Спосіб одержання лізину

1. Способ получения лизина, предусматривающий выращивание культуры Corynebactenum glutamicum в жидкой питательной среде и последующее выделение лизина из культуральной жидкости, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что процесс выращивания ведут при поддержании концентрации ассимилируемого источника углерода на стадии ферментации менее 3 г/л. 2. Способ поп.1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что используют лейцин-ауксотрофные штаммы Corynebacterium glutarmcum и процесс ведут в условиях лимитирования лейцина до достижения концентрации менее 0,1 г/л после логарифмической фазы роста культуры. 3. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что используют штамм-продуцент Corynebactertum glutamicum DSM 5715. О Изобретение относится к улучшенному способу ферментативного получения •аминокислот, как, например, L-лизина или L-треонина. L-лизин является имеющей существенное значение аминокислотой и используется в большом объеме в качестве добавки к животному корму. Получение некоторых аминокислот осуществляют, в общем, биосинтетическим путем и из уровня техники это уже давно известно. Используемые в качестве продуцентов штаммы бактерий отличаются способностью выделять эти аминокислоты в короткое время в высоких концентрациях в питательной среде. Во из бежание высокой начальной концентрации субстрата, как правило осуществляют периодический процесс культивирования. Благодаря очень высокой мощности обмена веществ используемых штаммов продуцентов решающее значение имеет проведение процесса ферментации так, чтобы максимальное значение в потребности кислорода и выделению тепла имели бы порядок величин экономически выгодных. Поэтому применяют различные приемы, которые регулируют метаболическую активность организмов таким образом, что, с одной стороны, обеспечивается снабжение кислородом и отвод тепла, с дру О 27034 гой стороны, уравновешивается распределение образования биомассы и продукта. Из патента Франции 212558 известен способ с периодической "подкормкой", при котором метаболическую активность в фазе роста устанавливается через изменение рН, общее содержание биомассы через альфа-аминный азот. В патенте СССР 1 157059 описывается способ с периодической "подкормкой", при которой концентрация треонина служит в качестве критерия для подкормки и содержания восстанавливающего соединения поддерживается при 3-5%. Очень тонко осуществляемый способ известен из патента Франции 8303487. В случае этого процесса имеются 2 непрерывно добавляемых питательных раствора: один раствор фосфата лейцина, который добавляется так, чтобы через дополнительную добавку лимитировалась интенсивность обмена веществ, так и также образование биомассы. Второй питательный раствор, раствор сахара, добавляется так, чтобы действительная концентрация сахара поддерживалась в интервале 5-15 г/л. Из этого следует, что культура на основании ограничения за счет добавок фосфата лейцина во время фазы "подкормки", в любой момент времени потребляет меньше сахара чем имеется в распоряжении в питательной среде. Этот вариант способа находится в соответствии с многократно документированным мнением, что нужно избегать как С-ограничения, так и также сильного Сизбытка (например, патент ГДР 269167) (Например в публикации Hadi Sassi и др. Biotechn. Letters т. 10, № 8, с. 583/586/ 1988) предложили для этого даже 90-140 г/л глюкозы. Метаболическая активность следовательно всегда регулируется другой величиной, чем С-источник. Задачей настоящего изобретения является разработка способа ферментативного получения аминокислот, который осуществляется при более высокой степени превращения используемого источника углерода (сахар), и при котором в свободной от биомассы сухой массе достигают более высокой концентрации аминокислот. Предметом изобретения является способ ферментативного получения аминокислот, при котором выращивают продуцирующий одну или несколько аминокислот штамм родов Brevibacterium или Corynebacterium в питательной среде и по 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 4 " окончании ферментации аминокислоту (аминокислоты) выделяют из культурной жидкости, отличающийся тем, что бактериальная культура в связи с сильной фазой роста (в фазе выработки фермента) имеет в распоряжении меньше могущего быть использованным источником углерода, чем она может метаболировать вследствие конструкции штамма и вырабатывают в питательной среде количества в остальном необходимых добавок. Ферментационную (питательную) среду составляют в остальном, общеизвестным способом. Наряду с источниками углерода, как ассимилируемые сахара, сахароза, глюкоза и гидролизаты крахмала, и ионами аммония, в случае ауксотрофных продуцентов она содержит комплексные составные части в качестве источника для необходимых по причине одной или нескольких ауксотрофий, органических добавок, например протеиновые гидролизаты в качестве источника альфа-амино азота, витамины, а также неорганические соли. При сильном росте к началу ферментации речь идет в общем о логарифмической фазе роста. При необходимости ее можно сокращать за счет лимитирования добавок и/или источника углерода. В связи 'с этим также имеется еще рост клеток. Однако его объем составляет только незначительную часть фазы охарактеризованной как сильный рост. Предпочтительно используют штаммы, которые продуцируют L-лизин и/или Lтреонин. Ферментационная среда выбирается так, чтобы температура составляла 2540°С, предпочтительно 30-35°С, рН-значение составляло 6-8, предпочтительно 7-7,5, и концентрация ионов аммония составляла 0,5-8 г/л. Бульон перемешивают и в достаточной степени обеспечивают кислородом. В частности в случае аминокислотноаукеотрофных осадителей лизина метаболизацию сахара можно регулировать через количество добавляемой аминокислоты. Ее концентрация, соответственно, концентрация других необходимых добавок после фазы роста составляет предпочтительно по 0-0,1 г/л, в частности 0-0,05 г/л. Так, например, в случае лейцин-ауксотрофного осадителя соотношение сахар-лейцин в непрерывно добавляемой среде "подкормки" выбирается так, чтобы образование биомассы лимитировать через снабжение лейцином, одновременно, 27034 однако, дают только вес, часть сахара, которая могла бы вводиться во взаимодействии с указанной концентрацией лейцина. Предпочтительно концентрация могущих быть использованными Сахаров в связи с сильной фазой роста составляет 0+< 3 г/л в частности, однако, 0-1 г/л. Концентрация 0 г/л в ферментационном бульоне, однако, как в отношении возможных необходимых, так и также источника углерода, не означает, что эти вещества вводят не непрерывно. Напротив, это говорит о том, что эти соединения подаются в количестве, которое непосредственно принимается бактериальными культурами. Эта, осуществляемая согласно предлагаемому в изобретении способу ферментация обладает рядом решительных преимуществ по сравнению с вышеуказанными обычными процессами: 1. На метаболическую активность и таким образом потребность кислорода и теплообразование культуры можно влиять непосредственно и без замедления через скорость дозирования "подкормки" и приспосабливать к мощности ферментера. 2. Ферментационные бульоны отли-' чаются более высоким содержанием продукта в общей сухой массе и таким образом большей чистотой. Благодаря тому, что бактериальной культуре в течение всего периода времени "подкормки" предлагается меньше субстрата, чем она могла бы превратить, источник углерода таким образом представляет собой основное ограничение, предотвращается расход в направлении побочных продуктов. 3. Ферментации дают относительно процесса ферментации с первичным лимитированием добавок более высокого выхода. 4. В случае мониторинга продукта ферментацию можно обрывать непосредственно и без последующего времени в оптимуме, соответственно, на плато, которое соответствует брутто-выходу в любой момент нетто-выхода. 5. В плане обработки, которая предусматривает прямое выпаривание ферментационного бульона, содержимое ферментера при технических нарушениях можно тотчас подавать на обработку, не затрагивая качества продукта за счет высокого содержания остаточного" сахара. Нижеследующие примеры показывают возможность осуществления способа согласно изобретению. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 П р и м е р 1 (сравнительный). В ферментер с мешалкой и системой аэрации помещают 5,1 кг стерильного раствора, который содержит следующие компоненты, г: j Вода . . 4540 Меласса " * 26 Глюкоза . 125 Гидролизат кукурузной КЛеЙКОВИНЫ ' ; (сернокислый) I 35 Гидролизат проду! центной биомассы (сернокислый) І 320 Сульфат аммония |• 45 Фосфорная кислота, 85%-ная 7 Сульфат магния 3, другие минеральные соли, микроэлементы, а также биотин и тиамин. С помощью раствора аммиака устанавливают рН-значение - 7.3. К этому раствору при 3335°С добавляют 0,6 л затравочной культуры Corynebacterium glutamtcum DM 346-1, которая несет генетический маркер Leu, аминоэтил-резистентный и оксализин-резистентный. Затравочную культуру готовят путем инкубации в течение 15 часов при 33°С и рН 7 при перемешивании и аэрации в среде с 4,4% масс, добавки мелассы, 2 % сахарозы и 14 % гидролизата соевой муки (сернокислого) при добавке 3% сульфат аммония, 0,05% фосфорной кислоты и 0,02% сульфата магния, а также витаминов биотина и тиамина. При достаточном перемешивании, аэрации и установлении рН при значении примерно 7,3 с помощью водного раствора аммиака, после окончания логарифмической фазы роста, в основной ферментер в течение 32-х часов обычным образом непрерывно добавляют следующую нейтрализованную водным раствором аммиака среду так, чтобы измеряемая в ферментативном бульоне концентрация сахара составляла 5-35 г/л (ферментативные определения на сахарозу и глюкозу, г: Зода 1250 94 Меласса "л ю коза 1465 "идролизат кукурузной клейковины (сернокислый) 39 Гидролизат продуцентной биомассы 265 (сернокислый) Сульфат аммония 31 Фосфорная кислота, 85%-ная 4 Сульфат магния 2, 27034 другие минеральные соли, микроэлементы, а также биотин и тиамин. В конечном продукте ферментации после того, как весь ассимилируемый сахар, ферментационной среде израсходован, степень конверсии сахара в лизин составляет 35%, в расчете на Lys х НС(, содержание лизинового основания в не содержащем биомассы в выпаренном ферментационном растворе составляет 45%. П р и м е р 2. Приготовление инокулята, среда помещаемая в основной ферментер, а также условия культивирования соответствуют указанным в примере 1 Также среда 2, вплоть до следующей модификации, состоит из следующих составных частей, г: Вода , 1560 Меласса 75 Глюкоза 1170 В этом опыте подкармливаемую среду добавляют с такой же скоростью дозировки, как и в примере 1. Текущие анализы на ассимилируемый сахар показывают, соответственно заявляемому здесь согласно изобретению способу, что во время всей продолжительности "подкормки" измеряемая концентрация ассимилируемых Сахаров поддерживается ниже 3 г/л, однако поддерживается почти исключительно ниже 1 г/л. Анализы на лейцин в ферментационном бульоне с помощью анализатора аминокислот, показывают, что в течение "подкормки" после израсходования помещенного в среду 1 количества лейцина ни в какой момент времени концентрация лейцина не составляла более, чем 0,05 г/л. По окончании ферментации степень конверсии сахара в лизин (в расчете на Lys х HCt) составляет 40% содержание лизинового основания в не содержащем биомассы, выпаренном бульоне ферментация составляет 54%. П р и м е р 3. В реактор емкостью 10 м э помещают 3980 кг стерильной среды, которая имеет следующий состав: Сахароза 320 кг Меласса 20 кг Гидролизат кукурузной клейковины 230 кг 25%-ный водный сульфат аммония 150 кг Лимонная кислота х Н 2 0 2,3 кг Фосфорная кислота, 89%-ная 6,6 кг MgSO4 х 7Н О 2,8 кг CaCL х 2Н2О 75 г FeS(54 х Н2О 113 г 113 г MnSO4 х Н2О 2nSO4 х НгО 5,6 г CuSO4 х 5Н2О 0,6 г Биотин 1,1 г Тиамин х HCI 0,8 г NH4OH (2-3%) 1010 кг Вода 2258 кг рН 7,0 Содержимое емкости перемешивают 10 при 33°С и в достаточной степени аэрируют. После переноса 250 л инокулята • штамма ДМ 282-2, который несет генетический маркер - лейцин-ауксотрофный и аминоэтилцистеин-резистентный (после 16 15 ч инкубации в среде: 6% мелассы, 14% гидролизата соевой муки, 1% сульфата аммония и 0,1% фосфорной кислоты при рН 7 и при 30°С) в реактор емкостью 10 м э значение рН устанавливают равным 20 7,0 с помощью водного раствора аммиака, аэрация устанавливается так, чтобы растворенный кислород всегда присутствовал в количестве выше 15% насыщения 25 30 35 40 45 50 55 После того как культура вырастает до оптической плотности (535 нм) примерно 30, добавляют продуцирующую среду следующего состава со скоростью дозировки 30 л/час Сахароза 940 кг Меласса 50 кг Гидролизат кукурузной клейковины 180 кг 25%-ный водный сульфат аммония 80 кг Лимонная кислота, Н2О 1 кг Фосфорная кислота, 89%-ная 2,8 кг MgSO4 х 7Н2О 1,2 кг 48 г FeSO 4 х Н2О MnSO4 х Н2О 48 г ZnS0 4 х НгО 2,4 г CuSO4 х 5Н г О 0,3 г Биотин 0,6 г Тиамин х HCI 0,4 г NH4OH (2-3%) 80 кг Вода 740 кг РН 7.0 Во время фазы продуцирования значение рН поддерживается 7,3. После израсходования помещенного в среду сахара согласно заявляемому здесь изобретению во время фазы "подкормки" концентрация ассимилируемого сахара не превышает 1 г/л, измеряемая концентрация лейцина ниже 0,05 г/л. По окончании ферментации степень конверсии сахара в лизин (в виде Lys x НО) составляет 32,3%, содержание лизинового основания в лишенном биомассы, 27034 выпаренном ферментативном бульоне составляет 54,7%. П р и м е р 4 (сравнительный). • Приготовление инокулята, параметры способа, а также среды в фазе роста и в продуцирующей фазе соответствует указанным в примере 3 условиям. Впрочем теперь подкармливают со скоростью дозировки 100 л/час. Благодаря этому, после израсходования введенного в среду роста количества сахара измеряемые концентрации ассимилируемого сахара, во время периода подкормки всегда отчетливо выше 5 г/л, однако, измеряемые концентрациилейцина остается, как и прежде ниже 0,05 г/л. Степень конверсии сахара в лизин (в расчете на Lys x HCI) по окончании ферментации составляет 30,9%, содержание лмзинового основания в лишенном биомассы бульоне ферментации составляет ^43,5%. П р и м е р 5 (сравнительный). Среда культивирования, роста и продуцирования соответствуют по своему составу средам примера 1, с тем различием, что глюкоза в среде роста заменена 25 г/л сахарозы, в продуцирующей среде глюкоза заменена 564 г/л сахарозы: параметры инкубации, включая, приготовление инокулята, также идентичны. В маленький ферментер с мешалкой и аэрацией помещают 0,82 кг (0,8 л) стерильной среды роста. 5 10 15 20 25 30 10 К этому раствору при 33-35°С добавляют 0,1 л затравки Corynebacterium glutamicum DSM 5715. После достижения оптической плотпости ЗО {535 мм) в течение 24-х часов непрерывно добавляют 533 г (430 мл) продуцирующей среды. Во время подкормки измеряемое содержание сахара всегда выше 5 г/л в среде ферментации, содержание лейцина после израсходования помещенного в среду роста количества, всегда выше 0,05 г/л. По окончании ферментации в среде определяют 74 г лизина в виде Lys x HCI, что соответствует степени конверсии 27% при использовании общего количества сахарозы 275 г. Содержание лизина во всей сухой массе составляет 30,5 %. В опыте также со штаммом DSM 5715, в котором все параметры сред и инкубации идентичны условиям опыта 5, продуцирующую среду добавляют в течение 39 часов непрерывно. Согласно заявляемому здесь способу в период подкормки после израсходования помещенного в среду роста углерода и лейцина, действительная концентрация сахарозы ниже 1 г/л, концентрация лейцина ниже 0,05 г/л. По окончании ферментации в среде определено 89 г лизина (в виде лизин х HCI); степень конверсии составляет 32%, Содержание лизинового основания «о всей сухой массе составляет 36,3%. " Упорядник Техред М. Келемеш Коректор М. Самборська Замовлення 548 Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101