знаходитимуться у денатурованому стані, в якому вони не придатні наприклад для використання як попередники біологічно активних пептидів. В основу корисної моделі поставлена задача розроблення способу виділення препаративним електрофорезом високочистих основних фракцій сироваткових білків молока βлактоглобуліну (β-LG), α-лактоальбуміну (α-LA), альбуміну сироватки (BSA) та імуноглобулінів (IG)) у значних кількостях упродовж нетривалого періоду часу. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб препаративного електрофорезу протеїнів сироватки молока передбачає виділення сироваткових білків електрофорезом із використанням поліакриламідного гелю як підтримуючого середовища причому електрофорез проводять у системі диск-електрофорезу. На фіг. 1 представлена диск-електрофореграма протеїнів сироватки молока, отриманих без використання денатуруючих чинників на пластинах поліакриламідного гелю, на фіг. 2 денситограма протеїнів сироватки молока при препаративному електрофорезі із використанням ДСН, на фіг. 3 - денситограма протеїнів сироватки молока при препаративному дискелектрофорезі без використання денатуруючих чинників. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю запропонованих ознак та очікуваним технічним результатом полягає у наступному. Поліакриламідний гель широко використовується в електрофоретичних методах, які проводять для оцінки якісного та кількісного складу зразків, які містять незначну кількість протеїну. При цьому на електрофореграмі після диск-електрофорезу відображаються усі основні фракції протеїнів сироватки молока, розташовані у порядку зменшення їх електрофоретичної рухливості. За результатами досліджень саме ця електрофоретична система вибрана за основу для розроблення способу виділення фракцій протеїнів молочної сироватки препаративним електрофорезом. З метою збереження природних властивостей та біологічної активності сироваткових білків молока із системи виключено денатуруючий реагент - ДСН. Застосування при цьому дискваріанта електрофорезу створює умови для формування чіткішої межі поділу між білковими фракціями на пластинці розділяючого (поліакриламідного) гелю, отримання якісних 1 UA 120890 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 електрофореграм. Особливо важливим фактором це є для процесу фракціонування сироваткових білків молока, зважаючи на значну різницю у співвідношенні між їхніми фракціями. Для зменшення тривалості електрофорезу і полегшення процесу екстракції, було зменшено концентрацію ПААГ на 0,5 %. З метою збільшення кількості молочної сироватки у зразку здійснено модифікацію камери і формерів для поліакриламідного гелю, а також збільшено концентрацію протеїну у вихідному розчині. У результаті тривалість електрофорезу зменшено до 2 годин при цьому кількість протеїну у зразку збільшено майже у 100 разів без помітного погіршення ефективності розділення основних фракцій сироваткових білків, що підтверджено на електрофореграмі (фіг. 1). Спосіб препаративного електрофорезу протеїнів сироватки молока здійснюють таким чином. З незбираного коров'ячого молока сепаруванням отримують знежирене молоко. Сепарування проводять двічі за температур -30 і 4 °C, що дозволяє більш повно видалити ліпіди молока без втрати білків. Із знежиреного молока виділяють сироваткові білки у процесі коагуляції казеїну хлоридною (сульфатною, молочною, оцтовою) кислотою в ізоелектричній точці при рН 4,6. Казеїновий осад, що утворюється під час коагуляції, виділяють із системи шляхом центрифугування, отримуючи чисту молочну сироватку. Отриманою молочною сироваткою наповнюють електрофоретичні комірки поліакриламідного гелю. Для створення різниці потенціалів до системи подають напругу близько 500 В, при силі струму 45…50 мА, що забезпечує збереження структури фракцій сироваткових білків й унеможливлює перегрівання гелю та руйнування чітких границь між фракціями. Тривалість електрофорезу становить близько 2 год. Відділення фракцій сироваткових білків одна від одної із пластин поліакриламідного гелю слід проводити після ідентифікації їх границь поділу. Для цього із пластин гелю вирізають бічні смуги із обох боків і проводять їх фарбування 1 % -м розчином амідочорного 10 Б або розчином барвника кумасі голубого. Приклад зафарбованої смужки гелю із основними фракціями сироваткових білків: β-LG, α-LA, BSA та IG представлено на фіг. 1. Співставляючи зафарбовані смуги із пластинами гелю, здійснюють розділення пластин на окремі смужки із визначеними фракціями сироваткових білків. При цьому тривалість процесу забарвлення смужки гелю, ідентифікації фракцій і розрізання основної пластинки гелю становить менше 30 хвилин. Екстракцію β-LG, α-LA, BSA та IG із відокремлених смужок гелю проводять відповідними розчинниками, після чого піддають діалізу та ліофілізації або залишають у вигляді розчину. Приклад конкретного виконання способу Отримання молочної сироватки здійснюють із знежиреного коров'ячого молока шляхом коагуляції казеїну в ізоелектричній точці при рН 4,6 та подальшому центрифугуванні із відділенням казеїнового осаду. Отриману молочну сироватку піддають електрофоретичному розділенню за відповідних значень напруги та сили струму. Ефективність даного способу виділення фракцій протеїнів сироватки молока розкривається за допомогою наступних прикладів і рисунків. Приклад 1 (прототип). Для виділення фракцій протеїнів сироватки молока проведено препаративний електрофорез із використання ДНС у складі підтримуючого середовища у електрофоретичних камерах. У результаті електрофорезу виділено основні фракції денатурованих сироваткових білків молока, про що свідчить денситограма (фіг. 2) при цьому фракції BSA та IG розміщені надто близько одна до одної, що утруднює їхнє розділення та отримання чистих білкових фракцій. Приклад 2. Для виділення фракцій протеїнів сироватки молока проведено препаративний диск-електрофорез із використання поліакриламідного гелю як підтримуючого середовища без денатуруючих чинників у електрофоретичних камерах. У результаті диск-електрофорезу із молочної сироватки на пластинах гелю виділено чотири основні фракції. Підтвердженням цього є денситограма (фіг. 3) із чотирма характерними піками для LG, α-L-A, BSA та IG. які піддаються чіткому розділенню, Технічний результат полягає у розробленні способу виділення фракцій сироваткових білків молока препаративним електрофорезом із використання системи диск-електрофорезу без використання денатуруючих чинників, що забезпечує отримання чистих фракцій: βлактоглобуліну, α-лактоальбуміну, альбуміну сироватки та імуноглобулінів у значний кількостях за короткий проміжок часу. 2 UA 120890 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб препаративного електрофорезу протеїнів сироватки молока, що включає виділення сироваткових білків електрофорезом із використанням поліакриламідного гелю як підтримуючого середовища, який відрізняється тим, що електрофорез проводять у системі диск-електрофорезу. 3 UA 120890 U Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4