Спосіб ранньої діагностики активації апоптозу гепатоцитів у хворих на хронічні гепатити

Спосіб ранньої діагностики активації апоптозу гепатоцитів у хворих на хронічні гепатити, який включає гістологічне дослідження тканини печінки з виявленням апоптозних тілець Каунсільмена, який відрізняється тим, що додатково проводять цитогенетичне дослідження гепатоцитів з визначенням індексів хроматизаци (співвідношення ядер з перевагою еухроматину до ядер з гетерохроматином) ядерцевого статевого хроматину та патологічно змінених ядер Винахід відноситься до медицини, зокрема до розділу гепатологм, а саме до способу ранньої діагностики активації апоптозу гепатоцитів у хворих на хронічні гепатити Відомо, ЩО проблема хронічних запальних захворювань печінки на теперішній час є однією з найбільш важливих в сучасній гастроентерологи, має загальномедичне і соціальне значення [2, 3, 4, 6, 7, 16] В цілому по Україні за 5 років захворюваність на хронічні гепатити зросла на 76,6 %, на ЦП - на 75,6 %, поширеність хронічних гепатитів за цей період збільшилась в 2,2 рази, ЦП - на 59,6 % [10] В останні роки доведено, що апоптоз гепатоцитів відіграє важливу роль в патогенезі хронічних гепатитів, його активація сприяє прогресуванню захворювання [2, 3, 19] Це з однієї сторони зумовлено тим, що при хронічних гепатитах загибель шляхом апоптозу великої КІЛЬКОСТІ пошкоджених гепатоцитів не відповідає сповільненій регенерації печінки, а з другої сторони - активація мезехнімального запалення приводить до заміщення зруйнованих клітин сполучною тканиною, що веде до розвитку цирозу печінки [9, 19] Посилення апоптозу гепатоцитів при хронічних гепатитах різної етіології в активній фазі було виявлено рядом ДОСЛІДНИКІВ [21, 23, 24] перебувають у вільному стані внаслідок їх фагоцитозу макрофагами, або ж сусідніми клітинами Поглинений матеріал переварюється лізосомальними ферментами [5, 8, 21, 22, 25], що затруднює ранню діагностику активації апоптозу Відомо, ЩО на ранніх стадіях апоптозу каспази викликають деструкцію ядерних білків ламінів, що супроводжується конденсацією хроматину і сприяє прикріпленню його до внутрішньої поверхні ядерної мембрани [11,19, 22, 26] Відомо, ЩО ранньою морфологічною ознакою апоптозу є колапс ядра Хроматин стає суперконденсованим у формі ПІВМІСЯЦЯ ПО периферії ядра В цей момент починається фрагментація ДНК активованими ендонуклеазами на нуклеосомальні фрагменти Клітина стискується, конденсуючи цитоплазму, округляється, втрачаючи мікроворсинки, рецептори і структури, що забезпечують МІЖКЛІТИННІ контакти Потім В мембрані утворюються випинання, відбувається сегментація клітини у вигляді апоптозних тілець Каунсільмена При некрозі гепатоцитів, навпаки, характерне набухання органел, пікноз хроматину КЛІТИННІ органели концентруються навколо ядра і, нарешті, відбувається лізис цитоплазматичної оболонки та руйнування клітини Як правило, в ДІЛЯНЦІ некрозу виникає запалення [15, 17, 22, 25] Відомо, ЩО діагностувати активацію апоптозу гепатоцитів можна за допомогою ГІСТОЛОГІЧНОГО дослідження тканини печінки при наявності апоптозних тілець Каунсільмена [15] Недоліком даного методу є те, що тільця Каунсільмена появляються вже після сегментації клітини і короткотривале Відомо, ЩО стан ядра клітини, ступінь конденсації хроматину і його розміщення біля ядерної мембрани, що є характерним для ранніх стадій апоптозу, можна виявити за допомогою цитогенетичних досліджень [13,14] Суть винаходу з метою ранньої діагностики ю о о о> ю 59005 апоптозу гепатоцитів пропонується хворим на хронічні гепатити різної етіології проводити поряд з ГІСТОЛОГІЧНИМ дослідженням тканини печінки цитогенетичне дослідження гепатоцитів з визначенням індексів хроматизацм (співвідношення ядер з перевагою еухроматину до ядер з гетерохроматином), ядерцевого, статевого хроматину та патологічно змінених ядер В основу винаходу поставлено задачу діагностики активації апоптозу гепатоцитів на ранній стадії у хворих на хронічні гепатити з метою вибору раціональної терапії і попередження прогресування захворювання Об'єкт і методи дослідження Під спостереженням було 83 хворих, у 43 (51,8 %) з них захворювання було викликане HBV- і HCV-шфекцією 21 (25,3%) хворий на хронічний гепатит В (ХГВ), 12(14,5%) - на хронічний гепатит С (ХГС), 10(12,0%) - на ЦП вірусної етіології Серед обстежених було 28 (33,7%) хворих на алкогольну хворобу печінки (АХП) 6(7,2%) - на стеатоз, 12 (14,5%) - на алкогольний гепатит АГ, 10 (12,0%) - на ЦП і 12 (14,5%) - на автоімунні захворювання печінки Проведені дослідження у 10 (48,6%) хворих на ХГВ виявили фазу інтеграції, в 11 (51,4%) фазу реплікації Серед обстежених було 52 (62,7%) ЧОЛОВІКІВ І 31 (37,3%) жінка Вік обстежених хворих коливався від 20 до 68 років, середній вік - (44,6±7,9) роки Тривалість захворювання складала в середньому (5,3±2,9) років Дослідження проводили за розробленою програмою з ретельною оцінкою загально КЛІНІЧНИХ, лабораторних показників, результатів інструментальних методів обстеження В діагностиці хронічних захворювань печінки використовували класифікацію Міжнародної робочої групи і Всесвітнього конгресу гастроентерологів (Лос-Анжелес, 1994) та МКБ-10 Діагноз встановлювали на основі КЛІНІЧНИХ, ультразвукових (УЗД), біохімічних, імунологічних та ГІСТОЛОГІЧНИХ досліджень [2, 4, 5, 7] Вираженість синдрому цитолізу печінкових клітин оцінювали за активністю трансаміназ АлАТ, АсАТ з визначенням коефіцієнта Де Рітіса (АсАТ/АлАТ), вмістом білірубіну в крові, синтетичну функцію печінки - за вмістом білка, зокрема альбуміну, протромбіну, фібриногену, активністю холінестерази Про вираженість мезенхімальнозапального синдрому судили за тимоловою пробою, альбуміно-глобуліновим (А/Г) показником, вмістом у-глобулінів, імуноглобулінів (Ід) А, М, G в крові [7] Маркери вірусів HBsAg, HBeAg, антиНВеАд, антиНВсогАд ІдМ, антиНСУ і антиЬЮУ визначали в сироватці крові за допомогою комерційних наборів Diagnosticum Pasteur (Франція) на апараті фірми Sanofi імуноферментним методом (ELISA), HBV ДНК та HCV-PHK - методом полімеразної ланцюгової реакції згідно алгоритму діагностики вірусних гепатитів [1] Для ГІСТОЛОГІЧНОГО і цитогенетичного дослідження були відібрані хворі з характерними КЛІНІко-бюхімічними проявами вказаних захворювань Контрольну групу склали 10 хворих, яким проводилась лапароскопія в плановому порядку з приводу жовчокам'яної хвороби при відсутності ГІСТОЛОГІЧНИХ змін в тканині печінки Для ГІСТОЛОГІЧНОГО дослідження тканину печінки отримували шляхом пункційної біопсії Фарбування проводили гематоксиліном і еозином, за Ван-Гізоном та за Маллорі Крім оглядового ГІСТОЛОГІЧНОГО дослідження тканини печінки визначали індекс гістологічної активності (ІГА) за R G Knodell і ступінь фіброзу за V J Desmet [12, 15, 18, 20] Функціональну активність геному клітин печінки встановлювали за показниками карюграми штерфазних ядер гепатоцитів Забарвлення ядер здійснювали за Фьольгеном в модифікації Л Є Ковальчук і співавт (1994) Комплексний аналіз чотирьох індексів карюграми (хроматизацм, ядерцевий, гетеропікнотичної Х-хромосоми, патологічно змінених ядер) проводили за методикою Л Є Ковальчук [13, 14] КІЛЬКІСНІ показники визначали в 100 штерфазних ядрах соматичних клітин Індекс хроматизацм вираховували за співвідношенням ядер з перевагою деконденсованого хроматину (еухроматину) до ядер, що містили великі ділянки гетерохроматину Ядерцевий або нуклеолярний індекс, який свідчить про загальний метаболізм клітини, визначали співвідношенням ядер, що мали ядерця, до всіх вивчених ядер Реєстрували клітини з гетеропікнотичною Х-хромосомою, тобто такі, що містили статевий хроматин Статистичну обробку отриманих результатів проводили на IBM PC Pentium-200 з використанням стандартного пакету програми "Statistica 5 1 for Wmdows"("Stat Soft",CUIA) Результати дослідження Проведений порівняльний аналіз цитогенетичних характеристик гепатоцитів у хворих на ХВГ дозволив виявити в них зміни всіх компонентів транскрипційно-трансляційного апарату (табл 1) Найбільш виражені зміни цитогенетичних показників гепатоцитів відзначалися у хворих на ХГС На відміну від ХГВ при ХГС виявлено зменшення індексу хроматизацм на 16,0% (р