Спосіб виготовлення гіперімунної протидифтерійної сироватки

Винахід належіть до розділу біотехнології та медицини і може бути використаний для виробництва сироваточних лікувальних та профілактичних препаратів зокрема протидифтерійної сироватки. Аналогом є спосіб очистки та концентрації протидифтерійної сироватки “Діаферм-2” [Бейлинсон A.B. Антитоксические сыворотки высокой степени очистки и концентрации и разработка производственных методов их получения. - Автореф. доктор, дисс. - М„ 1955]. Цей спосіб включає ферментативний гідроліз білків початкової Імунної сироватки чи плазми пепсином (25°С, 2 год., перша година при pH 3.2, друга при pH 4.2), термоденатурацію (58°С, 45 хв. в присутності 14% сірчанокислого амонію, висолювання активних фрагментів Імуноглобулінів сірчанокислим амонієм (34%-на концентрація), проточний діаліз осаду активних білків та додаткову очистку препарату від баластних білків за допомогою повторного прогрівання при 58°С з 15-20% сірчанокислого амонію та наступним діалізом. Прототипом винаходу є спосіб одержання гіперімунної протидифтерійної сироватки "Діаферм-3" [Карпов С.П., Прегер СМ., Синельников Г.Е., Федоров Ю.В. Гипериммунные сыворотки. - Томск: Изд. ТГУ, 1976. -380 с], який включає всі стадії методу "Діаферм-2", але замість повторного прогрівання сироватки в присутності сірчанокислого амонію при 58°С для вилучення баластних білків використовують хлороформ, що забезпечує желатинізацію примісних білків в їх Ізоелектричній точці при pH 5.2-5.6. Баластний осад відділяють центрифугуванням, а прозору сироватку залужують до pH 7.0 та додають фізіологічний розчин. Завданням винаходу було розробити спосіб виготовлення лікувальної протидифтерійної сироватки, який забезпечував би більший вихід сироватки з поліпшеними фізико-хімічними та біологічними характеристиками. Суть винаходу полягає в тому, що спосіб виготовлення гіперімунної протидифтерійної сироватки, передбачаючий ферментативний гідроліз білків початкової сироватки чи плазми пепсином, виділення та очищення фракції активних фрагментів імуноглобулінів, який відрізняється тим, що ферментативний гідроліз виконують в два етапи по одній етапи по одній годині при температурі 25°С та pH 3.2 14.2 відповідно, з 100110 робочими дозами пепсину на літр розведеної сироватки, термолабільні білки та пепсин з ферментованої сироватки видаляють термоденатурацією (45 хв., 56°С) в присутності 14% сірчанокислого амонію, активні фрагменти Імуноглобулінів висолюють сірчанокислим амонієм з розрахунку 34%-ної концентрації, очистку сироватки від баластних білків проводять за допомогою гідроокису алюмінію, який додається до сироватки в кількості 2 - 2,5%. Початкову імунну протидифтерійну сироватку чи плазму з активністю не менше (500-600 ME /мл) розводять до концентрації білку не вище 3%, додають ліофілізований пепсин з розрахунку 100—110 робочих доз на літр розведеної сироватки. Після охолодження до (6-8)°С до суміші додають 8% НСІ в об'ємі, що створює pH 3.0-3.2 та Інкубують одну годину при 25°С. Одержану ферментовану суміш підлужують(10% NaOH) до pH 4.2 та ще Інкубують одну годину при тих же умовах. Для видалення термолабільних білків та пепсину до ферментованої сироватки додають 14% сірчанокислого амонію та прогрівають при 56°С протягом 45хв. Після охолодження сироватку центрифугують при 8000g, 30 хв, осад відкидають. Далі проводять висолювання активних фрагментів Імуноглобулінів для чого до ферментативної сироватки (pH 7.0-7.1) додають сірчано-кислий амоній з розрахунку 34%-ної концентрації, після повного розчинення відстоюють протягом 3 год при (6-8)°С та центрифугують 30 хв при 8000g, супернатант відкидають. Осад активних білків діалізують в проточній воді (48 год.), потім ще 6 год проти фізіологічного розчину. Очистку сконцентрованої сироватки від баластних білків проводять за допомогою гідроокису алюмінію, що додається до сироватки з розрахунку 2-2,5%. Суміш витримують при періодичному перемішуванні протягом 6 год та центрифугують при 8000g, осад відкидають. Одержану гіперімунну протидифтерійну сироватку фільтрують через глибинний фільтр з усередненим розміром пор 0,5 мкм та мембранний фільтр з ацетатної целюлози з розміром пор 0,2 мкм для забезпечення стерильності. Запропонований спосіб дає можливість одержувати протидифтерійну сироватку з Імунологічною активністю 2000 ME/мл І більше, в препараті практично відсутні домішки баластних білків, що підвищує навантаження антитіл на масовий еквівалент білку, Істотно знижує алергенність, в'язкість та поліпшує Інші хіміко-біологічні властивості.