Місцевий протизапальний та імуномодулюючий засіб

Місцевий протизапальний та імуномодулюючии засіб, що містить 99,0% імуноглобулінових фракцій, який відрізняється тим, що у своєму складі містить 15-16 мг/мл протеїну, з котрого 98,0-99,0% складає slgA, решта - лизоцим, лактоферин і а1-антитрипсин, та сировиною для його здобуття є жіноче молозиво Винахід відноситься до області медицини, а точніше до біологічних засобів, що підвищують антиінфекційний захист і імунітет дихальної системи (ІДС) для попередження й усунення гострої дихальної недостатності (ГДН), обумовленої інфекційно-запальними процесами в трахеобронхіальному дереві, зокрема при опіку дихальних шляхів, а також у хворих бронхітом, бронхіальною астмою, пневмонією Воно може бути використане у відділеннях інтенсивної терапії, пульмонології, а також в інших відділеннях терапевтичного профілю, де знаходяться на лікуванні, хворі з захворюваннями органів дихання тільки клітинного агента ІДС (див а с СРСР №197672, ас СРСР № 1132946, ас СРСР № 1210833) і відсутніх в усіх них вплив на гуморальну ланку ІДС, що наймає результати лікування хворих з ГДН, - не усуває в трахеобронхіальному дереві, що саме головне дефіцит slgA (див а с СРСР №1197672, ас СРСР № 1210833, а с №1132946, ас №1153921, ас №102833), - зберігається можливість місцевої алерпзацм органів дихання й організму в цілому, розвитки алергічних реакцій у цілому і різних ускладненнях (див а с СРСР № 1197672, а с № 102833, а с №1132946) Найбільше близьким рішенням щодо запропонованого винаходу є імуноглобулін людський нормальний Прототип описаний, наприклад, у книзі В М Русланов, Л И Скобелев Функционирование препаратов плазмы в производстве препаратов крови М "Медицина", 1983, стр 79-105 Виготовляють імуноглобулін людський нормальний із сироватки крові донорів шляхом осадження білків у градієнті етанолу при негативних температурах і різних показниках рН У результаті фракціонування одержують 90-99% імуноглобулінових фракцій 3 них 95% маси складає IgG, інше, ІдА і ІдМ У КЛІНІЧНІЙ практиці прототип застосовують для внутрішньом'язового введення у вигляді 10-16% розчину Може застосовуватися імуноглобулін людський нормальний місцевий наприклад, для інстиляції або підкон'юнктивальних уведень (ВИ Морозов, А А Яковлев, Фармакотерапія очних хвороб М "Медицина" 1989, стор 91-94) Проведено пошук аналогів по патентному фонду Луганського ЦНТІ і Луганського державного медичного університету, в основному по головних країнах світу Аналогів сукупності частини ознак, що збігаються із сукупністю істотних ознак щодо пропонованого об'єкта не виявлено Однак виявлений ряд аналогів, що мають схожі рішення і представляють визначений інтерес До них варто віднести "Спосіб лікування бронхеолопчних захворювань", авт свід СРСР № від 1985 р , "Спосіб лікування імунної недостатності", авт свід СРСР № 132946 від 1985 р , "Спосіб лікування неспецифічних ендобронхітів", авт свід СРСР №1153921 від 1985 р, "Спосіб лікування бронхіальної астми", авт свід СРСР №1028331 від 1983 р, "Спосіб лікування гострих респіраторних вірусних інфекцій у новонароджених дітей із гнійно-септичними захворюваннями", авт свід СРСР №210833 від 1986 р - Визначаючи позитивну ЦІННІСТЬ КОЖНОГО ана лога, варто констатувати, що вони мають і визначені нестачі, що полягають утому, що вплив лікарських препаратів забезпечується на рівні Однак, поряд з оригінальністю й ефективністю прототипу, він має ряд недоліків 00 ю 42258 1 Імуноглобулін людський не містить таких біологічно активних пептидів, як наприклад, лизоцим, лактоферин, а1-антитрипсин 2 Не містить у своєму складі секреторного компонента ІдА і не заповнює його дефіцит 3 Не повною мірою впливає на ріст і розмноження нетипоспецифічних вірусів і бактерій 4 Прототип не реалізує при місцевому його застосуванні в органах подихи добре відомої антивірусної і антибактеріальної активності ІдА, дефіцит якого, як відомо, приводить до виникнення і підтримки запальних процесів у трахеобронхіальному дереві та легень У основу винаходу поставлена задача створити лікарський засіб для місцевого застосування, що володіє вираженим антибактеріальним і антивірусним ефектом на основі сироватки молозива людини, що дозволяє значно підвищувати антиінфекційний захист і імунну реактивність органів дихання Крім того, задачею одночасно є створення в лікарському засобі складових речовин, що відносяться до біологічно активних пептидів, що постійно зустрічаються в організмі людини, і немаючих відношення до ксенобютиків Задача містила в собі також усунення на фоні застосування винаходу в трахеобронхіальному дереві дефіциту секреторного компонента ІдА, лизоцима, лактоферина і а1антитрипсина Зазначена мета та поставлена задача вирішується шляхом місцевого застосування протизапального і імуномодулюючого засобу, під умовною назвою "Молозін", який у своєму складі містить 15-16 мг/мл протеїну, з якого секреторний імуноглобулін A slg складає 98,0-99,0, - решта а1-антитрипсин лизоцим, лактоферин, для здобуття якого сировиною є жіноче молозиво Одержання у складі методики одержання "Молозша" лежить метод фракціонування білків плазми крові по КОНУ в градієнті етанолу при негативній температурі і фракціонування білків у градієнті розчину сульфату амонію Сировиною для одержання "Молозша" служить молозиво, зібране у здорових породілей на 2-4 добу після пологів Молозиво обезжирюють шляхом охолодження до -3°С 3 і подальшим центрифугуванні при 1500-2000 1 вхв триразово Знежирене молозиво фільтрують ДВІЧІ через беззольні фільтри, прохолоджують до -3°С 3 і піддають першому фракціонуванню 60% розчином сульфату амонію, для осадження глобулінових фракцій до казеїну Далі розчин центрифугують і віддалиться надосадочна рідина Осад ресуспензується Надалі препарат очищається від складу казеїну і надлишку сульфату амонію шляхом 3-х кратного осадження 26-28% етанолом при рН 5,6-5,7 і Т=5°С Отриману білкову суміш розчиняють у фосфатному буфері, доводячи рН до 7,0-7,2 Надалі отриманий розчин протеїну стерилізується шляхом пастеризації при Т 56°С Отриманий препарат містить 15-16 мг/мл протеїну, з котрого 98,0-99,0% маси складає slgA, інше лізоцим, а1-антитрипсин і лактоферин Технічний результат досягається за рахунок особливого складу препарату і реалізується в підвищенні антиінфекційного захисту і імунітету ди хальної системи як наслідок його безпосереднього впливу на бактерії, віруси і тканини, уражені інфекційним процесом По-перше, молозін за рахунок високого утримання в ньому slgA сприяє значному підвищенню в бронхіальному секреті концентрації цього імуноглобуліну, а, отже, і усуненню дисбалансу в гуморальній ланці імунітету дихальної системи Висока концентрація slgA сприяє виникненню бактерюлізісу в присутності лизоцима і комплементу 3 іншого боку, slgA, створює нерозчинні імунні комплекси з антигенами, що надходять у дихальні шляхи, за допомогою мукоціліарного кліренсу підвищують ефективність їхньої елімінації з дихальних шляхів Крім того, при взаємодії з оболонкою капсульних бактерій, стійких до фагоцитозу, slgA сприяє підвищенню їхної апсонізацм і тим самим посилює фагоцитоз і руйнацію бактерій альвеолярними макрофагами І, нарешті, молозін за рахунок високої концентрації slgA, а також лизоцима, лактоферина і а1-антитрипсина здатний до аглютинування бактерії і віруси, нейтралізувати токсини, блокувати ефект старанності бактерій і вірусів до поверхні слизуватої оболонки і, тим самим, перешкоджати утворенню бактеріальних колоній, дисемінації інфекції в органах дихання й усувати запальні процеси Ефективність молозша була підтверджена в процесі його розробки й експериментальної апробації Порівняння речовини, що пропонується, з прототипом дозволило установити відповідне їхньому критерію "новизна" При вивченні інших відомих аналогів у цій області медицини виявлені ознаки пропонованого винаходу відрізняють його від прототипу і тому вони забезпечують способові, що пропонується, ВІДПОВІДНІСТЬ критерію "ІСТОТНІ ВІДМІННОСТІ" Протизапальна та імуномодулююча активність засобу, що пропонується, була вивчена в умовах експерименту на щурах У досвід брали 100 білих щурів породи "Вістер" чоловіча стать із масою тіла 200-210 г, що містяться на повному раціоні і на яких раніше не проводилося ніяких експериментів Із загального числа тварин виділено 5 груп У 1-у групу увійшло 35 тварин, у яких моделювалося термошгаляційне ураження (ТІУ) без проведення їм надалі місцевого протизапального і імуномодулюючого лікування Ця група служила контролем ефективності лікування "Молозіном" 2-а група - ЗО щурів, у яких моделювалося термошгаляційне ураження У даній групі тварин проводилася місцева імуномоделююча терапія, запропонованим препаратом 3-я група - ЗО тварин, у яких моделювалося ТІУ і ендотрахеально вводився прототип, для вивчення його впливу на органи дихання при ТІУ У 4-у групу ввійшло 5 тварин, у яких не моделювалося ТІУ, але ендотрахеально вводився засіб "Молозін", ЩО пропонується, для вивчення гострої токсичності і впливи на органи дихання 5-у групу склали 10 здорових тварин (контроль), що служили об'єктом для виявлення норми клшікобюхімічних, цитологічних, патоморфолопчних, ГІСТОЛОГІЧНИХ показників Засіб, що пропонується, починали вводити з першої доби після нанесення ТІУ 42258 Після інтубацм трахеї термопластичною трубкою - ендотрахеально вводилося 1 раз на добу 0,1 мл засобу, що пропонується, який містить1,5-1,6 мг/мл протеїну, з якого 1,47-15,8 мг slgA (що складає 98,0-99,0% від загальної КІЛЬКОСТІ протеїну) Перший тиждень через добу, другу, через 3 доби Встановлення доз і кратність уведення вироблені шляхом добору в процесі освоєння і відпрацьовування даного способу, і є за результатами дослідження - оптимальними Ефективність протизапальної активності оцінювали при патолого-анатомічних, цитологічних, бактеріологічних і ГІСТОЛОГІЧНИХ дослідженнях органів дихання, а також стани імунітету дихальної системи, КЛІНІЧНОГО плину захворювання Експериментальним підтвердженням переваг пропонованого засобу над прототипом є дані, наведені у табл 1-6, які вказують на його високу ефективність, низьку токсичність та високу антиінфекційну і протимікробну активність Приклад 1 При дослідженні показників загального стану тварин, які подані в табл 2, було встановлено, що у тварин другої групи, де застосовувався засіб, швидше відновлювалась фізична активність і маса тіла, ніж у тварин, де для лікування застосовувався прототип Крім того, в другій групі фізікальні показники (частота дихання та ЧСС) приходили до нормального стану раніше ніж там, де застосовувався прототип Приклад 2 Досліджували вплив запропонованого засобу на клітинну ланку неспецифічного антиінфекційного захисту дихальних шляхів (табл 3) Дані дослідження показали, що там де застосовувався запропонований засіб вже на третю добу в бронхіальному секреті вірогідно зменшувалась загальна КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН та збільшувалась КІЛЬКІСТЬ лімфоцитів, а до 15-і доби практично повністю відновлювалась цитологічна картина бронхіального секрету Приклад З Вивчали протизапальну ефективність засобу, що пропонується, та вплив на процес регенерації миготливого епітелію (табл 3, 5) Застосування пропонованого засобу сприяло погнобленню запального процесу в трахеобронхіальному дереві, що проявлялось зниженням КІЛЬКОСТІ нейтрофільних лейкоцитів і клітин бронхіального епітелію в лаважній рідині (табл 3) Зменшувались показники дегенерації миготливого епітелію В епітеліальних клітинах збільшувалась активність ферменту сукцінат-депдрогенази (СДГ) до 7-і доби і практично повне відновлення до 15-і доби (табл 5) Приклад 4 Вивчався вплив пропонованого засобу на стан імунокомпітентних клітин на прикладі стану функціональної активності альвеолярного макрофага (AM) (табл 4) В групі тварин, де застосовувався засіб, не виникало грубого пошкодження функції AM Фагоцитарна КІЛЬКІСТЬ, фагоцитарний індекс та бактерицидна здібність AM лишалися достатньо високими протягом експерименту Приклад 5 Вивчали бактеріологічний пейзаж трахеобронхіального дерева з метою встановлення протимікробної активності засобу, що пропонується, результати наведені в табл 6 В групі тварин першої групи, де моделювалося ТІУ, але ніякого лікування не проводилося, летальність склала 82,7% У тварин групи 2, у яких моделювалося ТІУ і з метою імуномодулюючого, протизапального ефекту, ендотрахеально вводився "Молозін", летальність склала 33,3%, а при застосуванні прототипу (група 3) летальність складала 66,6% (табл 1) У групі тварин четвертої групи, де ТІУ не моделювалося, а з метою вивчення гострої токсичності ендотрахеально вводився засіб, що пропонується, летальність була відсутня, показники антиінфекційного захисту, цитограми дихальної системи, дані КЛІНІЧНОГО обстеження відхилень від норми в порівнянні з групою інтактних щурів (група 5) не мали, що вказує на відсутність токсичних ефектів засобу, що пропонується Таким чином, проведені дослідження показали, що використання пропонованого препарату "Молозін" ДОЗВОЛЯЄ значно підвищити місцевий антиінфекційний захист і імунну активність дихальних шляхів Знижує вираженість запальних змін, та в кінцевому рахунку летальність тварин в експерименті Показаннями до застосування пропонованого препарату можуть бути - інфекційно-запальні процеси в трахеобронхіальному дереві, - бронхіти, - бронхіальна астма, - пневмонія Технологічний процес одержання засобу, що пропонується, не вимагає значних матеріальних витрат При подальшій його розробці він може виявитися високоефективним лікарським засобом для лікування інфекційно-запальних процесів дихальних шляхів Дані про гостру токсичність "Молозшу" Гостру токсичність "Молозіну" визначали на білих щурах лінії Вістар обох статей, вагою 160-200 г в строгій ВІДПОВІДНОСТІ з методичними рекомендаціями "Експериментальне вивчення токсичної дії потенційних лікарських засобів", схваленої Президією Фармакологічного комітету МОЗ України (протокол № 2 от 25 02 1999 ) Шлях введення "Молозіну" при визначенні гострої токсичності (внутрішньочеревинно) обрано з урахуванням його КЛІНІЧНОГО використання (парентерально) Кожній групі тварин вводили препарат в різних дозах 500, 1000, 1500, 2000 мг/кг Спостереження за тваринами проводили протягом 14 діб від моменту аплікації препарату Встановлено, що в жодній з досліджуваних груп тварин не відмічається загибель щурів Більш того, за реєструємими, у ВІДПОВІДНОСТІ ДО вище вказаних методичних рекомендацій, можливими ЗОВНІШНІМИ ознаками інтоксикації, не виявлено будь-яких змін в порівнянні з групою інтактних щурів, яким внутрішньочеревинно вводили еквівалентну КІЛЬКІСТЬ ВОДИ ДЛЯ ІН'ЄКЦІЙ Отримані дані дають змогу стверджувати, що вивчаємий препарат "Молозін" в досліджуваних дозах не володіє токсичними ефектами і у ВІДПОВІ 42258 дності до ГОСТ його можна віднести до класу малотоксичних сполук Досліди ПО визначенню гострої токсичності виконані на кафедрі фармакології Луганського державного медичного університету д том Л В Савченковою н , доцен Таблиця 1 Летальність серед тварин на етапах експериментального дослідження Летальність % Група 1 Група 2 Група 3 Група 4 Група 5 (інтактні) Примітка 2-3 доба 60 23,3 Л 50 0 0 5-7 доба 20* 9,7* л 9,9* л 0 0 14-15 доба 2,7* 0 6,7* 0 0 Загальна % 82,7* 33,3* Л ° 66,6* 0 0 *Р