Спосіб виділення казеїнових фракцій препаративним електрофорезом

Реферат: UA 96429 U UA 96429 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі біотехнології і може бути використана для моделювання біохімічних процесів утворення біоактивних казеїнових пептидів, вивчення специфічності дії молокозгортальних препаратів та протеолітичних систем молочнокислих мікроорганізмів. Відомими аналогами є способи виділення окремих фракцій казеїну із білків молока шляхом диференційного осадження, гель-фільтрації або іонообмінної хроматографії [Fundamentals of Dairy Chemistry /N.P. Wong, R. Jenness, M. Keeney, E.H. Marth. - Aspen Publishers, Inc: Maryland, 1999. - 787 p.]. Недоліками аналогів є нездатність забезпечити ефективне розділення казеїну та отримання електрофоретично гомогенних фракцій у зв'язку із близькими за величиною молекулярними масами фракцій казеїну. Окрім цього диференційне осадження протеїнів є багатостадійним й довготривалим процесом, що призводить до значних втрат і змін структури казеїнових фракцій. Для ефективного розділення казеїну із використанням іонообмінної хроматографії виникає необхідність у великогабаритному та високовартісному обладнанні. Найбільш близьким аналогом до корисної моделі є спосіб виділення казеїнових фракцій препаративним електрофорезом, що передбачає розділення казеїну на фракції у лужному середовищі [Fundamentals of Dairy Chemistry /N.P. Wong, R. Jenness, M. Keeney, E.H. Marth. Aspen Publishers, Inc: Maryland, 1999. - 787 p.] (додається). Недоліком найближчого аналога є можливість виділення лише трьох казеїнових фракцій (α S - казеїн, β - казеїн,  - казеїн), при цьому фракція S - казеїн складається із суміші S1 та а S2 казеїну, які відрізняються своєю первинною структурою і під час протеолізу утворюють пептиди з різною біологічною активністю. В основу корисної моделі поставлена задача розроблення способу виділення препаративним електрофорезом високочистих чотирьох основних казеїнових фракцій: S1 казеїн, S2 - казеїн,  - казеїн та  - казеїн. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб виділення казеїнових фракцій препаративним електрофорезом включає розділення казеїну на фракції у лужному середовищі, причому препаративний електрофорез проводиться із використанням поліакриламідного гелю як підтримуючого середовища Корисна модель пояснюється кресленнями, де на фіг. 1. представлена електрофореграма казеїнових фракцій, отриманих на пластинах поліакриламідного гелю, на фіг. 2. - денситограма казеїну при препаративному електрофорезі із целюлозним підтримуючим середовищем, на фіг. 3. - денситограма казеїну при препаративному електрофорезі із поліакриламідним гелем. Поліакриламідний гель широко використовується в електрофоретичних способах, які проводять для оцінки якісного та кількісного складу зразків протеїнів у незначних кількостей. Найбільш підходящою для ідентифікації і розділення казеїнів є анодна система однорідного поліакриламідного гелю у присутності сечовини. На електрофореграмі відображаються усі казеїнові фракції, у відповідності до діючої міжнародної класифікації, розташовані у порядку зменшення їх електрофоретичної рухливості. За результатами досліджень саме ця електрофоретична система вибрана за основу для розроблення способу виділення казеїнових фракцій препаративним електрофорезом. Для зменшення тривалості електрофорезу і збільшення кількості казеїну, яку можна розділити на фракції із системи виключено меркаптоетанол і зменшено концентрацію сечовини, що суттєво не впливає на якість розділення основних фракцій казеїну. Скороченню тривалості електрофорезу також сприяє зменшення концентрації поліакриламідного гелю і неповне завершення процесу відносно лідерного барвника. Для збільшення кількості казеїну у зразку модифіковано камери і формери для поліакриламідного гелю, а також збільшено концентрацію протеїну у вихідному розчині. У результаті тривалість електрофорезу зменшена в 1,5 рази і становить до 50 хвилин, при цьому кількість протеїну у зразку збільшено майже у 100 разів без помітного погіршення ефективності розділення основних фракцій казеїну, що підтверджено на електрофореграмі (фіг. 1). Корисну модель виконують чином. З незбираного коров'ячого молока сепаруванням отримують знежирене молоко. Сепарування проводять двічі за температур - 30 і 4 °C, що дозволяє більш повно видалити ліпіди молока без втрати білків. Із знежиреного молока виділяють сироваткові білки у процесі коагуляції казеїну хлоридною (сульфатною, молочною, оцтовою) кислотою в ізоелектричній точці при рН 4,6. Осад, що утворюється під час коагуляції, після промивання у дистильованій воді, розчиняють у розчині гідроксиду натрію до рН не вище 7,5. Після повторної коагуляції і промивання казеїнового осаду проводять інактивацію природних протеаз молока шляхом екстракції казеїну в оцтовій кислоті при рН 4,0 впродовж 5 год. Отриманий казеїн розчиняють у буферному розчині, що містить 0,025 М трис, 0,027М діетилбарбітурат, 0,003М ЕДТА і 4,5М сечовину. Приготовленим розчином казеїну наповнюють 1 UA 96429 U 5 10 15 20 25 30 електрофорезні комірки поліакриламідного гелю. Для створення різниці потенціалів до системи подають напругу 100…150 В, при силі струму 35…50 мА, що забезпечує збереження структури казеїнових фракцій й унеможливлює перегрівання гелю та руйнування чітких границь між фракціями. Тривалість електрофорезу становить близько 50 хв. Відділення казеїнових фракцій одна від одної із пластин поліакриламідного гелю слід проводити після ідентифікації їх границь поділу. Для цього із пластин гелю вирізають бічні смуги із обох боків і проводять їх фарбування 1 % - м розчином амідочорного 10 Б. Приклад зафарбованої смужки гелю із основними казеїновими фракціями представлено на фіг. 1. Співставляючи зафарбовані смуги із пластинами гелю, здійснюють розділення пластин на окремі смужки із визначеними казеїновими фракціями. Екстракцію S1 -, S2 -, - чи -казеїну із відокремлених смужок гелю проводять відповідними розчинниками, після чого піддають діалізу та ліофілізації або залишають у вигляді розчину. Приклад конкретного виконання корисної моделі. Виділення казеїну проводять із знежиреного коров'ячого молока шляхом коагуляції в ізоелектричній точці при рН 4,6. При цьому інактивацію природних протеаз забезпечують інкубацією в оцтовій кислоті. Отриманий казеїн розчиняють у буферних розчинах та піддають електрофоретичному розділенню за відповідних значень напруги та сили струму. Ефективність даного способу виділення казеїнових фракцій розкривається за допомогою наступних прикладів і рисунків. Приклад 1 (аналог). Для виділення казеїнових фракцій проведено препаративний електрофорез із використання целюлозного підтримуючого середовища у електрофоретичних комірках. У результаті електрофорезу із казеїну виділено три фракції, про що свідчить денситограма (фіг. 2.) із трьома піками, які характеризують S1 -, S2-, - та -казеїн. Приклад 2. Для виділення казеїнових фракцій проведено препаративний електрофорез із використання поліакриламідного гелю як підтримуючого середовища у електрофоретичних комірках. У результаті електрофорезу із казеїну на пластинах гелю виділено чотири основні фракції. Підтвердженням цього є денситограма (фіг. 3.) із чотирма характерними піками для S1 -, S2-, - та -казеїну. Технічний результат полягає у розробленні способу виділення казеїнових фракцій препаративним електрофорезом із використання поліакриламідного гелю як підтримуючого середовища, який забезпечує отримання чистих фракцій S1 -, S2-, - та -казеїну. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб виділення казеїнових фракцій препаративним електрофорезом, що включає розділення казеїну на фракції у лужному середовищі, який відрізняється тим, що препаративний електрофорез проводиться із використанням поліакриламідного гелю як підтримуючого середовища. 2 UA 96429 U Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3