Спосіб диференційної діагностики алергійної та токсичної реакцій на розчинні лікарські засоби in vitro

Спосіб диференщйної діагностики алергійної та токсичної' реакцій на розчинні лікарські засоби in vitro шляхом проведення реакції гальмування міграції лейкоцитів з кров'ю хворого та розчином тестованого лікарського засобу, який відрізняється тим, що в реакції' гальмування міграції лейкоцитів додатково визначають гемоліз еритроцитів від контакту з тестованим лікарським засобом і в разі наявності гемолізу діагностують токсичну реакцію на введення в організм тестованого препарату, в разі одержання значення діагностичного індексу реакції гальмування міграції' лейкоцитів, нижчого за норму, діагностують алергійну реакцію уповільненого типу на тестований препарат, додатково перевіряють в крові хворого рівень ІдЕ загального і, якщо його концентрація в нормі, діагностують відсутність у хворого алергійної реакції миттєвого типу на тестований препарат, якщо ж концентрація ІдЕ загального виходить за межі норми, то додатково перевіряють рівень ІдЕ специфічного та підраховують за його значенням індекс дисоціації і, коли цей індекс нижчий за норму, діагностують алергійну реакцію миттєвого типу, в разі перевищення нормальної величини індексу дисоціації діагностують алергійну реакцію уповільненого типу на тестований препарат. Корисна модель належить до медицини, точніше до алергології, і може бути використана для діагностики негайного та уповільненого типів алергійної, а також токсичної реакцій на прийом розчинних лікарських засобів Лікарська алергія (ЛА) є дуже розповсюдженим та небезпечним захворюванням. В структурі побічних реакцій на ліки ЛА становить 30-40%. В середньому у 2% хворих в Україні виникає ЛА, у 10% з них розвивається анафілактичний шок, який іноді може призвести до летального результату: близько 1000 людей кожний рік в нашій країні помирають від цього ускладнення (Пухлик Б М. Лекарственная аллергия. - К.: Здоров'я, 1989 -96с). Проблема ЛА є однією з найбільш актуальних в сучасній медицині в зв'язку з застосуванням великої кількості лікарських засобів та переважаючою доктриною хіміотерапії захворювань. Завчасно (до прийому ліків) проведене діагностування ЛА на препарат, який збираються вводити хворому, може врятувати йому життя. Серед клінічних проявів ЛА найчастіше зустрі чаються шкірні (50-70%), гематологічні (20-35%) та респіраторні (10-15%). Одним з найнебезпечніших проявів ЛА є анафілактичний шок. Діагностика ЛА ускладнюється, коли реакція виникає на тлі прийому декількох препаратів Ще більш ускладнюється проблема, якщо введення препарату хворому є життєво необхідним або мова йде про професійну ЛА. ЛА може перебігати за негайним чи уповільненим типом реакції'. її необхідно диференціювати від лікарських ускладнень іншого генезу - від токсичних побічних реакцій (їх ще називають "псевдоалергійними"). Клінічні прояви токсичних реакцій можуть помилково діагностуватись як ЛА (Пыцкий В.И., Адрианова Н.В., Артомасова А.В. Аллергические заболевания. - М.. "Триада-Х", 1999 -С.188). Відомі інвазивні (in vivo) способи діагностики алергійної реакції на лікарські засоби - шкірний діагностичний тест, що включає введення під шкіру мікродози препарату, провокаційні тести: назальний, інгаляційний, під'язичний (Бородин Ю.П., Кузнецова М М , Аль-Машат Муаед. Лекарствен Ю 4500 ная аллергия / Сб. науч тр.: Терапевтическая эффективность и побочные действия лекарственных средств. - М., 1980. - С.62-68). Недоліки відомих інвазивних способів діагностики є недиференційованість, суб'єктивізм, небезпечність, недостатня точність (описані випадки анафілактичного шоку з летальним результатом після шкірного тесту з пеніциліном) (Пыцкий В И., Адрианова Н.В., Артомасова А.В. Аллергические заболевания. - М.: 'Триада-Х", 1999. - С.207). Відомий спосіб диференційної діагностики алергійної та токсичної реакцій на розчинні лікарські засоби під назвою "тест деградації базофілів по Шеллі", який виконується in vitro з тучними клітинами кролика або щура (там же, с.208). Відомий спосіб диференційної діагностики алергійної та токсичної реакцій на розчинні лікарські засоби in vitro шляхом тестування звільнення гістаміну сенсибілізованими лейкоцитами після додавання антигена (Потёмкина A.M. Диагностика и лечение аллергических заболеваний у детей. Казань: изд-во Казан, ун-та, 1990. - С.39). Відомий спосіб диференційної діагностики алерпйної та токсичної реакцій на розчинні лікарські засоби in vitro шляхом проведення радіоалергосорбентного тестування сироватки крові хворого для виявлення специфічних імуноглобулінів класу Е (ІдЕ) (Астафьева Н.Г., Горячкина Л.А Лекарственная аллергия. 4 1 / Аллергология. - 2000. - №2. - С.47). Перевагою способів in vitro є безпечність та можливість одномоментно перевіряти сенсибілізацію до декількох лікарських препаратів. Недоліками відомих способів є їх обмеженість (виявлення ЛА лише негайного типу) та низька (не вище 30-50%) точність через наявність хибнопозитивних та хибнонегативних результатів, неекономічність через високу вартість імпортних діагностикумів (Пыцкий В.И., Адрианова Н.В., Артомасова А.В. Аллергические заболевания. - М.: "Триада-Х", 1999.-С.208). Відомий спосіб диференційної діагностики алерпйної1 та токсичної реакцій на розчинні лікарські засоби in vitro шляхом проведення реакції бластного трансформування лейкоцитів периферійної крові під впливом специфічного антигена та неспецифічного стимулятора (Потёмкина A.M. Диагностика и лечение аллергических заболеваний у детей. - Казань: изд-во Казан, ун-та, 1990 С,38). Недоліками відомого способу є його обмеженість (виявлення ЛА лише уповільненого типу) та низька (не вище 50%) точність через наявність хибнопозитивних та хибнонегативних результатів (Пыцкий В.И., Адрианова Н.В., Артомасова А.В. Аллергические заболевания. - М.1 "Триада-Х", 1999.-С.208). Відомий, обраний за прототип, спосіб диференційної діагностики алергійної та токсичної реакцій на розчинні лікарські засоби in vitro, який є найближчим до способу, що заявляється, по суті та досягнутому технічному результату і включає діагностику ЛА уповільненого типу шляхом проведення реакції гальмування міграції лейкоцитів (РГМЛ) з гепаринізованою кров'ю хворого та розчином тестованого лікарського засобу. Відомий спосіб діагностики ґрунтується на вивченні механізму інгібуючої дії одного з лімфокінів (МІФ), який виділяється з сенсибілізованих лімфоцитів при додаванні специфічного антигена до крові хворого іп vitro (Потемкина А М. Диагностика и лечение аллергических заболеваний у детей. - Казань: изд-во Казан, ун-та, 1990. - С.40, 311). Недоліками відомого способу-прототипу є його недостатня інформативність (обмеженість виявленням ЛА лише уповільненого типу) та низькі (6365%) точність та диференційованість результатів діагностики Причиною недостатньої інформативності, низької точності та диференційованості діагностичних показників, одержаних за відомим способомпрототипом є односторонність досліджень стану організму пацієнта, а саме, враховується лише ЛА уповільненого типу. В основу винаходу поставлено задачу в способі диференційної діагностики алергійної та токсичної реакцій на розчинні лікарські засоби in vitro шляхом застосування комплексних методів діагностики визначення негайного та уповільненого типів алергійної, а також токсично! реакцій організму хворого на прийом розчинних лікарських засобів, забезпечити високу точність, інформативність та диференційованість діагнозу, охоплення всіх типів Л А та токсичних реакцій. Врахування результатів диференційної діагностики ЛА дозволяє провести безпечне лікування хворого та підібрати строго індивідуальну корекцію алергійних розладів Спосіб, що заявляється, є високоточним (до 100% співпадання результатів з клінічними спостереженнями), інформативним, безпечним, доступним, економічним, безболісним, зручним для хворого і лікаря. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі диференційної діагностики алергійної та токсичної реакцій на розчинні лікарські засоби in vitro, який включає проведення РГМЛ з кров'ю хворого та розчином тестованого лікарського засобу, новим є те, що в РГМЛ додатково визначають гемоліз еритроцитів від контакту з тестованим лікарським засобом І в разі наявності гемопізу діагностують токсичну реакцію на введення в організм тестованого препарату, в разі одержання значення діагностичного індексу РГМЛ нижчого за норму діагностують алергійну реакцію уповільненого типу на тестований препарат, додатково перевіряють в крові хворого рівень ІдЕ загального і, якщо його концентрація в нормі, діагностують відсутність у хворого алергійної реакції миттєвого типу на тестований препарат, якщо ж концентрація ІдЕ загального виходить за межі норми, то додатково перевіряють рівень ІдЕ специфічного та підраховують за його значенням індекс дисоціації", коли цей індекс нижчий за норму, діагностують алергійну реакцію миттєвого типу, в разі перевищення нормальної величини індексу дисоціації діагностують алергійну реакцію уповільненого типу на тестований препарат. Між сукупністю ознак винаходу і технічним результатом, якого можна досягти при його реалізації, існує причинно-наслідковий зв'язок. Причиною недостатньої точності відомих способів диференційної діагностики є складність ме 4500 ханізмів розвитку та різноманіття проявів ЛА, і тому жоден з відомих способів, як і прототип, не охоплюють визначення всіх механізмів і проявів ЛА та токсичних реакцій на препарати. Вчені розглядають ЛА як специфічну імунну побічну дію лікарського препарату, оскільки на лікарський антиген (антигени) в організмі хворого виробляються специфічні антитіла або сенсибілізовані лімфоцити, І повторне введення даного лікарського препарату викликає імунологічну реакцію, що супроводжується виділенням відповідних медіаторів алергії та класичними клінічними проявами алергії - свербінням, шкірними висипаннями, набряками, ринітом, бронхоспазмом. Як відомо, переважна більшість лікарських препаратів - це неповноцінні алергени-гаптени. Тільки з'єднуючись в організмі з білками сироватки крові, вони набувають властивостей повноцінних алергенів. Проти такого кон'югованого алергена в організмі відбувається накопичення антитіл (сенсибілізація), і при повторному надходженні лікарських препаратів відбувається відомий каскадний процес: взаємодія алергена з антитілами - виділення медіаторів - патофізіологічна реакція - клінічні прояви. Важливо, що кожен лікарський препарат піддається в організмі численним перетворенням, метаболізується і тільки якийсь один визначений метаболіт є кінцевим. До кожного метаболіту в організмі можуть утворюватись антитіла. Вважають, що здатність до сенсибілізації залежить не стільки від хімічної структури лікарського препарату, скільки від характеру його бютрансформування в організмі. Окремі препарати особливо легко зв'язуються з транспортними білками сироватки крові та тканин. Інтенсивніше ці процеси перебігають при наявності запальних змін в організмі. По характеру імунологічної реакції у відповідь на введення препарату, що є антигеном, алергійні реакції подіпяють на реакції негайного типу, обумовлені переважно 1дЕ, цитотоксичні, імунокомплексні реакції, та реакції' уповільненого типу - клітиноопосередковані Т-залежні реакції з участю сенсибілізованих Т-лімфоцитІв. Деякі лікарські препарати можуть викликати в організмі одночасно більше однієї реакції'. ЛА необхідно диференціювати від лікарських ускладнень іншого генезу, зокрема, з найбільш схожими з нею побічними реакціями токсичного генезу ("псевдоалергійні"). Одним з проявів такої реакції* на введення лікарського алергену є токсичний гемоліз еритроцитів крові. За рішенням, що заявляється, передбачено диференційне діагностування ЛА, що перебігає за реакцією негайного типу (визначення ІдЕ загального та специфічного), за реакцією уповільненого типу (проведення РГМЛ), за реакцією токсичного генезу (при проведенні РГМЛ визначення гемолізу еритроцитів). Така комплексна диференційна діагностика дозволяє визначати ЛА з високою точністю (до 100%). Результати діагностики досить інформативні: виявляють всі типи ЛА та токсичні реакції. Завдяки тому, що для діагностики ЛА негайного типу визначення ІдЕ ЗДІЙСНЮЮТЬ В 2 стадії, економляться час діагностики, кошти та діагностичні матеріали. Після визначення на першій стадії діагностики рівня ІдЕ загального другу стадію діагностики шляхом визначення рівня ІдЕ специфічного (найбільш затратна процедура) та розрахунок коефіцієнта дисоціації здійснюють лише у випадку відхилення значень рівня ІдЕ загального від норми. Цей показник визначають за простою і дешевою методикою без необхідності замовляння та придбання дорогих закордонних діагности кумів: так, визначення рівня ІдЕ специфічного для одного лікарського препарату з використанням комерційної тест-системи бельгійської фірми "Біолайн" коштує 20$ US, а за рішенням, що заявляється - 2~ 3,5$ US. Для клінічної перевірки ефективності способу діагностики, що заявляється, були відібрані 2 групи по ЗО хворих в кожній з ЛА або підозрою на неї. Всім піддослідним пацієнтам 'їхніми лікарями були призначені препарати для лікування різних хвороб Треба було визначити in vitro, який препарат з ряду призначених буде для даного пацієнта безпечним, а саме не викличе негайної ЛА, через деякий час піспя введення препарату не спрацює аперпйна реакція уповіпьненого типу чи не буде потерпати хворий від токсичної дії препарату. Пацієнтам 1 групи (основної") діагностику провели за способом, що заявляється, 2 групи (порівняння) за способом-прототипом. В 1 групі були виявлені 17 випадків ЛА негайного типу на препарат, 14 уповільненого типу, 7 токсичних реакцій В групі порівняння (2) у 12 пацієнтів діагностували ЛА уповільненого типу і у 18 - відсутність ЛА. Після лікування в клініці правильність поставленого діагнозу і підбору ліків підтвердилась у всіх пацієнтів (100%) в 1 групі і у 19 пацієнтів з ЗО (63,3%) в 2 групі (табл.). Таблиця 1 Порівняльна ефективність Способу диференційноі діагностики алергійної та токсичної реакцій на розчинні лікарські засоби in vitro (корисна модель), що заявляється, та відомого способу Точність діагнозу доведено, у чол.(%) Кіль№ Спосіб діа- кість ЛА употоксичп/п гностики пацієн- вільнен ЛА негайна реатів, чол. ого ного типу кція типу корисна 1 30(1гр.) 14(100) 14(100) 14(100) модель 2 прототип ЗО (2гр)12 (63,3) Спосіб диференційної діагностики алергійної та токсичної реакцій на розчинні лікарські засоби in vitro, що заявляється, реалізують наступним чином. Діагностиці підлягають особи з проявами алергії', що мають алергію в анамнезі або високий ризик її розвитку (алергія у близьких родичів), високий ризик розвитку токсичних реакцій (мають хвороби печінки, нирок, застосовують токсичні препарати, високі дози, т ін), у випадку необхідності прийому хіміотерапевтичних препаратів. У обстежуваного шприцом з вени беруть пробу крові 4500 8 "Біфідумбактерин", "Лактобакте з розрахунку 1,5мл на 1 тестований препарат для проведення РГМЛ з метою визначення ЛА уповільненого типу та діагностування токсичної реакції на препарат за гемолізом еритроцитів. Відібрану кров та дозу лікарського препарату використовують в постановці РГМЛ за відомою методикою (Трунова О.А. Индивидуальный подбор иммуномодулирующих и витаминных препаратов у часто болеющих ОРВИ горнорабочих / Лікарська справа. -1996. -№10-12. -С.150). Після проведення РГМЛ під мікроскопом перевіряють наявність гемолізу еритроцитів. За результатами РГМЛ розраховують за відомою методикою діагностичний Індекс, значення якого в нормі повинно бути вищим за 0,36. При значенні індексу нижче 0,86 діагностують ЛА уповільненого типу При встановленні гемолізу еритроцитів діагностують токсичну реакцію на введення препарату в організм пацієнта. "Арбідол-ленс", рин", "Ериспал". У обстежуваного шприцом з вени взяли пробу крові 7,3мл (бмл з розрахунку по 1,5мл на 1 тестований препарат для проведення РГМЛ та 1,3мл з розрахунку по 0,2мл на 1 тестований препарат плюс 0,5мл для визначення ІдЕ). Відібрані бмл крові та дозу лікарського препарату використали для постановки РГМЛ з метою визначення ЛА уповільненого типу. Після проведення РГМЛ під мікроскопом перевірили наявність гемолізу еритроцитів для діагностування токсичної реакції на препарат. За результатами РГМЛ розрахували діагностичний індекс Результати аналізу занесені в таблицю 2. Паралельно проводять тест на визначення рівня ІдЕ загального за відомим імуноферментним методом, користуючись діагностичною тестсистемою ЗАО "АлкорБио" (Санкт-Петербург, РФ) та прикладеною інструкцією розробника. Коли рівень ІдЕ загального не перевищує значення фізіологічної норми (Мельник А.А. Референтные значения лабораторных показателей у детей и взрослых / Справочник врача-лаборанта. - К.: Книга плюс, 2000. -118с), діагностують неможливість розвитку ЛА негайного типу, і на цьому тестування щодо ЛА закінчують або визначають рівень ІдЕ специфічного для підтвердження ЛА уповільненого типу. Коли рівень ІдЕ загального перевищує значення фізіологічної норми, діагностують можливість розвитку ЛА негайного типу Далі проводять діагностику негайного типу алергії для кожного окремого тестованого препарату за відомим Імуноферментним методом визначення алергенспецифічних ІдЕ (Тарасова Л.А., Ожиганова В.Н., Дуева Л.А., Суворова К.И. Классификация профессиональной бронхиальной астмы / Методические рекомендации. М.: НИИ медицины труда РАМН, 2001, -30с.) з застосуванням в якості алергена водного розчину тестованого лікарського засобу. Проба крові для цього аналізу береться з розрахунку 0,2мл на 1 тестований препарат плюс 0,5мл. За результатами аналізу розраховують індекс дисоціації (розрахунок див. там же). В нормі індекс дисоціації відповідає значенням від 0,9 до 1,1. Коли за результатами аналізів та підрахунків значення індексу дисоціації нижче за 0,9, діагностують розвиток ЛА негайного типу на тестований препарат, а коли значення вище за 1,1 - уповільненого типу. Користуючись одержаними результатами диференціиної діагностики алергіиної та токсичної реакцій на розчинні лікарські засоби in vitro, лікарі можуть підібрати, найбільш безпечний для хворого препарат, а також призначити індивідуальне лікування ЛА в обстеженого хворого. Результати діагностики уповільненого типу ЛА та токсичної реакції на препарати за РГМЛ хворого Богдана Л. Конкретні приклади реалізації способу, що заявляється. Приклад 1 ворий Богдан Л., 10 років, діагноз: респіраторний апергоз, поступив на обстеження з метою диференціиної діагностики алергіиної та токсичної реакцій на розчинні лікарські засоби in vitro та вибору безпечного препарату з ряду призначених: Таблиця 2 № Препарат-алерген п/п 1 Арбідол-ленс 2 Біфідумбактерин 3 [Лактобактерин 4 Ериспал РГМЛ, діагнос- Гемоліз тичний індекс лейкоцитів (N>0,86) 1,08-1,03 1,00-0,91 0,96-0,75+ гемоліз 0,91-0,73+ Примітка: знаком + позначені відхилення значень від норми Як видно з таблиці 2, діагностовано слабо виражену сенсибілізацію - ЛА уповільненого типу щодо препаратів "Лактобактерин" та "Ериспал" (одержано значення індексів нижчі за 0,86) При контактуванні з препаратом "Ериспал" відбувся гемоліз еритроцитів крові хворого. Діагностували токсичну реакцію на введення цього препарату в організм пацієнта Богдана Л. Паралельно виконали тест на визначення рівня ІдЕ загального Результати аналізу занесені в таблицю 3. Таблиця З Результати визначення рівня ІдЕ загального в крові хворого Богдана Л. Досліджуваний Результат показник аналізу ІдЕ загальний 100 Фізіологічна норма для ОДИНИЦЯ 10~рІЧНОҐО виміру пацієнта