Спосіб оцінки імунологічного статусу тварин

Изобретение относится к в е т е р и нарной иммунологии и может быть и с пользовано для оценки активности с и стем мононуклеарных фагоцитов и г р а н у л о ц и т о в . Изобретение я в л я е т с я д о п о л нительным к а в т . с в . СССР № 1378578. Целью изобретения я в л я е т с я повышение точности способа,, Для э т о г о в среду культивирования з а 10-20 мин д о о к о н чания культивирования лейкоцитов в н о сят нитросиний тетразолий и з р а с ч е т а 200-600 мкг на 1 мл с дополнительной оценкой иммунологического с т а т у с а животных по фагоцитарной и м е т а б о л и ч е с кой активности гранулоцитов. 4 табл„ (Л Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и может быть использовано для оценки активности систем мононуклеарных фагоцитов и гранулоцитов,, Целью изобретения является повышение точности способа,, Для этого за 10-20 мин до окончания культивирования лейкоцитов в среду вносят нитросиний тетразолий из расчета 200-600 мкг на 1 мл, а оценку проводят дополнительно по фагоцитарной и метаболической активности гранулоцитов.. Способ осуществляется следующим образом. Пробу крови животного (3-5 мл), отобранную с добавлением гепарина, отстаивают 1 - 1,5 ч при комнатной температуре0 Слой клеток белой крови отсасывают пипеткой, трижды отмывают 24-90 с средой 199, а з а т е м концентрацию л е й коцитов доводят средой 199 с 15% бычьей сыворотки до 1,0-10* - 1 , 2 ' МО клеток/мл* На дно к у л ь т у р а л ь н о ,го флакона помещают покровное с т е к -4 ло и вносят 3-4 мл в з в е с и клеток б е лой к р о в и . Флаконы инкубируют 24 ч •' О при 37 С, За 40-45 мин до окончания культивирования во флакон вносят с у с пензию инактивированного стафилококка из р а с ч е т а 200-220 млн микробных т е л на 1,0 - 1 0 і - 1,2.10 е к л е т о к . За 10 20 мин д о окончания инкубации во ф л а кон вносят нитросиний т е т р а з о л и й из р а с ч е т а 200 - 600 мкг на 1 мл среды культивирования. Удобно п о л ь з о в а т ь с я 0,2%-ным водным раствором нитросинего т е т р а з о л и я , который вносят во ф л а к о ны в объеме 0 , 1 - 0 , 3 мл. Но о к о н ч а нии инкубации покровные с т е к л а с п р и крепившимися клетками извлекают, п о д 1575713 сушивают на лабораторном столе 15 -• 20 мин» фиксируют в метаноле или холодном ацетоне 7 - 1 0 мина повторно высушивают и окрашивают по Романовско~, му. После подсушивания покровные стекла монтируют с помощью кедрового бальзама на предметных стеклах клеточным слоем вниз. Изучение полученных цитологических препаратов ведут в светооп-Ц) тическом микроскопе при увеличении объектива 90 х (иммерсия) и окуляра 7 - 12,5х, Исследуют 100-200 клеток в каждой пробе» Иммунологический статус животных t5 оценивают по следующим показателям: а) показателю макрофагзльной трансформации моионуклеаров (ПМТМ) Среди трансформированных и нетрансформированных мононуклеаров и лейкоцитов разных типов, окрашенных по Романовскому и имеющих красно-фиолетовые ядра и цитоплазму различных оттенков от розового до серого, хорошо выявляются и идентифицируются гранулоциты с синими глыбчатыми включениями фпрмазана в цитоплазме. Гранулы формазана легко дифференцируются и от скоплений стафилококка, которые не мешают правильному учету ИФІІГ* Подсчитывая !00 - 200 клеток, определяют соотношение гранулоцитов, содержащих и не содержащих гранулы формазана в цитоплазме. Такое соотношение, выраженное в %, составляет показатель формазан-положительных гранулоцитов М 100% к • 20 (ПФПГ ). Согласно полученным данным М + N у здоровых свиней П П составляет 14ФГ где К - П Т ; ММ 20%, у кроликов - 16-24%о Увеличение М - количество макрофагов; П П отражает повышение иммунологиФГ N - количество нетрансформированческого статуса за счет активации ных монокулеаров (моноцитов гранулоцитов "макрофагов", ответсти лимфоцитов), венных за фагоцитоз и нейтрализацию б) фагоцитарному показателю бактерий, колоний, вирусов и т о д 0 СниV 100% _ жение П Н отражает уменьшение активФГ т~+~5 ности гранулоцитов, что ослабляет имгде Р - фагоцитарный показатель; мунную и неспецифическую защиту орТ - количество фагоцитирукщих "- ганизма, снижает иммунологический ста* мононуклеаров; тус Б ЦеЛОМ„ D - количество нефагоцитирующих мононуклеаров, Таким образом, в предлагаемом способе оценки иммунологического статуса животных учету и оценке подлежат все основные типы лейкоцитов: мононуклеаргде Q - фагоцитарное число; ные клетки (моноциты, макрофаги и S - суммарное чьсло фагоцитиролимфоциты) - по показателям а ) , б ) и ванных моыонуклеарами кокковЇ в ) , а также гранулоциты - по показат L количество фагоцитов, в кототелю г ) о Этим достигается поставлена рых подсчитывали фагоцитиропая цель изобретения - повышение точванные кокки» ности иммунологического статуса» г) показателю формазан-положительПолученные результаты в виде цифроных гранулоцитов П П ФГ 45 вых показателей обрабатывают статиН 100% стически. Для этой цели удобен метод В = н + с Монцевичуте-Зрингене 0 где В - ЇЇФИГ; Н - количество гранулоцитов, поИнтервалы значений параметров предложительно реагирующих на нилагаемого способа подбирают эксперитросиний тетразолий (формаментально и подтверждают в двух спезан-положительиых); циально проведанных сериях опытов. Во С ~ количество гранулоцитов, отвсех опытах используют пробы крови рицательно реагирующих на нитот одной и той же группы животных росиний тетразолий (формазан- 5 (II голов поросят 20-дневного возрасотрицательных). та) с тем, чтобы различия результатов определялись исключительно различиУчет реакции по П П осуществляетФГ ями значений параметров выполнения способао ся следукядим образом. в) фагоцитарному числу 6 Исследуют пробы крови от 20-дневных поросят в двух группах: 1575713 Серия опытов 1 0 Определение допустимых и оптимальной концентраций нитросинего тетразоля для выполнения способа» I группа - 18 голов порЪсят, не Продолжительность инкубации 15 мнн. получавших биопрепарат, Из данных, представленных в табл.1 , I I группа - 21 голова поросят, последует, что выполнению способа удовлучавших биопрепарат в дозе 2,5 мл/кг летворяет концентрация нитросинего тетразолия 200 - 600 мкг/мл. Более *л массы тела с I дня жизни в течение низкая концентрация (100 мкг/мл) не 7 дней перорально. обеспечивает достаточного насыщения j-ранулоцитов красителем, что проявОт каждого животного отбирают по ляется увеличением ПФПГ при более вы3 мл крови с гепарином и из каждой соком содержании тетразолия. Примене- (5 пробы готовят суспензию лейкоцитов, ние больших концентраций тетразолия содержащую 1,2' 10* клеток в 1 мл. '.) не приводит к увеличению количества 8 культуральные флаконы с помещенными выявляемых гранулоцитов с высокой фана дно покровными стеклами вносят гоцитарной и метаболической активпо 3 мл суспензии лейкоцитов, $лаконостью и нецелесообразно по экономи- 20 ны с клетками инкубируют в термостате ческим соображениям*» при 37°С 14 ч о За 45 мин до окончаРезультаты экспериментов серии I ния инкубации в каждый флакон внопозволяют считать допустимой кон-' сят по 660 млн о микробных тел инактицентрацию нитросинего тетразолия 200вированного стафилококка. За 10 мин 600 мкг/мл, оптимальной - 500 мкг/мгь 25 до окончания инкубации в каждый флакон вносят по 0,9 мл 0,2%-ного водСерия опытов i t о ного раствора нитросинего тетразолия Определение допустимого и оптималь(из расчета 600 мкг на 1 м л ) а По оконного времени инкубации клеток с нитрочании инкубации покровные стекла с синим тетразолием для выполнения спо30 клетками извлекают, подсушивают, фиксоб а о сируют в метаноле, окрашивают1 по РоКонцентрация нитросинего тетразомановскому и исследуют под микросколия в среде - 500 мкг/мл. пом, определяя показатель макрофаИз данных, представленных в табл и 2 гальной трансформации мононуклеаров следует, что выполнению способа удов35 (ПМТМ), фагоцитарный показатель, фдголетворяет продолжительность инкубацитарное число и показатель формазанции клеток с нитросиним тетразолием положительных гранулоцитов (ПФПГ) в пределах 10-20 мин. Меньшая продол(табл о 3) 0 жительность не обеспечивает достаточного контакта клеток с тетразолием Из представленных в табл„3" данных и его полного восстановления в форма- 40 следует, что при наличии тенденции к зан, что проявляется в низких значениповышению иммунологического статуса ях П П » Большая продолжительность Ф Г ''у животных II группы по показателям практически не влияет на результативизвестного способа (р>0,1) их иммуность реакции и не повышает ПФПГ,что нологический статус следует оценивать свидетельствует о достаточном насыще- 45 как несомненно более высокий на оснии клеток тетразолием и полноте его новании существенных и статистически восстановления« достоверных различий ПФПГ (р