Поживне середовище для первинної диференційної діагностики збудника дифтерії corynebakterium diphtheriae

Поживне середовище для первинної диференційної діагностики збудника дифтерії Согупеbactenum diphthenae, яке містить на 1л середовища драглисте середовище ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ Nostoc muscorum - 250 мл, водний екстракт з біомаси Nostoc muscorum - 250 мл, поліетиленоксид 1500 - 5 г, альгінат натрію 15г Винахід стосується медицини й мікробіологи, а саме - швидкої дифереренційної діагностики дифтерії У СВІТІ спостерігається швидке зростання захворюваності на дифтерію, причому Україна займає лідерство з цього показника Зменшити захворюваність можливо двома шляхами зменшення циркуляції збудника у чутливій до нього популяції, або за рахунок збільшення частки стійкого контингенту Метою винаходу було запропонувати середовище, яке б сприяло більш повному виявленню джерела інфекції (носив дифтерійної палички та хворих на дифтерію), що дасть можливість більш ефективно попереджати зараження контингенту за рахунок своєчасної санації бактерюноспв та лікування хворих Виділення чистої культури збудника - самий доказовий метод діагностики дифтерії та и носив Для ізоляції Corynebactenum diphthenae роблять мазок з глотки, який надалі засівають на щільне поживне середовище, здебільшого з селективними властивостями стосовно цього збудника, після інкубації ідентифікують "підозрілі" колонії Ефективність методу визначається специфічністю та чутливістю поживного середовища Здебільшого середовища, які застосовуються мають низку недоліків низька специфічність (середовище Ру), недостатня чутливість (середовище Тинсдаля) Тому значна частина джерел інфекції залишається невиявленою й циркуляція збудника залишається серед населення (Кравченко Н А К вопросу о состоянии бактериологической диагностики дифтерии в нашей стране//Лаб дело - 1967, №11, - С 252, Крылова М Д О виде С diphtheпае//Ж микробиол - 1977 - №11 - С 97-106, Кудратуллаев Н К , Сапожникова К П , Устинова 3 П Наш опыт лабораторной диагностики дифтерии/Здрав Туркменистана -1968 -№l -С 4042 , Кудратуллаев Н К К бактериологической диагностике дифтерии в Туркменской ССР//Здрав Туркменистана -1971 - № 6 - С 3839 .Машилова Г М , Жданов Л Г , Баснакьян И А и др Роль кислорода в управлении процессом культивирования С diphthenae//>K микробиол - 1 9 7 7 № 3 - С 47-52 , Михайличенко Д Т Бактериологическое изучение дифтерии и носителя возбудителя в условиях Карагандинской области // Тр Казахск НИИЭМ - 1 9 7 1 -Т 6 - 1 6 с, Сальникова Г П , Соловьева В Е Современные методы бактериологического исследования на дифтерию - М ЦИУВ, 1970 49 с, Сартакова А Н , Пестова Л С высеваемость возбудителя дифтерии на различных питательных средах, применяемых в лаборатории горсанэпидстанции, за 1968-1969 гг -Тезисы докладов юбилейной Курганской научнопрактической конференции, посвященной 50летию образования СССР -Курган, 1973 - 70-72 , Станкевич Л А , Кондратенко А Ф Опыт работы по лабораторной диагностике дифтерии//Лаб дело 1969 - №7-С 437-438, McCraken A W , Маипеу С U Identification of Corynebactenum diphthe О го 00 ю 57839 пае by immunofluorescence during a diphtheria epidemic/^ Chn Pathol -1971 - V 2 4 - P 641-644) Збудник дифтерії - Cormebactenum diphthenae - паличка розміром 5x1 мкм, яка має булавовидні потовщення з КІНЦІВ У цих потовщеннях часто визначаються зернята волютину при забарвленні за Нейссером В залежності від штаму та умов культивування, можливий значний поліморфізм - поява нитковидних, плкоподібних та кокоподібних форм Дифтерійна паличка нерухома, не утворює капсулу, Грам-позитивна На щільних поживних середовищах утворює колонії до 5-6мм у діаметрі, які мають характерні особливості або R-форм (найбільш типові для варіанту gravis), або S-форм (найбільш типові для варіанту mitis) Мікроорганізм відноситься до факультативних аеробів, росте у діапазоні від 15 до 40°С (оптимум- 36-37°С) та 7,28,6 одиниць рН (оптимум 7,4-8,0) Може рости на звичайних поживних середовищах, але найбільш швидкий ріст відмічається на середовищах у присутності крові (людини, кроля, коняки, великої рогатої худоби, барана) або ж нормальної сироватки цих видів Розвиток бактерії стимулюється бетааланіном, пімелінової та нікотинової кислотами, мікрокількостями йонів Ca,Mg,Fe,Zn,Mn,Cu Для дифтерійної палички притаманна висока СТІЙКІСТЬ до теллуритів калію, натрію, а також до сульфамідів (Барвенко А И Сравнительная оценка питате льных сред для бактериологической диагностики дифтерии//Здрав Киргизии - 1 9 7 2 - № 2 - С 57-59 .Крюков Ю М , Добрых Л А , Крюков В Ю и др Об эффективности теллуритовых сред при исследовании на дифтерийное бактерионосительство -Вопросы совершенствования санитарного надзора и профилактики инфекционных заболеваний на железнодорожном транспорте - М , 1977 - С 158-160, Методические указания по бактериологической диагностике дифтерии - Ташкент Медицина,1974 - 16 с, Родина Ц С , Хамхидько Н Л Сравнительная оценка лабораторных методов выявления дифтерийных бактерий Детские инфекции - Киев, 1975 - вып 5 - С 129131) Ці морфологічні, біохімічні особливості мікроорганізмів послужили основою для створення нового поживного середовища Метою роботи було створення певного співвідношення селективних та ростових факторів, які б забезпечили сприятливі умови для ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ Cormebactenum diphthenae та пригнічували розвиток сторонньої мікрофлори Для вибору різних варіантів у процесі пошуку використані штами різних мікроорганізмів, які були одержані у Київсьму НДІ епідеміологи та інфекційних хвороб їм Л І Громашевського Штами мікроорганізмів №№ п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 №№ штамів 1281 1282 1283 1284 1285 1126 154 155 PW-8 0-143 0-101 18 80 209Р Wood 46 Вид та варіанти Corynd|acterium diphthenae, var Gravis toxica Corynebactenum diphthenae, var Gravis toxica Corynebactenum diphthenae, var Gravis toxica Corynebactenum diphthenae, var Gravis toxica Corynebactenum diphthenae, var Gravis toxica Corynebactenmn diphthenae, var Gravis Corynebactenmn diphthenae, var Gravis toxica Corynebactenum diphthenae, var Gravis toxica Corynebactenmn diphthenae, var Gravis toxica Eschenchia coh Eschenchia coh Proteus mirabihs Proteus mirabihs Staphuococcus aureus var Pyogenes Staphilococcus albus Corynebactenum pseudodiphthenae (Hofmantu) Corynebactenum xerosis Connebactenum acnes Перші 8 штамів -стандартний набір культур дифтерії, які одержано з ВТСС, 9-й штам - продуцент дифтерійного екзотоксину, який використовується у багатьох країнах для створення протидифтерійної вакцини Ці штами мікроорганізмів використовувались для визначення чутливості запропонованого середовища до збудника дифтерії Останні штами являють собою сапрофіні та патогенні мікроорганізми, які можуть стати на перепоні виявлення дифтерійної палички при засівах на диференційно-діагностичні середовища ВІДОМІ ПОЖИВНІ середовища з метою висіву дифтерійної палички - середовище Ру з низькою специфічністю, -середовище Бучіна Здебільшого застосовується сухе середовище виробництва НВО "Поживні середовища" наступного складу (г/л) панкреатичний рибний пдролізат-18,12, натрій хлористий26,49, Д-глюкоза-12,05, хинозол-0,015, водний блакитний-1,33, натрій вуглекислий-0,001, агарагар-12,0 До теплого розплавленого середовища ex tempore додають 5% дефібринованої цільної крові людини або тварин (Брудный Р А , Иванова М Ф , Волошина З Н Улучшение качества сухой хинозольной среды П И Бучина путем добавления в нее сарцинового стимулятора роста Физиология 57839 и генетика микроорганизмов -Ростов-наДону,1969 - С 116-118, ГрошевА.Г, Ненашева Н Д Сухие посевные культуры микробов дифтерии - Токсины и анатоксины - М Д977 - С 2326 , Дмитриева Л В , Абрамова Н Т , Ивлева Р И Сравнительные данные высеваемости дифтерийных палочек на среда Бучина и Тинсдаля //Здрав Казахстана - №11 - С 77-78 , Ивасько Ю А , Соколинская М С , Гренман Л Г и др Об использовании сухой среды Бучина с добавлением сыворотки при исследовании на дифтерию // Лаб дело -1969 - № 7 - С 433-434 , Кирсанов Г Л Новая питательная среда для выделения дифтерийных микробов//Казанск мед ж - 1970 - № 1 С 86 , Янченко М К , Тащилкина 3 Г , Вартанян Т П , Бучарская Т С Опыт использования гемолизированной крови в составе сухой хинозольной среды Бучина //Лаб дело - 1974 - № 2 С 103-105), - середовище Тінсдаля у модифікації Садиковоі Склад м'ясо-пептонний агар з додаванням 20% нормальної сироватки людини, 12% одновідсоткового розчину цистину, 12% 0,1Н розчину соляної кислоти, 1,8% двохвідсоткового розчину теллуриту калію й такої ж КІЛЬКОСТІ 2,5% розчину гіпосульфіту натрію (Барвенко А И Сравнительная оценка питательных сред для бактериологической диагностики дифтерии//Здрав Киргизии - 1 9 7 2 № 2 -С 57-59 , Сазонова С В , Давыдова М И , Корнилова Э М Сравнение различных питательных сред, применяемых для выделения дифтерийных бактерий - Мат 2-го Челябинского областного съезда гигиенистов, санитарных врачей, эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов - Челябинск,1970-19 с, СвириденкоЕТ К вопросу о модификации среды Тинсдаля // Технология производства сухих диагностических питательных сред - Махачкала - 1974 - в 6-С 7381 , Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования (под ред МО Биргера - М Медицина,1967-464 с ) Середовище готується безпоредньо перед використанням, - кров'яний теллуритовий агар Склад м'ясопептонний агар з додаванням 10% дефібринованої крові та 0,4% телуриту калію (Барвенко А И Сравнительная оценка питательных сред для бактериологической диагностики дифтерии //Здрав Киргизии - 1972 - № 2 - С 57-59 , Мусаелян Ш Т , Шахмарданова Л Б Сравнительные данные по применению ряда питательных сред в лабораторной диагностике дифтерии - Ма тер научно-практической конф по вопросам эпидемиологии, микробиологии, вирусологии, гигиены и санитарии - Баку,1969 - С 160-161) Середовище готується безпосередньо перед вживанням, - сироваточний м'ясо-пептонний агар Склад м'ясо-пептонний агар з додаванням 10% нормальної сироватки крові (Барвенко А И Сравнительная оценка питательных сред для бактериологической диагностики дифтерии //Здрав Киргизии -1972 № 2 -С 57-59) Середовище виготовляється безпосередньо перед використанням У якості основи можливо використовувати сухий поживний агар виробництва НВО "Поживні середовища" (Махачкала) Недоліками вказаних поживних середовищ є багатокомпонентність та складність їх складу й техніки виготовлення, мала селективність та чутливість стосовно корінебактерій дифтерії, велика вартість сироватки, крові та компонентів зарубіжного виготовлення Задачею винаходу було створення поживного середовища абревіатура умовної назви -NMAN (Nostoc muscorum+ Algmat natrium) з високою селективністю та чутливістю стосовно корінебактерій дифтерії, зниження вартості й використання вітчизняних компонентів Поставлена задача вирішена в першу чергу складовими частинами поживного середовища, до складу якого входять (на 1 л середовища) - драглисте середовище ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ Nostoc muscorum 250мл, - водний екстракт з біомаси Nostoc muscorum 250мл, - поліетиленоксид 1500 - 5г, -альгінат натрію 15г Середовище ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ та водний екстракт Nostoc muscorum мають незамінні амінокислоти та до 60% білку, які стимулюють розвиток корінебактерій дифтерії, присутність мідного похідного хлорофілу (альгінату натрію) стоїть на перешкоді розвитку супроводжуючої мікрофлори, колонії якої заважають диференціювати колонії корінебартерш дифтерії, введення поліетиленоксиду 1500 зв'язано з необхідністю створення твердого пиживного середовища Суть винаходу пояснюється прикладами виконання Приклад 1 Чутливість середовища NMAN Використані наступні штами мікроорганізмів, які були одержані з музею живих культур Київского НДІ епідеміологи та інфекційних хвороб їм Л В Громашевського МЗ України Таблиця 1 Використані штами мікроорганізмів 1 2 3 4 5 6 7 8 №№ п/п та вид бактерій Cormebaclenum diphtherme Cormebactenum diphthenae Corinebactenmn diphthenae Cormebactenum diphthenae Corinebactenmn diphthenae Cormebactenum diphthenae Connetectenum diphthenae Cormebactenum hofmam Штами № 43 1086 1106 1126 1281 1282 1283 Варіанти gravis toxicagravis toxica+ gravis toxica+ gravis toxica+ 7 9 Streptococcus haemolyticus 10 Staphilococcus aureus 11 Proteus mirabihs 12 Proteus vulgans 13 Eschenchia coh 14 Eschenchia coh 15 Eschenchia coh 16 Cormebacterium diphtheriae 8 57839 209P 403 118 0143 0111 M-17 PW-8 Для вивчення питання чутливості мікроорганізмів провадили мірний засів добових культур Cormebacterium diphtheriae (штами №№43,1086,1106,1126, 1281,1283) Для цього 0,1мл суспензії добової культури бактерій, які вирощені на 10% сироваточному агарі (1000 КОЕ/мл за стандартом мутності), наносили піпеткою на gravis toxica+ поверхню поживного середовища (кров'яний теллуритовий агар, середовища Бучина, ТінсдаляСадикової, NMAN) й рівномірно розподіляли шкляним шпаделем, інкубація при 37°С Через 21,45,120 годин візуально та при збільшенні х5 вивчали морфологію колоній Ці ВІДОМОСТІ надані у табл 2 Таблиця 2 Чутливість Cormebacterium diphtherias до різних поживних середовищ Номер штаму та строки обліку реСередовищеММАМ зультатів № 1 2 8 3 , через 21 МІЛКІ КОЛОНІЇ годину № 1 2 8 3 , через 45 6 6 КОЛОНІЙ годин № 1283, через 120 Проростання годин № 1 1 2 6 , через 20 МІЛКІ КОЛОНІЇ годин № 1 1 2 6 , через 45 12 колоній годин № 1126, через 120 14 колоній годин № 43, через 20 гоРосту немає дин № 43, через 45 го58 колоній дин №43, через 120 Проростання годин № 1 0 8 6 , через 20 Росту немає годин № 1 0 8 6 , через 45 8 колоній годин № 1086, через 120 24 колонії годин № 1 1 0 6 , через 20 4 колонії годин № 1 1 0 6 , через 45 9 колоній годин № 1106, через 120 12 колоній годин № 1 2 8 2 , через 20 МІЛКІ КОЛОНІЇ годин № 1 2 8 2 , через 45 3 6 КОЛОНІЙ годин № 1282, через 120 41 колонія годин № 1 2 8 1 , через 20 МІЛКІ КОЛОНІЇ годин № 1 2 8 1 , через 45 251 колонія годин Середовище Бучина Середовище Тинсдаля-Садикової Кров'яний теллурітовий агар Росту немає МІЛКІ КОЛОНІЇ Росту немає Росту немає 6 КОЛОНІЙ 3 колонії Росту немає 7 колоній Проростання Росту немає Росту немає Росту немає Росту немає 8 колоній 2 колонії Росту немає 8 колоній Проростання Росту немає Росту немає Росту немає Росту немає 15 колоній 6 КОЛОНІЙ Проростання 1 6 КОЛОНІЙ Проростання Росту немає Росту немає Росту немає Проростання Росту немає Росту немає Проростання Росту немає Росту немає Росту немає МІЛКІ КОЛОНІЇ Росту немає Росту немає Проростання Росту немає Росту немає Проростання Росту немає Росту немає МІЛКІ КОЛОНІЇ МІЛКІ КОЛОНІЇ 1 КОЛОНІЯ 1 6 КОЛОНІЙ 7 колоній Проростання 1 6 КОЛОНІЙ Проростання Росту немає Росту немає Росту немає Росту немає 11 КОЛОНІЙ 5 колоній У №1281, через 120 годин 10 57839 54 колони Проростання Наведені дані свідчать, що при обліку результатів через 20 годин ні на одному з випробуваних середовищ не спостерігалось росту, який має типові ознаки для Corynebacterium diphtheriae Вочевидь це пояснюється антисептичними засобами, які входять до складу середовищ,при обліку результатів через 45 годин ріст, який типовий для Corynebacterium diphtheriae відмічено у середовищі NMAN у всіх випадках, на середовищі Бучина в 1 випадку, на середовищі Тинсдаля-Садикової - у 5 випадках, на кров'яному теллуритовому агарі - у 5 випадках, при одпку результатів через 120 годин на середовищі NMAN здебільшого розвиваються колонії з храктерними ознаками збудника Corynebacterium diphtheriae, на останніх середовищах розвивається стороння мікрофлора, яка утруднює виявлення колоній палички Corynebacterium diphtheriae Але у всіх випадках КІЛЬКІСТЬ КОЛОНІЙ Cory nebacterium diphtheriae біло найвищим порівняно з другими середовищами, друге місце за цим показ 12 колоній Проростання ником займає середовище Тінсдаля-Садикової, третє - теллуритовий агар, останнє - середовище Бучина Приклад 2 Диференціюючі властивості середовища NMAN Для вивчення диференціюючих властивостей середовища NMAN робили посіви від 1 до 7 штамів добової культури Corynebaetenum diphtheriae та супутніх мікроорганізмів (С hofmani, S aureus, Str Haemolyticus, Prmirabihs, Pr Vulgans, E coh) на зкошені та пластинчасті середовища (NMAN, Тінсдаля-Садикової, Бучина, кров'яний теллуритовий агар) Використані методи посіву за І І Щукевичем - штрихом та уколом Посіви вирощували при 37°С протягом 5 діб Через 20,45,120 годин проводили облік, звертали увагу на ознаки, які дозволяють відрізнити колонії Corynebacterium diphtheriae від колоній супутньої мікрофлори (розмір, форма, структура й забарвлення, наявність повзучого росту) Ці ВІДОМОСТІ подані у табл З Таблиця З Морфологія росту колоній Corynebacterium diphtheriae натазних поживних середовищах Вид бактерій С diphtheriae С hotmam S aureus Str Haemolyticus Pr Mirbuis Pr Vulgans E coh Середовище Бучи- Середовище Тінс- Кров'яний теллурина даля-Садикової товий агар Колони до 4-х мм, Колонії до 4-х мм, Колонії до 3-х мм, Колоніх до 3-х мм, округлі, з чорним округлі або фесчорні, округлі, опу- чорні, округлі, опукцентром, сірою пе- тончасті, сіруваті, клі, блискучі лі риферією центр піднятий Колонії до 2-х мм, Колонії до 2-х мм, Колонії до 3-х мм, Колонії до 2-х мм, округлі або фесточорні опуклі, з рівчорні, округлі з рів- чорні, округлі з рівнчаті, білуватого ним краєм ним краєм ним краєм кольору Колонії до 2-х ммБ Колонії до 5мм, ок- Колонії до 3-х мм, Колони' до 4-х мм, чорні з рівним кра- руглі, жовтуваті з округлі, опуклі, чо- округлі, опуклі, чорні єм рівним краєм рні або сірі Скудний ріст без Скудний ріст без Росту немає Росту немає типових ознак типових ознак Повзучий ріст від- Повзучий ріст КоПовзучий ріст Колір Повзучий ріст Косутній МІЛКІ КОЛОНІЇ лір сіруватожовтуватолір сіруватий з темним центром блакитний сіруватий Повзучий ріст відПовзучий ріст КоПовзучий ріст Колір сутній Окремі МІЛКІ Повзучий ріст Колір сіруватожовтуватоколонії Зтемним лір сіруватий блакитний сіруватий центром Колонії до 2-х мм, Колони' до 5мм, Коловії до 5мм, сіРосту немає округлі, сіруваті, округлі, сіруваті, руваті, округлі, опуопуклі, блискучі блискучі клі Середовище NMAN З наведених даних витікає, що колонії Corynebacterium diphtheriae , які вирощені на середовищі NMAN можливо відрізнити від других колоній за наступними ознаками округла форма, діаметр до 4-х мм, чорний центр, сірувата периферія На середовищах Бучина, Тінсдаля-Садикової та кров'яному теллуритовому агарі диференціація колоній Corynebacterium diphtheriae утруднена, особливо з колоніями супутніх мікроорганізмів (С hofmam, S aureus) Приклад 3 Показники стабільності основних властивостей збудника дифтерії Corynebacterium diphtheriae на середовищі NMAN Для визначення долі атипових колоній робили посіви штрихом добових культур 7 штамів Corynebacterium diphtheriae на середовище NMAN у чашках Петрі Посіви інкубували при 37°С протягом 2-х діб Візуально та при збільшенні х5 визначали долю атипових колоній Порівняння провадили за 12 11 57839 такими показниками розмір, форма, колір, прозолювали за Нейссером і досліджували при збільрість колоній шенні 15x90 за показниками характер забарвлення бактеріальних клітин, наявність зерен Для виявлення атипових форм Corynebacteriволютину, форма та розміри окремих бактерій, um diphtheriae готували мікропрепарати з 45присутність кокоподібних, нитковидних та інволюгодинних культур, які вирощені на середовищах зованихформ Ці ВІДОМОСТІ наведені у табл 4 NMAN та Тінсдаля-Садикової Препарати забарвТаблиця 4 Морфологія збудника Corynebacterium diphtheriae при ПОСІВІ на різних поживних середовищах №№ штамів С diphtheriae 1086 NMAN 1283 NMAN 1106 ТінсдаляСадикової 1106 NMAN 1126 ТінсдаляСадикової 43 NMAN 43 1281 1282 Середовища ТінсдаляСадикової ТінсдаляСадикової NMAN Колонії Невеликі чорні Вкорочені палички жовтого кольору Чорні з сірою периПалички та кокоподібні форми жовтого кольоферією, опуклий ру Добре диференціюється волютин центр, Змм у діаметрі Типові палички жовтого кольору Включення Чорна округла,опукла волютину Невелика чорна ко- Вкорочені палички жовтого кольору, включення лонія волютину Чорна, 2,5мм, неве- Паличкоподібні, шароподібні нитковидні форми ликий ореол жовтого кольору з включенням юлютину Палички жовтого кольору з включенням волюЧорна,діаметр Змм тину Паличкоподібні, шароподібні, ниткоподібні жовЧорна, округла того кольору з включеннями волютину Паличкоподібні форми жовтого кольору з Чорна, округла, Змм включеннями волютину Чорна, округла з сіВкорочені палички жовтого кольору з включенрою периферією, дінями волютину аметр Змм Таким чином, атипові колонії Corynebacterium diphtheriae не знайдено Морфологічні зміни, які спостерігались у мікропрепаратах вкладаються у межі нормальної МІНЛИВОСТІ збудника дифтерії Комп'ютерна верстка О Лисенко Мікропрепарат Для корінебактерій, які вирощені на середовищі NMAN, відмічена тенденція до зменшення подовжнього розміру, внаслідок чого форма паличок наближається до діжкоподібної Підписано до друку 05 08 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа,8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна