Мононатрій глутаміл-триптофан, який має імуностимулюючу дію, та спосіб його одержання

н ,- с н - соол/а, Сії с— о II II і проявляє імуностймулюючу дію, та спосібу її одержання. Винахід може бути використаний у фармацевтичній промисловості для одержання лікувального препарату імуностимулюючої дії. На цей час відомі імуностимулюючі препарати, які впливають на реакції клітинного гуморального імунітетеу і неспецифічну резистентність організму. Зокрема, відомий препарат "Тималін" (Машковский М Ф., "Лікарські засоби", М, "Медицина", ч.2, 1993, с. 193), ию являє собою імуноактивний пептид, який виділений з природного препарата тимуса методом рідинної хромотографії високого тиску. Проте, згаданий препарат не має достатніх фармакологічних властивостей, а спосіб його одержання в потрібній мірі не задовольняє простоті і відносно низької вартості. Найбільш близьким до об'єкту, ию заявляється, за призначенням і структурними особливостями, є препарат "тимоген" L-глутамілтриптофон (Трниус Ф. П., "Фармакотерапевтичний довідник", Київ, "Здоров'я", 1998» с 179). Недоліком тимогену є його обмежена розчинність у воді та фізіологічному розчині, про що зазначено, наприклад, у ("Аналітичному паспорті на тимоген", Всесоюзний центр пептидних препаратів "Пептос.", 1996). Внаслідок обмеженої розчинності тимогену в ампулах лікарської форми для ін'єкцій (0,01%-ний розчин, ВФС42-І98І-90) виникає випадання деякої кількості вільних кристалів, що впливає на засвоюваність препарату в організм та погіршує фармакологічні властивості препарату. Крім того, з цього виникає, що при збереженні ін'єкційної форми препарату відбувається знищення його біологічної активності. Спосіб одержання тимогену характеризується багатостадійністю: одержання бензилового ефіру L-глутамілової кислоти; одержання бензилового ефіру карбобензокси- L-глутамілової кислоти; синтез дициклогексилкарбодіїміду; синтез М-бензилоксікарбоніл-(у - бензил) - глутамія-триптофануж; видалення N - і С -захисних груп; видалення і очищення глутаміл-триптофану. Внаслідок виконання всіх вищезазначених стадій вихід цільового продукту є низьким і складає 50%. Сполука, що заявляється, її властивості і спосіб одержання в патентах і науковій літературі не описані. Задачею цього винаходу є створення імуностимулюючого препарату на основі нової хімічної речовини, природа якої дозволяє покращити його формакологічні властивості, а технологічні особливості його одержання спрямовані на збільшення виходу цільового продукту. Задача, що поставлена, вирішується тим, що авторами цього винаходу запропонований спосіб одержання мононатрій глутаміл-триптофану, який полягає в тому, що згідно з винаходом, до М-карбобензокси-(у - бензил)глутаміл-триптофану додають метанол до повного його розчинення, потім у одержаний розчин вносять, як каталізатор, 3-4% - ний паладій на вугілні та через реакційну суміш пропускають водень до повного зникнення вихідного продукту, потім додають розчин їдкого натру при мольному співвідношенні N-Kap6o6eH3OKcn-(y - бензил)глутаміл-триптофан : каталізатор : їдкий натр, рівному 1 : 0.01 : 1, суміш нагрівають до 40-60 °С, витримують до повного розчинення осаду, після чого з одержаної суміші відганяють метанол, відділяють каталізатор, а до фільтрату додають ізопропанол і при температурі 0-4 °С витримують суміш до повного висадження цільового продукту, який піддають остаточному очищенню. В основі одержання мононатрій глутаміл-триптофану лежать наступні хімічні реакції: 0 г с- л/н-сн- too-t irt G^ Авторами цього винаходу показано,' що повнота реакції, і отже найбільший вихід продукту, будуть мати місце при стехіометричному співвідношенні реагуючих компонентів, а саме N - карбобензокеи - (у- бензил) глутаміл-триптофану і їдкого натру, крім того для цих умов потрібні необхідні кількості каталізатора гідрування - його мольна кількість співвідноситься з вищезгаданими компонентами, як 1 :0.01 .1. Всі інші температурні та часові параметри способу обумовлені вимогами найбільшої розчинності реакційних компонентів і найбільшого виходу цільового продукту. Крім того, запропоновані умови способу передбачають нейтралізацію тільки однієї карбоксильної групи, яка має більш високу кислотність і визначає повну розчинність сполуки, ідо необхідно для створення лікарської форми. Винахід пояснюється прикладом конкретного виконання. Приклад. У плоскодонну колбу з високим горлом ємністю 1,5 л завантажують 136 г (0, 244 г, моль) М-карбобензокси-(у - бензил)глутаміл-триптофану і додають метанол до повного розчинення осаду (~ 800 мг). Потім завантажують суспензію 5г каталізатору (3-5% паладій на вугліХ U 9 (0,002 г-ат,) Р& Колбу наділяють барботером для подавання водню і виходом під витяжку і встановлюють на магнітну мішалку. При перемішуванні при кімнатній температурі через барботер пропускають струм водню на протязі 15-20 годин. В процесі відновлення випадає слаборозчинний осад вільного глутамілтриптофану. Закінчення відновлення визначають відбором проб для тонкошарової хроматографії у системі бутанол-оутова кислота-вода 4 : 1 : І на пластинках "Сілуфол" Гідрування припиняють при повній відсутності вихідної речовини з Rf-0,9 і присутності плями вільного глутаміл-трнптофаиу з Rf-O,52 і глутамінової кислоти з Rf-0,9. При перемішуванні до колби додають розчин 10 г (0,25 г-мол) їдкого натру в 250 мл води» нагрівають до 40-60 °С. При цьому весь осад розчиняється. Потім переливають реакційну суміш у клуглодонну колбу на 2 л і відгоняють -300 мл метанолу, додають 150 мл води, нагрівають до слабкого кипіння і відфільтровують каталізатор. З фільтрату відганяють ще -400-450 мл розчинника на роторному випарнику при 40 °С. До залишку поступово при перемішуванні додають 1 л ізопропанолу. Розчин охолоджують і залишають в холодильнику при температурі -2 °С на ніч. Осад, який випав, відфільтровують, промивають 20 - 30 мл холодної води, 2 - 30 мл холодного ізопропанолу. Осад піддають тонкошарової хроматографії в тій же системі. При цьому присутні дві плями: з Rf=0,5 (глутаміл-триптофан) і з Rf=0,2 (глутамінова кислота). Для очистки від глутамінової кислоти осад розчиняють у 300 мл гарячої води, додають ї л ізопропанолу і залишають у холодильнику (0-2 °С) на ніч. Осад відфільтровують, на фільтрі промивають аналогічно, віджимають і сушать на повітрі. Одержують 70,4 г (74%) мононатрій глутамш-триптофану. За тонкошаровою хроматографією присутня тільки одна пляма з RfM),5. Осад сушать у вакуум-ексикаторі при 3040 °С до постійної маси. Одержаний білий аморфний порошок піддають аналізу. Для доказу складу одержаного продукту був зроблений його якісний і кількісний аналіз: Знайдено, мас. %: С 54,08; 54,10; Н 5,21, 5,23; N 11,78; 18,90; Na 6,32; 628 Вираховано, мас. %: С 54,05; Н 5,10; N 11,88; Na 6,47 Згідно з даними, шо були одержані, хімічна сполука, яка заявляється, відіювідас формулі: CjfiHj^OjNa, Молекулярна масз дорівнює 355, 57. Крім того була зроблена ідентифікація одержаної речовини методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) при наступних умовах: елюент А (0,05%-на оцтова кислота у воді), елюент В (ацетонітрил). Готують І5%-ний за об'ємом розчин В в А. Колонка заповнена оберненофззиим носієм Separon SYxcIS, розмір часток 5 мк. Витрати елюенту - 0,4 мл/хв., детектування на довжині хвилі 280 нм. За таких умов час витримування речовини, що заявляється, складає 17,5 хв., що є її індивідуальною характеристикою. Коефіцієнт молярної екстинції мононатрій глутаміл-триптофану складає 1=5500 л.моль" ] 'см , а його розчинність у воді - 7%. Для визначення структури сполуки, яка заявляється, був знятий ультрафіолетовий спектр в зоні від 250 до 300 нм, який має максимум поглинання (280 +- 2)нм і перегин (286 +-2)нм. Структура мононатрій глутаміл-триптофану підтверджена методом протонного магнітного резонансу (ПМР) в діметилсульфоксиді (ДМСО-Д6). В одержаних спектрах є наступні хімічні зсуви протонів; NH 6=^7,94 м.д.; протони групп СН бензольного кільця 6=7,52 м.д.(Д), 6=7,27 м.д.(Д), 6=7,0 м.д.(Т) і 6=6,91 м.д.(Т); протони групп СН індольного кільця 6=7,08 м.д. і б==4,18 м.д.; групи СН2 6=3,21 м.д.(Т), 6=1,766 м.д. (Т), групи СН 6=2,22 м.д. Протони групи NH пептидної зшивки 6=10,7 м.д. Таким чином, одержані дані підтвердили будову продукту мононатрій глутамштриптофана, що заявляється. Визначено, що рКа карбоксильної групитриптафанового фрагменту складає 2,5, а карбоксильної групи глутаміновото фрагменту - 4, при додаванні І молю їдкого натру до 1 молю глютамілтриптофану виникає нейтралізація пдроксила триптофана. Авторами цього винаходу була доведена імуностимулююча дія сполуки, що заявляється. Методика визначення біологічної активності базується на здатності низькомолекулярних гормонів вилочкової залози; стимулювати активність Т-дімфоцитів і відновлювати кількість лейкоцитів периферичної крові. Зміну активності Т-лімфоцитів вивчали в розеткоутворенні лімфоцитів з еритроцитами барана. (Шляхов Э.Н., Андриеш Л. П., Иммунология, "Щтиинда", Кишенев, 1985, с. 278). З гепаринизованої крові здорового донора виділяли лімфоцити в градієнті іустини фікола - 1,078. Клітини відмивали у середовищі 199 та інкубували сполукою, яка заявляється, з різними концентраціями з розрахунку 0,1, 1,0, 10, 50 мкг на 1 млн клітин в об'ємі 0,5 мл середовища на протязі 0,5 години, відмивали після інкубації. До клітинного осаду додавали 0,5 мл середовища і 0,2 мл еритроцитів барана (0,01 - млн. клітин/мг), відмитих і розведених середовищем. Після 60 хв. інкубації в термостаті про 37 °С до суспензії додавали глутаровий альдегід і залишали на ніч у холодильнику. Осад обережно наносили на скло, мазок фіксували метанолом і підраховували процент розеткоутворення клітин до загального числа лімфоцитів. Введення мононатрій глутаміл-триптофану в інкубаційне середовище стимулювало розеткоугворення в діапазоні доз 0,1 - 10,0 мкг. Активність препарату визначають за різницею між контролем (спонтанне розеткоутворення без додавання препарату) і його додаванням в різних концентраціях. За таких умов введення тимогену в інкубаційне середовище стимулювала розеткоутворювальну функцію лімфоцитів (23, 6% в контролі, 25,6, 44,5, 54,6, 62,5% при додаванні, відповідно, 0,1, 1,0,10, 50 мкг препарату на 1 млн клітин). Таким чином введення тимогену в інкубаційне середовище стимулює Fрозеткоутворення ~ на 25% в порівнянні з контролем. Сполуку, яка заявляється, застосовують у дорослих і дітей як імуномодулятор при станах і захворюваннях, які супроводжуються пригніченням імунітету. Порошок мононатрій глутаміл-триптофану розчиняють в ізотонічному розчині хлориду натрію і випускають у вигляді стерильного розчину в ампулах і тюбик - капельницях по 1 мл (з вмістом препарату по 100 мкг в ампулі або тюбик - крапельниці). Застосовують внутрішньом'язово або інтронозально в наступних дозах: для дорослих по 50-100 мкг(300-Ш00 мкг на курс лікування). Термін лікування 3-Ю днів в залежності від вираженості імунодефіциту. З профілактичною метою Його застосовують також внутрішньом'язово і інтронозально щоденно: дорослим по 50-100 мкг, дітям по 10-50 мкг (2-10 крапель) на протязі 3-5 днів. Одержано наступні результати: Скорочуються терміни лікування наступних захворювань; псевдотуберкульоз на 21%; ГРВУ на 46,5%; паранозальні синуси на 55,6%; пухлини щелепно - лицьової області на 20-30%; гострі запалювальні захворювання жіночих статевих органів на 16,5%; кардіохірургічні хворі у післяопераційному періоді на 14-17%. Сукупність вказаних дій і режимів у сполученні з вибраними авторами реакційними продуктами, що використовуються у способі, який заявляється, дозволяє максимально покращити фармакологічні властивості імуностимулюючої речовини, яка заявляється, і в першу чергу, збільшити терміни зберігання, при цьому зберегти на необхідному рівні її біологічну активність і збільшити вихід цільового продукту до 74%.