Спосіб визначення біотрансформації сполуки n(1)-(1′,1′-дифтор-2′-бром-2′-хлоретил)-5-фторурацил з потенційними протипухлинними властивостями

Спосіб визначення біотрансформації сполуки N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5фтор урацил з потенційними протипухлинними властивостями шляхом проведення тонкошарової хроматографії, який відрізняється тим, що до 3 36508 Суть корисної моделі полягає в тому, що до проведення хроматографування щурам-носіям пухлини вводять розчин сполуки N(1)-(1',1'-дифтор2'-бром-2'-хлоретил)-5-фторурацил від 25мг/кг до 32мг/кг, через 30 хвилин проводять забір крові та отримують витяжку з пухлини, хроматографують окремо, результати хроматографування порівнюють з результатами контролю і при виявлення відповідного рівню розташування плям на хроматограмі обох сполук визначають біотрансформацію сполуки N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5фтор урацил. Спосіб здійснюється наступним чином: в умовах in vi vo та in vitro за допомогою методу тонкошарової хроматографії (далі, ТШХ), що виконують на пластинці - сілікагель F254 у системі розчинників - хлороформ-спирт 96% у співвідношенні 2:1, під час вивчення протипухлинної активності сполуки на моделях експериментального пухлинного зросту різного гістогенезу: Лімфосаркомі Пліса, Карциномі Герена, Саркомі 45. Сполуку N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'хлоретил)-5-фтор урацил (далі сполука) з потенційними протипухлинними властивостями отримують шляхом взаємодії відомого реагенту та складової лікарських засобів 5-фторурацилу з фторотаном молярному співвідношенні 1:1 [3]. Реакції проводять у системі розчинників (бензол-диметилформамід) в умовах міжфазного каталізу дибензо-18-краун-6-ефіром в лужному середовищі з метою забезпечення отримання сполуки 4 N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5фтор урацил з потенційними протипухлинними властивостями. Були проведені випробування in vi vo по розподілу сполуки N(1)-(1',1'-дифтор-2'бром-2'-хлоретил)-5-фторурацил в організмі тварини. Експерименти щодо визначення біотранформації сполуки в організмі піддослідної тварини проводять на щурах з масою тіла 160±20г (кількість тварин - 10). Оскільки структурні аналоги сполуки в літературі не описано препаратами порівняння були відібрані 5-фторурацил та препарат ФП-8 (складові: 5-фторурацил та натрієва сіль дифенілфосфорної кислоти). Критерієм оцінки вважалася відповідність розташування плям досліджуваних сполук на хроматограмі після проявлення їх за допомогою опромінення в УФ-світлі при довжині хвилі 254нм. На першому етапі дослідження з метою отримання даних по розподілу чистих речовин на хроматограмі хроматографують досліджувані розчини чистих речовин - 5-фторурацилу, дифенілфосфорної кислоти та її солі у порівнянні з препаратом ФП-8 (складові: 5-фторурацил та натрієва сіль дифенілфосфорної кислоти) в системі розчинників: хлороформ-спирт 96% (2:1). Отримані хроматограми підтверджують, що сполука ФП-8 піднімається розчинниками по пластинці двома окремими плямами, (таблиця 1), (Фіг.1). Таблиця 1 Дані щодо розподілу на хроматограмі чистих речовин: 5-фтор урацилу, ди феніл фосфорної кислоти та її солі у порівнянні з препаратом ФП-8 в системі розчинників: хлороформ-спирт 96% (2:1) Назва сполуки 5-фторурацил дифенілфосфорна кислота дифенілфосфорної кислоти натрієва сіль Стан (знаходження) чиста речовина, розчин в метанолі чиста речовина, розчин в метанолі Значення Rf 0,6 0,18 чиста речовина, розчин в метанолі 0,18 ФП-8 Розчин препарату в метанолі 0,15 0,6 На Фіг.1 зображена хроматограма розподілу чистих речовин: 5-фторурацилу, ди фенілфосфорної кислоти та її солі у порівнянні з препаратом ФП-8 в системі розчинників: хлороформ-спирт 96% (2:1). Де: 1. Розчин ФП-8 в метанолі (Rf~0,15 та Rf~0,6). 2. Розчин 5-фторурацилу в метанолі (Rf~0,6). 3. Розчин натрієвої солі дифенілфосфорної кислоти в метанолі (Rf~0,18). 4. Розчин дифенілфосфорної кислоти в метанолі (Rf~0,18). Інших плям не спостерігається. Речовина ФП-8 являє собою координаційну структур у (сполуку 5-фтор урацилу та натрієвої солі дифенілфосфорної кислоти). Спочатку підбирають хроматографічну пластинку та систему розчинників, щоб пляма речовини піднімалася зі старту та була компактною. Пластинка - сілікагель F254, система розчинників - хлороформ-спирт 96% у співвідношенні 2:1. Після елюювання та висушування пластинку проявляють в УФ-світлі при дов жині хвилі 254нм. В наданій системі розчинників (як і в інших, менш ефективних), досліджуваний препарат піднімався по пластинці двома окремими плямами. Щоб впевнитись, що ці плями відповідають 5-фторурацилу та натрієвій солі дифенілфосфорної кислоти, на одну пластинку поряд з препаратом окремо наносять розчини його складових. На хроматограмі чітко видно, що сполука ФП-8 піднімається на пластинці двома окремими плямами, які відповідають хроматограмам розчинів 5фтор урацилу і дифенілфосфорної кислоти. При цьому пляма дифенілфосфорної кислоти в препараті дещо нижче, ніж відповідна пляма в окремому розчині. На другому етапі дослідження проводять випробування in vivo по розподілу сполуки N(1)-(1',1'дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5-фторурацил в організмі тварини. Розподіл сполуки N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'хлоретил)-5-фтор урацил в організмі щура 5 36508 пухлиноносія досліджують методом тонкошарової хроматографії у порівнянні із препаратом - стандартом 5-фторурацилом та препаратом ФП-8 (складові: 5-фторурацил та натрієва сіль дифенілфосфорної кислоти). Спочатку з метою отримання даних по розподілу чисти х речовин на хроматограмі хроматографують досліджувані розчини чистих речовин - N(1)(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5-фторурацил, 5-фторурацилу у порівнянні з препаратом ФП-8 (складові: 5-фторурацил та натрієва сіль дифенілфосфорної кислоти) в системі розчинників: хлороформ-спирт 96% (2:1) при t°20,6°C. Для отримання хроматограми готують розчини: N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5фтор урацил -у 10мг в 5мл спирту 96% (10мкл); 6 - 5-фторурацилу 5мг в 10мл спирту 96% (10мкл); - ФП-8 10мг в 10мл спирту 96% (10мкл). За методикою виконують процедуру хроматографування: пластинка - сілікагель F254, система розчинників - хлороформ-спирт 96% у співвідношенні 2:1. Після елюювання та висушування пластинку проявляють в УФ-світлі при довжині хвилі 254 нм. В наданій системі розчинників досліджувана сполука N(1)-(l',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)5-фторурацил та 5-фторурацил піднімалися по пластинці однією плямою (для кожної сполуки), що знаходилися на одному рівні. На хроматограмі чітко видно, що сполука ФП-8 піднімається на пластинці двома окремими плямами, які відповідають хроматограмам розчинів 5-фторурацилу та N(1)(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5-фторурацил і дифенілфосфорної кислоти, (таблиця 2), (Фіг.2). Таблиця 2 Дані щодо розподілу на хроматограмі чистих речовин: N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5-фторурацилу, 5-фторурацилу у порівнянні з препаратом ФП-8 в системі розчинніків: хлороформ-спирт 96% (2:1) при t°20,6°C Назва сполуки N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5-фторурацил 5-фторурацил Стан (знаходження) чиста речовина, розчин в метанолі чиста речовина, розчин в метанолі ФП-8 Розчин препарату в метанолі На Фіг.2 зображена хроматограма розподілу чистих речовин: N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'хлоретил)-5-фтор урацил-у, 5-фтор урацилу у порівнянні з препаратом ФП-8 в системі розчинників: хлороформ-спирт 96% (2:1) при t°20,6°C. Де: 1. Розчин N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'хлоретил)-5-фтор урацил -у в метанолі (Rf~0,6). 2. Розчин 5-фторурацилу в метанолі (Rf~0,6). 3. Розчин ФП-8 в метанолі (Rf~0,15 та Rf~0,6). Інших плям не спостерігається. Для проведення випробування in vivo по розподілу сполуки N(i)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'хлоретил)-5-фтор урацил в організмі тварини, у піддослідного щура-носія пухлини через 30хв. після введення лікарської дози (від 25 до 32мг/кг) сполуки N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5фтор урацил беруть кров та пухлин у. Із крові одержують центрифугуванням сироватку, а із подрібненої пухлини проводять екстракцію сполуки N(1)(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5-фторурацил ізоаміловим спиртом та ізотонічним розчином (суспензії центрифугують протягом 40хв. при 8000 об/хв). Надосадочні рідини наносять на пластинку одразу після одержання (пластинка - сілікагель F254, система розчинників - хлороформ-спирт 96% у співвідношенні 2:1; проявлення - УФопромінення. У якості препаратів-стандартів використовують 5-фторурацил та препарат ФП-8. Із наведеної хроматограми видно, що в сиворотці крові знаходиться 5-фторурацил-метаболіт сполуки N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5фтор урацил - пляма менш насичена, ніж на хроматограмі розподілу чистих речовин: N(1)-(1',1' Значення Rf 0,6 0,6 0,15 0,6 дифтор-2'-бром- 2'-хлоретил)-5-фторурацил, 5фтор урацилу у порівнянні з препаратом ФП-8 в системі розчинників: хлороформ-спирт 96% (2:1) при t°20,6°C. Також спостерігаються більш насичені плями, що відповідають складовим препарату ФП-8 (5-фторурацил та натрієва сіль дифенілфосфорної кислоти) та 5-фторурацилу, (Фіг.3). На Фіг.3 зображена хроматограма розподілу діючої речовиниN(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'хлоретил)-5-фтор урацил-у в сиворотці крові піддослідної тварини, препаратів-стандартів, штучно нанесених на хроматографічну пластинку, 5фтор урацилу та препарату ФП-8 в системі розчинників: хлороформ-спирт 96% (2:1). Де: 1. Сироватка крові - пляма метаболіту сполуки N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5фтор урацил-у (Rf~0,6). 2. Розчин 5-фторурацилу в метанолі (Rf~0,6). 3. Розчин ФП-8 в метанолі (Rf~0,15 та Rf~0,6). На хроматограмі (Фіг.4) екстракту із пухлини плям багато, але присутня пляма, відповідна метаболіту сполуки N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'хлоретил)-5-фтор урацил-у - 5-фторурацилу, а також плями препаратів-стандартів, штучно нанесених на хроматографічну пластинку, 5-фторурацилу та препарату ФП-8 в системі розчинників: хлороформ-спирт 96% (2:1). На Фіг.4 зображена хроматограма розподілу діючої речовини N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'хлоретил)-5-фтор урацил-у в витяжці з пухлини піддослідної тварини, препаратів-стандартів, штучно нанесених на хроматографічну пластинку, 5фтор урацилу та препарату ФП-8 в системі розчинників: хлороформ-спирт 96% (2:1). Де: 1. Витяжка з 7 36508 пухлини - пляма метаболіту сполуки N(1)-(1',1'дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5-фторурацил-у - 5фтор урацилу (Rf~0,6). 2. Розчин 5-фторурацилу в метанолі (Rf~0,6). 3. Розчин ФП-8 в метанолі (Rf~0,15 та Rf~0,6). 8 Із наведених хроматограм (Фіг.3, 4) видно, що 5-фторурацил є і в сиворотці крові і в витяжці з пухлини піддослідної тварини через 30хв. після введення лікарської дози сполуки N(1)-(1',1'дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5-фторурацил, (таблиця 3). Таблиця 3 Дані щодо розподілу на хроматограмі плям речовини N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5-фторурацил, яка міститься в сироватці крові та у витяжці з пухлини піддослідної тварини, препаратів-стандартів, штучно нанесених на хроматографічну пластинку, 5-фторурацилу у порівнянні з препаратом ФП-8 в системі розчинників: хлороформ-спирт 96% (2:1) Назва сполуки N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'хлоретил)-5-фтор урацил N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'хлоретил)-5-фтор урацил 5-фторурацил Стан (знаходження) Значення Rf сиворотка крові 0,6 витяжка з пухлини 0,6 чиста речовина, розчин в метанолі 0,6 0,15 0,6 ФП-8 розчин препарату в метанолі Таким чином, сполука N(1)-(1',1'-дифтор-2'бром-2'-хлоретил)-5-фторурацил може утворювати діючі фрагменти молекули in vitro (5-фторурацил та фрагмент молекули фторотану з фармакофор Cl O Br C metabolizm N F O H HN O ними властивостями СlВrНС-F2С-), що має бути властивістю всієї гр упи близьких за будовою сполук (схема 1). C* F F N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5-фторулацил Завданням корисної моделі є спосіб визначення біотранформації гетеоциклічної сполуки N(1)(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5-фторурацил з потенційними протипухлинними властивостями в умовах in vivo та in vitro за допомогою методу ТШХ (пластинка - сілікагель F254, система розчинників хлороформ-спирт 96% у співвідношенні 2:1) під час вивчення протипухлинної активності сполуки на моделях експериментального пухлинного зросту різного гістогенезу: Лімфосаркомі Пліса, Карциномі Герена, Саркомі 45. В результаті дослідження за допомогою хроматографічного методу знайдено, що 5фтор урацил є і в сиворотці крові і в витяжці з пухлини піддослідної тварини через 30хв. після введення лікарської дози сполуки N(1)-(1',1'-дифтор-2'бром-2'-хлоретил)-5-фторурацил. Таким чином, F HN O +ClBrHC-CF2 N H 5-фторулацил фрагмент молекули фторотану можна вважати, що основним метаболітом сполуки N(1)-(1',1'-дифтор-2'-бром-2'-хлоретил)-5фтор урацил є 5-фторурацил. Література. 1. Соединения фтора. Синтез и применение. / Под ред. Н. Исикава. - М.: Мир, 1990.-Гл.5.-С.183265. 2. Ягупольский Л.М. // Ароматические и гетероциклические соединения с фторсодержащими заместителями. - Киев: Наукова думка, 1988.-С.90105. 3. Губський Ю.І., Вельчинська О.В. Спосіб отримання речовини з потенційними фізіологічними властивостями 1-(1’,1’-дифтор-2'-бром-2'хлоретил)-5-фтор урацил. Патент на корисну модель. 29535.C07D239, А61КЗЗ/16. С07 С 21/00. 10.01.2008. Бюл. №1, стор. 29535. 9 36508 10 11 Комп’ютерна в ерстка Л. Купенко 36508 Підписне 12 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601