Штамм escherichia coli – продуцент альфа-амілази

ЩТАММ ESCHKRICHIA COLT ПРОДУЦЕНТ АЛЬФА-АМИЛАЗЫ (Национальная коллекция промышленных микроорганизмов, Великобритания) О) С ГО со со СО ' 1 U29939 Изобретение относится к области Микроорганизм идентифицирован Чт А. Рекомбинация in vitro между , на исс фага получают экстракцией фенолом из ДНК лямбда и В. Megaterium. 70% п] высокочистых частиц фага), плазмиприсут Около 7 мкг ДНК В. Megaterium расда рБР (ДНК плазмиды очищают из клеteriur щепляют 10 единицами Hind III при ток лизированных лизоцимом, в хлорид 15 37 С в течение 1 ч в объеме 25 мкл ватель цезия - бромид* этидия градиентах плот отвечу буферного раствора Трис при рН 7,5. ности. Так Около 2 мкг лямбда NM 590 расщепляМикроорганизм-хозяин: Е,- c o l i npenaj ют аналогичным образом тем же фреН 101, микроорганизм-донор: штамм В ный об ментом. Реакции останавливают пуBacillus megaterium со следующими тов В. 20 тем нагрева в течение 10 мин при совмес микробиологическими признаками. 75°С. Щ 590 Морфология: палочки (0,5-0,7*2,0С целью определения эффективио-5,0 мкм) подвижные, грамположительВ. сти расщепления проводят испытания. ные, споры терминальные и субтерминесуще Для этого образцы обеих реакционных Ост нальные, питательный бульон: хороший 25 смесей подвергают электрофорезу в рост, питательный агар: хороший рост, геле агарозы в теченпе 20 ч при напримен пряжении 20 В. После окрашивания больше колонии плотные посредине и более геля этийбромидом должны наблюдать Щих па расплывчатые вокруг, молоко: пептосхему полос: две полосы ДНК лямбда, жизнес. низация без измерения рН, желатин; полученные в результате расщепления еле pot не сжижает. 30 отдельного участка Hind III на ДНК зованиs По восстановлению нитратов, каталямбда, и очень большое количество присутс лазной оксидазной и цитохромоксипочти перекрывающихся полос бактеримала. : дазной реакциям результаты отрицаальной ДНК, расщепленной на большое . менногс тельные. Продуцирование индола и обколичество участков. Это говорит о иода; г разование сероводорода также отрица35 том, что расщепление эффективно боЮм, б, т тельные. лее, чем на 99% и уничтожило таким ной, ос Потребление углеводов: потребляет образом почти всю биологическую акФузии і арабинозу, ксилозу, галактозу, глютивность ДНК фага. ных кле козу, левулезу, мальтозу, рафиноэу, будет ь сахарозу, крахмал и кислоты, полуРасщепленные ДНК смешивают и ин40 это пят ченные из них. Рамнозу, маннозу, кубируют в течение 5 ч при 10 С совсубкуль местно с 0,15 единиц ДНК лигазы Т4, мелибиозу, инулин и салицин не ствие п чтобы произошла произвольная повторпотребляет. частное ная ренатурация и ковалентное окруПотребление многоатомных спиртов: пятна о жение фрагментов ДНК. потребляет сорбитол и маннитол, не Фаг лям 45 потребляет аденитол, дульцитол и По окончании инкубации ДНК смешинение в иноэитол. вают с препаратом, инкапсидированраля 19 ным in vitro, состоящим из. смеси двуз Декарбоксилазная реакция на лиС. П. комплементарно дефективных лизатов фазин: отрицательная, уреолиз: сла-бый. амилазы га (лямбда-Dam и лямбда-Earn), индуциСопротивляемость действию тяжелых лают с і 50 рованных из нее подавляющих штаммов на металлов растет непосредственно 500 м.д. С г 4 + + . Бульон хлорид натрия: рост при концентрации хлорида натрия 3,5%. Температуры роста: оптимальная 30-37**С, максимальная 40-5О°С, минимальная 5-20°С. Потребность в кислороде: аэробный микроорганизм 55 В этой смеси любая молекула ДИК, имеющая края cos ДНК лямба и соответствующие размеры, может быть введена в протеин фага, таким образом воссоздавая in vitro биологически актив1 ную частицу фага, способную инифицьровать E.coli и продуцировать центр инфекции (пятно). центногг лучения личествг 1 мкг и 0,3 мк 'от, смеп как опис применяю і ,\ 429939 4 Чтобы оценить эффективность эт ной методике) штамма НВ 101. Отбору способа, выполняют два контрольных производят по сопротивляемости ампиопрт& циллину (ар) - свойству, которое со1. Образец смеси помещают на Е*г общается клеткам в присутствии этой c o l i и если находят приблизительно плазмиды. Обычно эта плазмида сообща3-10 пятен на I мкг введенной ДНК ет также сопротивляемость к тетрациклямбда, то это указывает на большую, лину бТс). Однако введение посторонэффективность обработки. ней ДНК в эту плазмиду расщепляет 2. Полученные таким образом пят- 10 tet ген, таким образом содержание чувствительных к тетрациклину трансна исследуют визуально. Если из них формированных клонов отражает содер70% прозрачные, то это указывает на жание содержащих плазмиды клонированприсутствие фрагмента Д К В. Mega-1;. Н ных ДНК. В данном случае \Ь% клонов terium, который стыкует и, следосодержали новую плазмиду, которая вательно, инактивирует лямбда ген СЇ отвечающий за помутнение пятна. ^ 15 придавала амилазе активность к Е.соіі (В соответствии с современной междуТаким образом можно оценить, что народной номенклатурой плазмид новые препарат содержал случайно выбранплазмиды, описываемые в настоящем опи ный образец всех возможных фрагмен^ сании, называются (рСР), а конкретная тов Б. Megaterium Hind I I I ДНК, *'' 20 плазмида согласно настоящему примеру совместимых с введением в фаг лямбда обозначена GpCP 1)). „ И 590. М B. Отделение деривата фага лямбда, Это показывает, что повторное клоY несущего В. Megaterium амилазу, " нирование гена тем же самым ферментом Остаток инкапсидационной смеси 25 (в данном случае Hins III) является применяют для заражения Е.соіі на * очень эффективным способом С16Z вмесбольшом количестве крахмалсодержато 1:10*) щих пассажей, приблизительно 10^ Плазмид, содержащий микроорганизм, жизнеспособных частиц на посев. Пообозначен Е. coli 700I (рСР !) и сле роста зараженных Е.соіі и обрасдан на хранение в НКПБ 12 февраля 30 зования пятен посевы сортируют на 1980 г. под номером NCIB № 11570. присутствие пятен разложения крахАмплификация и продуцирование фермала. Это делают путем кратковремента . менного действия на посевы парами Продуцирование фермента в содержаиода: пятно, образованное таким фащих плазмиду (рСР 1) клетках улучшено юм, будет окружено прозрачной зо35 следующими двумя способами. ной, образующейся в результате дифНасыщенные культуры инкубируют в фузии и действия амилазы из лизовантечение ночи при 37 С на вращающемся ных клеток. Если одно такое пятно вибраторе в пятилитровых колбах Эрбудет найдено, то фаг, содержащий ленмейера* содержащих 1 л культу40 это пятно, должен быть отобран для ральной среды (LB, дрожжевой экстсубкультнвирования (длительное дейтракт - триптон) ствие паров йода убило бы фаг). В частности потомство одного такого "•* Хлорамфеникольная амплификация. пятна обозначено лямбда К 590 Amy 1 М Культуры инкубируют при 37 С на враФаг лямбда W 590 Amy I сдан на хра^ 45 M щающемся вибраторе в пятилитровых нение в НКПБ, Великобритания, 12 февколбах Эрленмейера, содержащих 1 л раля 1980 г. под номером NCIB№ 11569. культуральной среды (LB)» до достижения плотности 0,8 (650 нм), после C, Повторное клонирование гена чего добавляют 150 мкг/мл хлорамамилазы в плазмиду рВР 322. Это де-* феникола. (Это предотвращает дальлают с целью получения сверхпродунейшую репликацию хромосомной ДНК, центного штамма, а также с целью поно не репликацию содержащей ген лучения легким способом большого коамилазы плазмиды (рСР 1). После ампличества Д К с геном амилазы. Н лификации (до 3000 копий) плаэмиды мкг Д К из лямбда N 590 Amy 1 Н M и 0,3 мкг плаэмиды рВР 322 расщепля- 5 5 по сравнению с хромосомной ДНК, хлорют, смешивают и обрабатывают лигазой, амфеникол был удален, чтобы мог прокак описано в части А. Этот препарат должатъся синтез протеина. После ампприменяют для трансформации (по обычлификации клетки отделяют от среды 4 ПІ, 1429939 мальтозу и мальтотрнозу, главным образом імальтозу, и циклодекстрин и мальтотриоэу на глюкозу и мальтозу. а м и л а з ы / ' """' ;"' ". ' ' " •• • •"' " ' _ Он расщепляет пуллуалан на панозу Щ" Выделение фермента. и/или изо-паноэу, t Для .этого применяют метод ."осмотиП р и м е р1 2. Клонирование теплоческого'^ у^ара" для выделения апьфастойкого гена зльфа-амилазы. амилаэы в очень чистой форме по и з Микроорганизмом - донором был исвестному способу, ' 10 ходный штамм B a c i l l u s , выделенный иэ Сначала клетки культивируют в т е компоста и идентифицированный как чение ночи, после чего их суспендиBacullus coagulans. Он продуцирует руют в 25%-ном растворе сахарозы в теплостойкую альфа-амилазу и отлича0,5 объема культуры и подвергают вибется следующими микробиологическимирации в 'течение 10 мин при 24°С, в признаками. результате такой обработки происходит Морфология: палочки (0,6-1*2,5плазмолиз клеток. Затем добавляют 5,0 мкм) подвижные, грамположительЭДТК к I мм конечного раствора (что-. ные и грамотрицательные, споры цент'•бы стенки клеток стали проницаемыми) ральные или терминальные, не дефори материал подвергают вибрации в т е - 20 мированные, питательный бульон: хочение еще 10 мин при 24°С. Суспензию роший рост, питательный скошенный центрифугируют и клетки быстро повтор агар: хороший рост, нитевидные, расно суспендируют в. холодной {прибликидистые , кремово-белые, потребление зительно 0 с) воде и.подвергают виборганических кислот - лимонной, полорации^ при этой же температуре еще жительная реакция малоновой: отрица25 10 мин» Суспензию снова центрифугительная, желатин: ожлжение. руют и из всплывшего слоя выделяют По продуцированию ацетилметилкар^фермент. . бинола (ацетаина) и гидролизу о-нитроДля сравнения культивируют микрофенилгалактозида реакция положительорганизм - донор (Bacillus megate30 ная. Восстановление нитратсв: реакция rium) и определяют ферментативную положительная, может получаться газактивность» Количество фермента на Каталазная реакция: положительная. 1 мл культуральной среды определяют Продуцирование индола: реакция отрипо методу ДНС, причем одну ферментцательная, декарбоксилязные реакции ную единицу определяют как количестна лизин, dpнитин и аргинин отрица35 во фермента, продуцирующее 1 мг в о с тельные . становленного сахара (с применением Образование сероводорода, отрицамальтозы в качестве эталона для сравтельная. Потребляет углеводы, пуллунения) в 1 мин в течение 10 мин ман потребляет на минин^ттьчой среде. инкубационного времени. Субстрат Потребление многоатомных спиртов: 40 должен быть чистой амилазой. потребляет глицерин, сорбитол, маннитол, инозитол, не потребляет адонитол, Микроорганизм - донор продуциродульцитол. Уреолиз: реакция отрицавал 66,0 ферментных ед./л культуры. тельная, потребление лецитина: отриНасыщенные культуры E . c o l i CL 7001 цательная. [рСР .1) .продуцировали 116,6 ед./л 45 ^..Температура роста: оптимальная сультуры, тогда как после культиви50fC, максимальная 55-6О^С и мини)ования (амплификации) в течение 5 ч мальная 15-25 С. Потребность в кисло: хлорамфениколом с последующим кульроде: аэробный и анаэробный. Штам •ивированием в течение 15 ч без хлормфеникола бактерии E . e o l i 0L 7001* 50 сдан на хранение в НКПБ 12 февраля 1980 г. под номером NCIB » J 1571 рСР 1) продуцировали 84,5 ед./л. Д К экстрагируют и подвергают дейН -•• показывает, что метод насыщенных •• ствию EcoR I , Hind I I T , Pst I , Sal I , у. ^тур обеспечивает достаточное п о BamH I' и Bgl I I . Только B g l - I I мог ьдиение продуцирования фермента. произвести много фрагментов в широФермент, продуцированный бактерия55 ком диапазоне молекулярных весов.Одн E . e o l i C 7001 (рСР 1), идентиL нако, чтобы можно било получить фраг-сцированньїй как альфа-амилаза, имементы с Есо Р! нпи концентрации хлог следующие свойства. Он расщепляет рида натрия менее 50 мМ, применяют амилозу и амилопектин на глюкозу, V методом центрифугирования, промывают Для удаления хлорамфеникола и повтор* н ° *У*Ш?ВИРУЮГ Я л я продуцирования чик ДНК ют ДУю; три эта 100 тем фер; KOHI До .[ при греї Полі ТОД( ных і с ЗЫВЕ Т4 £ 60 м фата ла и 10—J. алик; вают КОНЦ' часті го и ма HI ло I ниц) иэ э актш актш ниє і (1 в ЧЄН Ji сдан 1980 С. в пла I Amy I плазм; при о( и траі Діт" є , Ь\ со! 1429939 ' 8 , • * •Есо!-Р1 для получения фрагментов бинантную плазмиду, обнаруживают Ш > клонирования в сайте Eco P1 перейЩамипазной активности. Одна такая1" чика лямбда ДНК (лямбда N 781)} M колония отобрана и обозначена Б.coll '• АС-Ограничение ДНК В. Coagula СІ 7002 (рСР 2 ) . Она сдана на хранеД К лямбда И 781. Н М ние в НКПБ 12 февраля 1980 г. под номером КСТВ №11573. 1,25 мкг ДНК лямбда И 781 разрезаМ ют одной единицей Есо Р1 в 25 мл'слеАмплификацию кодирующего амилазу дующего буферного раствора: 10 мМ&гена лямбда-ИМ 781 альфа-Amy и лротрис НС1 (рН 7,5), 10 м 2-меркапто- 10 дуцирование-амилазы осуществляют М этансола, 10 м сульфата магния и и М следующим образом. 100 м хлорида натрия. М v Бактерия - хозяин (Е, coli Н В 2 мкг Д К B.Coagulans разрезает" Н 101) культивирована в LB среде с тем же ферментом в аналогичном бу-ч 2 м хлорида магния при 37°С до М ферном растворе за исключением, что 1$ достижения оптической плотности 0,3 концентрацию хлорида натрия понижают {650 нм) Затем добавляют лямбда до 50 мМ. Инкубацию проводят 2 ч щ ЇЇМ 781 альфа-Amy I, количество фапри 37 С, реакцию останавливают наг: гов, рассчитывают так, чтобы множегреванием при 75 С в течение J0 мин. ственность заражения составляла приПолноту ограничения контролируют ме20 близительно і - 2 , т . е . один или два тодом электрофореза в 1%-ных агаред»ч фага на одну бактериальную клетку* ных гелях. ••$' Затем продолжают культивирование* при В. Связывание и вьщеление рекон^ энергичном перемешивании при 37^ С бинантных фагов. • . -Лф до понижения оптической плотности. Ограниченные ДНК смешивают и > - 25 Когда оптическая плотность понижаетзывают с применением двух единиц ся ниже 0,5, культуру собирают и клаТ4 ДНК лигазы в смеси, содержащей . дут на лед. Культуру центрифугируют 60 м трис-HCl (рН 8 ) , М 10 мМ суль- ' и всплывший слой испытывают на амифата магния, 10 м 2-меркаптоэтаноМ лазную активность. ла и 0,1 мМ АТФ, Реакцию продолжают 30 Амплификацию и продуцирование фер10-15 ч при 10 С* После связывания мента Е. c o l i 7002 {рСР 2) осущесталиквотные части 0,2 мкг ДНК смешивляют по методам насыщенной культуры вают с АТФ для получения конечной и амплификации хлорамфениколом, анаконцентрации 10~ М. Эти аликвотные логично примеру 1. части подвергают инкапсидации i n v i t Амилазную активность определяют по 35 методу ДНС в лизате фага и в культуro и применяют для инфицирования штам рах Т. c o l i , содержащих рекомбинант*" ма Н 101 Е. c o l i . Было получено окоВ ные плазмиды. ло 1,6*10 П Е (пятнообразующих едиО ниц) на 1 мкг лямбда ДНК. Некоторые Таким образом достигают примерно из этих фагов проявляют амилазную 40 трехкратное увеличение продуцироваактивность (обнаружение амилазной, ния фермента с применением рекомбиактивности на чашках Петри, выделенантного фага, еще большее увеличение и очистка фаза как в примере 1) ние наблюдалось с плазмидой (приблизительно в 300 раз) . . Наблюдалось довольно большое содержание продуцирующих амилазу фагов 45 В случае применения фаза (лямбда (1 в 400). Один был отобран и обознаN 781 альфа-Amy О весь фермент вы'M чен лямбда N 781 альфа-Amy 1. Он , M деляется вследствие лизиса клеток и, сдан на хранение в НКПБ 12 февраля^. следовательно, находится в культу1980 г. под номером NCIB № 11572. ' ральной среде. В случае применения С. Повторное клонирование гена амллазы из лямбда N 781 альфа -Amy I 50 плазмиды большая часть фермента M (96%) находится в клетке. в плазмиду рВР 322. Е. Повторное клонирование в дери1 мкг Д К лямбда N 781 альфаН M ват фага лямба, способный к лизогениAmy 1 и такое же. количество ДНК из t зации Е. c o l i . плаэмиды рВР 322 разрезают Eco P1 55 Для иллюстрации приготовления сиспри обычных условиях. Связывание темы переносчик - хозяин, содержащей и трансформацию выполняют по метолямбда лизогенный Т. c o l i , проводят дике, описанной в примере 1. Колонии следующий эксперимент. Е, coli нВ 101 » содержащих реком 10 * 1429939 применяют бактриофаг лямбда Т4 Аналогично примеру 1 применяют метод "осмотического удара" для выдеligCL 857 Warn Earn Sam (лямбда N Я89) M ления фермента. Кроме того, так как Этот фаг содержит ген Д К лигазы бакН фермент согласно этому примеру являтериофага Т4 и способен к лизису ется термос'табильным, его очищают пуЕ. c o l i . Кгоме того, он содержит тептем добавления к водному 10 мГ растлочувстви. -льный ген иммунитета и две ++ вору Са , подогрева раствора до 80 С амбер-мутации в гене Е и гене S сои выдержки в течение 10 мин. В резульответственно. Мутация гена не дает бактерии лиэоваться под действием ин- JQ тате такой обработки все протеины Е. c o l i осаждают и получают альфафекцин этим фагом. Целью субклонироамилазу в чистом виде. вания было заменить ген ДНК лигазы Определяют специфичность альфагеном, кодирующим амилаэу. амилазы. Она должна быть активна к Д К фага и плазмиды (рСР 2) разреН заюу Ёсо P I , фрагменты связывают, ДНК-с амилозе и крахмалу, продуктами гидрофага, полученную в результате лигализа являются глюкоза, мальтоза и ции, затем упаковывают i n v i t r o , пятмальтотриоза со следами компонентов на исследуют визуально путем посева с большим молекулярным весом, и не на штамм Е.сбіі SupE. SupF. Пятна, активна к цилодекстрину. Исследуют показывающие амилаэную активность, также теплостойкость фермента. 0п~ собирают и фаг очищают по описанной тимальная температура активности с методике. Затем этот фаг был применен 0,5% амилазы должна находиться в индля лизогенизации штамма E . c o l i С 600 тервале 80-90°С. С 8%-ным раствори(CL 1205) по обычной методике. Лизомым крахмалом оптимальная темперагенные колонии проверяют визуально 25 тура составляет около 100 С. на крахмалсодержащей среде с примеВозможно, что микоорганиэм, назынением метода окрашивания йодом.Этот ваемый здесь B a c i l l u s coagulans факштамм обозначен Е. c o l i CLO7003 тически является B a c i l l u s l i c h e n i (лямбда, альфа-Amy 1) и сдан на храformis. нение в НКПБ 6 марта 1980 г . под но- 30 Пример 3. Субклонирование мером ЛСІВ № П586. плазмиды рСР 2 в плазмиду рС 194 и Амплификацию гена осуществляют экспрессия новой плазмиды в B a c i l l u s следующим образом. s u b t i l i s . Данный пример иллюстрирует Лизоген выращивают при 32 С в среметодику, по которой рекомбинантде LB до плотности 0,8 при 650 нм, ная ДНК, полученная в соответствии 35 затем егс • ентрифугируют и клетки с изобретением, может быть экспрес:успензируют в свежей среде LB, пред-; сирована в бактерии - хозяин, отзрительно нагретой до 45°С. Потом личпей I T Т. c o l i , а именно в штам:ультуру инкубируют в водяной бане ме B a c i l l u s s u b t i l i s , іри 45°С в течение 15 мин с целью Плазмида рСР 2 (из примера 2) 40 'ндуцирования литического цикла содержит фрагмент размерами 3,31 так как иммунитета является теплочув* килобаз из донора В» coagulans. Кротвительным). Затем продолжают инкуме того, плазмида характеризуется ацию при энергичном перемешивании тем, что сообщает сопротивляемость ри 37°С в течение 3 ч, после чего к ампециллину и тетрациклину и сопределяют амилазную активность во держит два участка ограничения для сплывшем слое и в клетках. каждого из Есо РІ и Hind I I I . ПлазЭтот эксперимент иллюстрирует мемиду рСР 2 расщепляют на 4 фрагменэд "суб-субклонирования" из плазмита Есо Р1 и Hind I I I » обрабатывают > в новый лямбда фаг. При этом Д К і Н лигазой и применена для трансфор50 І лямба Щ 781 альфа-Amy 1 может мации НБ 101, как в предыдущих іть так же легко субклонирована непримерах. >средственно в указанный фаг, приПолучились новые плазмиды рСР 2 , 3 , • возможно любое количество варианм имеющие фрагмент 2,64 килобаз Д К Н > описанного способа. в В. coagulans, причем указанный фрагF. Выделение и характеристика амимент содержит ген, кодирующий альфазы, полученной из лямба М 791 альамипачу. Плазмида рСР 2, 3 имеет один -Amy 1, Е. c o l i CL 7002 (рСР 2) и участок для кажого Есо р!^ и Hind TJT, c o l i CL 7003 (лямбда, альфа-Amy I ) щ П) Н( Ml сг с пт m Нз Be да не my аь ' ть КС НУ Фс ФР в С. За PC ср на ют чт ро ко ра хл 37' рої ЛЯІ Обі лаг В. хр? ног. РВ тог Он роь вир амф за тур ноч кол ело І429939 ' 12 • , П р и .м е р 4 . Клонирование бетаамилазы. Микроорганизмом0-'7 был известным штамм "Бас сданный на хранение в Ферментатйв-^' ный исследовательский институт ! в Чвба-ши. Япония, 20 декабря 1'973sr*"&ii> под номером FERM-P № 2391, а так*ё;. в Американскую коллекцию культур под • 10 номером АТСС № 313 02 (26 декабря ;'/«•' iJV 1974 г . ) . Известно, что он " рует как -бета-амилазу, так и 1,6-глюкозидазу. A. Клонирование гена бета-амила" |5 з ы . в лямбда И 781 . М Была принята методика ограничения, связывания и выделения аналогично примеру.2. Д К (2 мкг) Е.се- ' Н сreus была ограничена при обычных 20 условиях ограничения ферментом Есо Р1. ДНК переносчика фага (1,25 мкг лямбда N 781 ) была разрезана тоже M Есо Р 1 . Свызывание и упаковку осу•*—• в соответствии с методом/СЧі і" ществляют аналогично описанному. С.Когана для образования протої Обнаружено несколько рекомбинантЗатем протопласты трансформирую ных фагов, проявляющих амилазную акрСН 1 по методике трансформа тивность (приблизительно 1:500).Был ' ;* среде полиэтиленгликоля Ча отобран один из этих фагов (обознана. После этого протоплаты! ченный лямбда И 781 бета-Amy 1).0н М ют в богатой среде в течен сдан на хранение в НКПБ 12 февраля чтобы плазмида в бактерю^ 1980 г . под номером ЇЇСІВ & П574. "ровала сопротивляемость B. Повторное клонирование гена колу. Затем :пр_отопласты сеют н, бета-амилазы из лямба N 781 бетаM нёрационную среду7 к которой Amy 1 в плазмиду рВР 322. ~ ~ хлорамфеникол в количестве С ц е л ь ю повышения п р о д у ц и р о в а н и я 35 фермента этот первый клон бета-амиПосле инкубации в течение 2 37'С появлялись колонии трансформилазы проявляют в качестве источника рованных клеток. Эти-колонии, ^проявкодирующей бета-амилазу ДНК для субляющие альфа-амилаэную активносте, ее в мультикопию плаэ:клонирования обнаруживают по методу окрашивания миды рВР 322. парами йода. Один клон, обозначенный 40 2 мкг ДНК лябда К 781 бета-Amy 1 М В. s u b t i l i s CL 8001 (рСН. О,-'сдаж на и 1 мкг рВР 322 разрезают Есо Р 1 , хранение в НКПБ 13 января 1981$: смешивают и обрабатывают Т4 лигазой. номером ЇЇСІБ № 11629. Исходный^ Связывание и трансформацию осущестОБ 1133 тоже сдан на хранение^ вляют аналогично описанному. варя 1981 г . под номером NCIB^l Одна колония на 200 устойчивых к Ъ . s u b t i l i s CL 8001 (рСН 1) ст^ ампициллину колоний показала активтолько в присутствии хлорамфеі ность к разложению крахмала. Одна Он может] быть применен для пр§ выделена и обозначена Е. c o l i CL рования альфа-амилазы путем' і 7004 (рСР 3 ) , она сдана на хранение вирования в среде, содержащейjв НКПБ 15 сентября 1980 г . под ноамфеникол (20 мкг/мл}. Альфа-а: мером NCIB № 11602. за может быть легко выделена C. Повторное клонирование гена туральной жидкости. . ". • бета-амилазы в дериват фага лямбда, способный к лизису Е. c o l i После культивирования в ночи в присутствии хлорамфени*£| В качестве переносчика применяют количество прод-цированной алв тёплочувствительный лямбда Т4 li,£ лазы следующее, е д . / л : всплыв фаг С1 857 Warn Earn Sam (лямбда N 989) , M слой 136, клетки 14, всего 150* описанный в примере 2 . Около 1 мкг ампициллиновую и 'сопротизляемость ,''5* ["следующей стадии "вы рС J$$'» которая извеї рМностыб'к репликации' Cue s u b t i l i s . Плазмида '; (аёт хлорамфеникольную' іюсть и имеет один учас I I I . рС,2,3 и рС 194'' 1 Щ ' >т Hind I I I . смешивают"; образования новой плаз рСН 1, содержащей1-ко; удой альфа-амилазу ге'н и имеющ. Гамфеннкольную и ампнциллин'бв" ^тивляемость, хотя уровень хлор, Школьной сопротивляемости в'Е^Г" ьвиэок. Препарат применяют для формации Е, c o l i HB \\ Штамм мутанта D. s u b t i l i s Ііаченньїй OB 1133 у не провлГ' фа-амилазной активности,"о fj^t-'fij'• • • • • 13 1429939 Я 14 Д К плазмиды рСР 3 и 0,5 M Н F ДК Н активность, т . е . они окружены мутфага были расщеплены, затч фрагными кольцами, характерными для "чрезменты связаны вместе и полученные мерно разросшихся" бактерий. Содержание1 продуцирующих луллуланозу фачасти Д К упакованы in v i t r o . ЧасН 5 гов было порядка 1:2500. тицы фага, проявляющие амилазную активность, выделяют.и применяют для Один был отобран и обозначен лямбполучения лизогенных колоний по опида И 781 Pul I, он сдан на хранение М санному^методу. Штамм_Е. s o l i С 600 в HKJJB 9 апреля 1980 г, под номером лнзогенный для этого рекомбинантного 10 ЖЯ&№ 11593. фага был выделен и обозначен E . c o l i Пуллуаназную активность определяCL 7005 (лямбда, бета-Amy 1 ) , он ют по методу ДНС, продукт гидролиза сдан на хранение в НКПБ 15 сентября пуллулана лизатами фага идентифици1980 г. под номером NCIB № 11603. руют как мальто триозу методом тонD. Амплификация гена амилазы. 15 кослойной хроматографии. Во всех клонах и субклонах амилазЛямбда Щ 781 Pul 1 содержит больную активность определяют по методу шой фрагмент Д К из Klebstilla pneuН ДНС. Бета-амилазная активность подгорпдае 13,5 килобаз, этот фрагмент тверждена хроматограммами ТСХ по прибылх снова разщегьпен Есо Р1 на два сутствию единичного пятна мальтозы 20 фрагмента 6,1 н 7,4 килобаз. Затем после усвоения амилазы. Осуществляют субфрагмент 6,1 килобаз был повторно по описанной методике амплификацию клонирован в лямбда М 781, устаМ гена бета-амилазы в различных клонах. новлено, что он содержит ген пуллуПример 5. Клонирование гена ланазы. Этот новый рекомбинантный фаг ггулланазы. Микроорганизмом - донором 25 назван лямбда Щ 781 Pul 2, Он сдан 5ыл Klebsulla pneumoniae, описанный на хранение в НКПБ 1? сентября 1980г. І.^Бендером и сданный на хранение под номером NCIB № 11604, • июня 1963 г . под номером АТСС Субсерию 6,1 килобаз затем еще 15050, Он описан также в патенте клонируют в мультикопию плазмиды еликобритании № 1273789. 30 рАСУС 184 (деривант рВР 322 с Тс й г е 2,25 мкг ДНК донора экстрагируют ном последнего и Ст геном с одним фрагментируют Есо Р1 в обычучастком Есо Р1), Новый клон назван ае условиях, 1,25 мкг Д К лямбН Е, c o l i CL 7006 (рСР 4 ) . Он сдан i N 781 M разрезаны этим же на хранение в НКПБ 15 сентября 1980 г. рментом в таких же условиях. Инпод номером NCIB № 11605. 3 5 бация продолжалась 3 ч при 37 С, Третий субклон был создан путем еле чего реакцию остановили путем введения фрагмента 6,1 килобаз в фаг 'рева в течение 10 мин при 75 С. лямбда И 989, как описано в примеМ зноту ограничения определяли анаре 2. Этот клон назван Е. c o l i CL •ично примеру 2. 40 7007 (лямбда Pul 2 ) . Он сдан на храОграниченные Д К связывают,выдеН нение 15 сентября 1980 г. под номет и применяют для инфекции штамром NCIB № 11606, В результате установлено, что пулE. c o l i НВ'101 (аналогично приV 2} t Получают около 2*10 П Е О луланазная активность индуцируется гнообразующих единиц) на 1 мкг 45 мальтозой путем добавления 0,04% лямбда. мальтозы в LB среду. Кроме того, для г выделения пуллуланазы необходима обосле инкубации 2 сут при 37 С на работка Triton 100 мембранной фракции, ах Петри, содержащих BBL Трипэто указывает на то, что активность зу плюс 0,25% пуллулана, некотолокализована в мембранах. пятна показывают пуллуланаэную кп Составитель С. Светлышев Корректор С. Черни Техред М.Дидык