Спосіб одержання ліпосом для фармацевтичного та косметологічного застосування

Способ получения липосом для фармацевтического и косметологического применения путем растворения фосфатидилхолина в этаноле и смешивания этого раствора с водой, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что смешивание этанольного раствора фосфатидилхолина с водой осуществляют в одну стадию при соотношении объемов 1:35-1 "SO и комнатной температуре. с > Изобретение относится к парфюмернокосметической и фармацевтической промышленности и может применяться для повышения эффективности и пролонгирования действия Лекарственных и косметических средств. Известны способы получения липосом с применением ультразвукового диспергирования (Bangham A. D , Standish М. М., Weissmann G , J, Мої ВюІ. 1965, 13, p. 253259; Kirby С. I., Gregorladls C. In: Liposome Technology, vol, 1. CRC. Press, Boca Raton, Florida. 1984). Эти способы пригодны в основном для лабораторного использования. В производственных условиях процедура ультразвукового диспергирования является трудновыполнимой, затруднено также и удаление малых количеств органического растворителя А в липосомальном препарате для фармацевтического применения даже следовые количества органического растворителя недопустимы. За прототип нами принят способ получения липосом, описанный в статье (Perrett S., Golding M., Williams W. P. A simple method for the preparation of liposomes for pharmaceutical applications' Characterization of the fiposomes. - J. Pharm. Pharmacol 1991, 43, p. 154-161. Этот способ предусматривает получение липосом в две стадии На первой стадии 100 мг фосфотидилхолина растворяют в 80 мг теплого этанола и подавляют воду до соотношения фосфатидилхолин- этанол вода = =100:80 200. Эту смесь в течение нескольких минут нагревают до 60°С. а затем охлаждают до 20°С и получают пролипосомную смесь. На второй стадии пролипосомную смесь превращают в суспензию липосом, добавляя по каплям 10 мл воды. Преимуществом прототипа является исключение токсичного органического растворителя в необходимости ультразвукового диспергирования К его недостаткам следует отнести получение липосомнои диспер O со 00 17638 сии в две стадии и необходимость нагревания этанольного раствора фосфатидилхолина до 60°С. Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего путем подбо- 5 ра соотношения объемов этанольного раствора фосфатидилхолина и воды исклю- ' чить стадию получения пролипосом и упростить получение липосомной дисперсии. Для этого способ получения липосом 10 для фармацевтического и косметологического применения путем растворения фосфатидилхолина в этаноле и смешивания этого раствора с водой предусматривает смешивание этанольного раствора фосфатидилхо- 15 лина с водой в одну стадию при соотношении объемов 1:35-1:50 в комнатной температуре. В качестве носителей лекарственных препаратов используют три типа липосом: 20 однослойные, многослойные и микровезикулярные, Липосомы, полученные техникой разбавления представляют собой многослойные везикулы. Основное различие между м н о г о с л о й н ы м и с п о с о б а м и - это 25 отсутствие токсического органического растворителя. Образуемая липосомная дисперсия содержит 3~10 г фосфатидилхолина и 30-50 мл этанола в 1 л. Присутствие этанола в такой 30 низкой концентрации не влияет на проницаемость липосом для водорастворимых функциональных добавок, вводимых в липосомы. Липосомы, полученные предлагаемым способом, могут быть использованы в каче- 35 стве носителей биологически активных веществ в кремах, лосьонах, лечебных мазях. А поскольку оболочка липосом состоит из природного фосфатидилхолина, который является структурным компонентом оболочки 40 клеток, то липосомы даже без введения в них биологически активных веществ способствуют восстановлению и омоложению кожи. Сравнение предлагаемого способа с прототипом показывает: сходные признаки: 45 отсутствие фармацевтически неподходящих растворителей, исключение необходимости ультразвукового диспергирования; отличительные признаки: получение липосомной суспензии в одну стадию и без нагревания 50 этанольного раствора фосфатидилхолина. Таким образом, предлагаемый способ получения липосом является предельно простым, быстрым, неэнергоемким, и может быть легко применен для получения липо- 55 сом в промышленном масштабе. Примеры осуществления способа. П р и м е р 1. (Соотношение объемов этанольного раствора фосфатидилхолина и воды 1:35). В стеклянный стакан емкостью 1 л со спускным краном помещают 150 мл 10%-ного раствора фосфатидилхолина в этаноле. В стеклянный реактор емкостью 10 л, снабженной якорной мешалкой и спускным краном, заливают 5,25 л дистиллированной воды при комнатной температуре Включают мешалку со скоростью вращения 50 об/мин,Из стакана тонкой струйкой вливают в раствор фосфатидилхолина в этаноле, перемешивают 5 мин. Получают 0,3%-ную суспензию липосом. П р и м е р 2 (соотношение объемов 1:40). Получают липосом так же как и в примере 1, смешивая 150 мл этанольного раствора фосфатидилхолина с 6 л дистиллированной воды. П р и м е р 3 (соотношение объемов 1:45). Получают липосомы так же как в примере 1, смешивая 150 мл этанольного раствора фосфатидилхолина с 6,75 л дистиллированной воды. П р и м е р 4 (соотношение объемов 1:50). Получают липосомы так же как и в примере 1, смешивая 150 мл этанольного раствора фосфатидилхолина с 7,5 л дистиллированной воды. Для характеристики липосом определялись: размер липосом, стабильность их и степень включения вещества и их свободное пространство. Средний диаметр и распределение липосом по размеру определяли методом лазерно-корреляционной спектроскопии на лазерном спектрометре фирмы "Malvern" (см. гистограмму на фиг. 1). Стабильность полученных липосом оценивали по кинетике вытекания их содержимого. Для этого липосомы нагружали флюоресцирующим комплексом тербий-дипиколиновая кислота (Тв -ДПК). Утечку определяли по выходу комплекса из липосом и регистрировали по снижению флюоресценции, (см. Struck D. К., Hoekstra D., Pagano P. Е. Biochemistry, 1981, v. 20, з. 4093-4099). Полученные липосомы стабильны (см. фиг. 2). Следовательно, этанол, присутствующий в суспензии, не оказывает разрушительного действия на липосамную оболочку. В то же время он служит консервантом, предохраняющим от бактериального загрязнения. Степень включения веществ в обводное пространство липосом оценивали, используя флюоресцентный Тв + - Д П К комплекс как маркер. При получении липосом в дистиллированную воду добавляли маркер Суспензию липосом центрифугировали при 17638 100000 g и 20°С в течение 1 ч, чтобы получить осадок липосом. Количество невключенного маркера определяли в надосадочной жидкости на спектрофлюориметре H i t a c h i IOS/Я возбуждения - 276 нм, к эмиссии - 5 545 нм/. Количество включенного в липосомы маркера рассчитывали по разнице. Полученные результаты приведены в табл. 1. Представленные в табл. 1 соотношения 10 объемов этанольного раствора фосфатидилхолина и воды являются оптимальными. Липосомы при соотношении объемов 1:35~1:50 получаются стабильные, со средним диаметром =«210 нм и степенью включения ве- 15 ществ 65-70%. При соотношении объемов менее 1:35, т. е. когда смесь содержит меньшую часть водной фазы, образующиеся липосомы менее стабильны и менее однородны, отмечается 20 низкое включение водорастворимых веществ в липосомы. При соотношении объе мов выше чем 1:50 также отмечается значительное снижение включения в липосомы водорастворимых веществ. В табл. 1 приведены примеры получения суспензии липосом с концентрацией 0,3%. Эту концентрацию можно увеличить, соответственно изменяя концентрацию фосфатидилхолина в этаноле. В табл. 2 приведены примеры получения суспензии липосом различной концентрации. Верхняя граница концентрации суспензии (0,50%) обусловлена пределом растворимости фосфатидилхолина в этаноле. Кроме того, более высокие концентрации фосфатидилхолина повышают стоимость препарата, а эффективность воздействия его на кожу с увеличением концентрации суспензии меняется незначительно. При концентрации суспензии ниже 0,3% уменьшается количество липосом, а следовательно и эффективность их биологического действия. Та б л и ц а 1 Пример Соотношение Концентр, сус- Средний диа- Стабильн. ли- Степень вклюобъемов пензии, % метр липо посом чения в-в, % Нестабильна 20 сом, нм 1 1:20 0,3 Суспензия І неоднородна 2 1:35 0,3 209,7 Стабильна 70 3 1.40 0,3 207,7 -" 70 4 1:45 0,3 210,2 -" 66 5 1:50 0,3 211,3 -" 65 Таблица 2 Пример Концентра Соотношение Концентра ция фосфати объемов ция суспен дилхолина в зии, % Стабильность Степень включения велипосом 1 ществ, % этаноле, % 1 10 1:35 0,30 Стабильны 70 2 12 1:35 0,35 Стабильны 70 3 14 1:35 0,40 Стабильны 73 4 15 1:35 0,45 Стабильны 75 5 17 1:35 0,50 Стабильны 75 17638 Гистограмма распределения по размерам липосом, приготовленных из смеси этанольного р.аствора фосфатидилхолина изводы в соотношении I : 35 37.7 Диаметр липосом /&/,"200 000 Средний диаметр липосом /нм/ 195 6512 1° -93, .Т 17638 Вытекание комплекса тврбий-днпиколиновая кислота из липосом в зависимости от времени. IOO 80 60 W 20 О Упорядник Замовлення 4243 8 Техред М.Келемеш 10 12 . Время /дни/ Коректор Л. Лукач Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП. Киів-53, Львівська пл м 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.Гагаріна. 101