Сполуки-антагоністи рнк для модуляції активності бета-катеніну

Реферат: Винахід належить до олігомерних сполук (олігомерів), мішенню яких у клітині є мРНК бетакатеніну і які викликають зменшення експресії бета-катеніну. Зменшення експресії бета-катеніну є корисним при гіперпроліферативних захворюваннях, включаючи рак. Винахід надає фармацевтичні композиції, що включають у себе олігомери, і методи інгібування експресії бетакатеніну із застосуванням зазначених олігомерів. UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується олігомерних сполук (олігомерів), мішенню яких у клітині є мРНК бета-катеніну і які викликають зменшення експресії бета-катеніну. Зменшення експресії бетакатеніну є корисним при ряді медичних порушень, таких як гіперпроліферативні захворювання, включаючи рак. Винахід надає терапевтичні композиції, які включають у себе олігомери, і методи модулювання експресії бета-катеніну із застосуванням зазначених олігомерів, включаючи методи лікування. Рівень техніки винаходу Бета-катенін (також відомий як кадгеринасоційований білок і β-катенін) є членом сімейства катенінів, цитозольних білків, і відіграє ключову роль у сигнальному шляху, індукованому білками Wnt, медіаторами декількох процесів. Бета-катенін піддається фосфорилуванню після стимуляції факторами росту, що приводить до зменшення клітинної адгезії. Як було показано, роль бета-катеніну в розвитку раку регулюється продуктом експресії гена APC (аденоматозний поліпоз товстої кишки). Пухлинний супресор, білок APC, зв'язується з бета-катеніном, у той же час показано, що бета-катенін взаємодіє з факторами транскрипції Tcf і Lef. За результатами роботи Morin et al. білок APC пригнічує транскрипційну активацію, опосередковану бета-катеніном і Tcf-4 при колоректальному раку. Зазначені результати показують, що регуляція бета-катеніну є ключовою для пухлиносупресивного ефекту APC і що дана регуляція може бути порушена мутаціями APC або бета-катеніну. Про виявлення мутацій бета-катеніну в різних ракових клітинних лініях повідомляється в декількох дослідженнях, і аномально високі кількості бета-катеніну були виявлені в клітинних лініях меланоми. Morin et al. показали, що мутації бета-катеніну, які пошкоджували ділянки фосфорилування, робили клітини нечутливими до APC-опосередкованої знижувальної регуляції бета-катеніну і даний порушений механізм був ключовим у колоректальному онкогенезі (Morin et al., Science, 1997, 275, 1787-1790). Патент США № 6066500, Bennett et al., описує антисмислові сполуки, композиції й методи модулювання експресії бета-катеніну. Враховуючи свідчення участі бетакатеніну в розвитку раку, зберігається потреба в агентах, здатних ефективно інгібувати функції бета-катеніну. Суть винаходу Винахід надає олігомер довжиною 10-50 нуклеїнових основ, що включає в себе безперервну послідовність нуклеїнових основ загальною довжиною 10-50 нуклеїнових основ, де зазначена безперервна послідовність нуклеїнових основ є щонайменше на 80% гомологічною відповідній ділянці нуклеїнової кислоти, яка кодує бета-катенін ссавців. Винахід надає олігомер довжиною 10-50 нуклеїнових основ, що включає в себе безперервну послідовність нуклеїнових основ загальною довжиною 10-50 нуклеїнових основ, де зазначена безперервна послідовність нуклеїнових основ є щонайменше на 80% гомологічною відповідній ділянці послідовності нуклеїнових кислот, вибраної із групи, що складається з SEQ ID NO: 173 і SEQ ID NO: 174-193. Винахід надає олігомери довжиною 10-50 нуклеїнових основ, які включають в себе безперервну послідовність нуклеїнових основ загальною довжиною 10-50 нуклеїнових основ, де зазначена безперервна послідовність нуклеїнових основ є щонайменше на 80% гомологічною відповідній ділянці послідовності нуклеїнових кислот, вибраної із групи, що складається з SEQ ID NО: 1-132. Далі винахід надає кон’югат, що включає в себе олігомер відповідно до винаходу, наприклад, кон’югат, що на доповнення до послідовності нуклеїнових основ олігомеру включає в себе щонайменше один ненуклеотидний (тобто ненуклеїнові основи) або неполінуклеотидний фрагмент, ковалентно з'єднаний з олігомером винаходу. Ненуклеотидний або неполінуклеотидний фрагмент може складатися або включати в себе стеринову групу, наприклад, холестерин або інший фрагмент, який сприяє проникненню в клітину. Винахід надає кон’югат, що включає в себе олігомер відповідно до винаходу, наприклад, кон’югат, що на доповнення до послідовності нуклеїнових основ олігомеру включає в себе полімерний кон’югат, що містить позитивно заряджені молекули, наприклад, поліетиленгліколь (ПЕГ) - тобто олігомер відповідно до винаходу може за бажанням бути пегильованим. Винахід надає фармацевтичну композицію, що включає в себе олігомер або, як визначено, кон’югат винаходу і фармацевтично прийнятні розріджувач, носій, сіль або ад’ювант. Далі винахід передбачає олігомер відповідно до винаходу для застосування в медицині. Винахід далі передбачає застосування олігомеру винаходу для виробництва лікарського засобу для лікування одного або більше захворювань, які згадуються в описі, наприклад, захворювання вибраного з гіперпроліферативних захворювань, наприклад, захворювань, які згадуються в описі, наприклад, раку. 1 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід далі передбачає олігомер відповідно до винаходу для застосування в лікуванні одного або більше захворювань, які згадуються в описі, наприклад, раку. Також надані фармацевтичні й інші композиції, що містять олігомер або кон’югат винаходу. Далі надані способи зменшення експресії бета-катеніну в клітинах або тканинах, які включають у себе контактування зазначених клітин або тканин in vitro або in vivo з одним або більше олігомерами, кон’югатами або композиціями винаходу. Також розкриті методи лікування тварини або людини, яка передбачувано має або схильна до захворювання або стану, асоційованого з експресією або підвищеною експресією бетакатеніну, шляхом введення зазначеній тварині або людині терапевтично або профілактично ефективної кількості одного або більше олігомерів, кон’югатів або композицій винаходу. Далі надаються способи застосування олігомерів для інгібування експресії бета-катеніну й для лікування захворювань, асоційованих з активністю бета-катеніну. Винахід передбачає спосіб лікування захворювання або порушення, наприклад, захворювання або порушення згадуються в описі, наприклад, гіперпроліферативного захворювання, такого як рак, зазначений спосіб включає в себе введення олігомеру, кон’югата або фармацевтичної композиції відповідно до винаходу пацієнту, який цього потребує. Винахід передбачає спосіб інгібування або зменшення експресії бета-катеніну в клітині або тканині, зазначений спосіб включає в себе стадію контактування зазначеної клітини або тканини з олігомером, кон’югатом або з фармацевтичною композицією відповідно до винаходу так, що експресія бета-катеніну інгібується або зменшується. Винахід передбачає спосіб запускання апоптозу в клітині, наприклад, у раковій клітині, зазначений спосіб включає в себе стадію контактування зазначеної клітини або тканини з олігомером, кон’югатом або з фармацевтичною композицією відповідно до винаходу так, що експресія бета-катеніну інгібується або зменшується і/або запускається апоптоз. Винахід далі передбачає олігомер, що включає в себе або складається з безперервної послідовності нуклеїнових основ, яка є щонайменше на 80% гомологічною ділянці, відповідній послідовності, вибраній із групи, що складається з SEQ ID NO: 1-132 і SEQ ID NO: 174-193, наприклад, послідовності, вибраній із групи, що складається з SEQ ID NO: 189, 192, 58 і 103. Винахід далі передбачає олігомер, що включає в себе або складається з безперервної послідовності нуклеїнових основ, яка відповідає еквівалентній послідовності, представленій в послідовності, вибраній з SEQ ID NO: 174-193, наприклад, SEQ ID NO: 189 або 192. Винахід далі передбачає олігомер, що включає в себе або складається з послідовності, вибраної із групи, яка складається з SEQ ID NO: 133-174, наприклад, SEQ ID NO: 168 або 171, або яка включає в себе або складається з безперервної послідовності нуклеїнових основ, яка відповідає зазначеній послідовності. Пов'язані випадки Наступні споріднені заявки включені в даний опис за допомогою посилань: US 60/915371 і US 61/023244. Короткий опис креслень Фіг. 1: послідовності-мішені бета-катеніну, які відповідають олігонуклеотидним SEQ ID NO: 1, 16, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73, 88, 103 і 118, відповідно, показані товстим шрифтом і підкреслені, показуючи їх положення в транскрипті бета-катеніну (номер доступу в Генбанку NM_001904 - SEQ ID NO: 173). Фіг. 2: експресія бета-катеніну, нормалізована за ГАФДГ, через 24 години після трансфекції клітин SW480. Фіг. 3: вміст білка бета-катеніну в клітинах SW480, трансфекованих олігонуклеотидами в концентрації 1 і 5 нМ, виміряний за допомогою вестерн-блотингу. Як контроль навантаження використовували фарбування тубуліну й як скрембльований контроль (scrambled control) використовували олігонуклеотид SEQ ID NO: 194. Фіг. 4: клітинна проліферація, виміряна за допомогою тесту MTS у клітинах HCT116, трансфекованих олігонуклеотидами в концентрації 25 нМ, виміряними як OD490 у різні часові точки після трансфекції. Як контролі застосовували уявно трансфековані клітини і клітини, трансфековані SEQ ID NO: 194 (скрембльований контроль scrambled control). Фіг. 5: експресія мРНК бета-катеніну в порівнянні з контролем, обробленим фізіологічним розчином, у печінці мишей, виміряна за допомогою кількісної ПЛР після i.v. обробки нуклеотидом 3×25 мг/кг. Експресія бета-катеніну була нормалізована за ГАФДГ і результати були нанесені на графік у порівнянні з контролем, обробленим фізіологічним розчином. 2 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Докладний опис винаходу Олігомер Даний винахід використовує олігомерні сполуки (позначувані в описі як олігомери) для застосування в модулюванні функції молекул нуклеїнової кислоти, молекул, що кодують бетакатенін ссавців, наприклад, нуклеїнової кислоти бета-катеніну, показаної в SEQ ID NO: 173, і алельних варіантів, що зустрічаються в природі, таких молекул нуклеїнової кислоти, що кодують бета-катенін ссавців. Термін "олігомер" у контексті даного винаходу стосується молекули, утвореної за допомогою ковалентного зв'язку двох або більше нуклеїнових основ (тобто олігонуклеотид). В описі кожна окрема нуклеїнова основа також може бути позначена як мономер або молекула. Олігомер складається з або включає в себе безперервну послідовність довжиною 10-50 нуклеїнових основ. Олігомер може включати в себе природні нуклеотидні молекули, наприклад, рибонуклеїнової кислоти (РНК) або дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК), або аналогів нуклеїнової кислоти, або їх сумішей, що згадуються в описі, які переважно включають у себе закриту нуклеїнову кислоту (LNA). Таким чином, термін включає в себе олігомер, який складається з нуклеїнових основ, що зустрічаються в природі, цукрів і зв'язків між нуклеїновими основами, а також олігомери, які мають нуклеїнові основи, що не зустрічаються в природі, які функціонують подібним чином або мають специфічні поліпшені властивості. Повністю або частково модифіковані або заміщені олігомери часто є більш переважними, у порівнянні з нативними формами, через декілька бажаних властивостей таких олігомерів, наприклад, здатність проникати через клітинну мембрану, гарна стійкість до поза- і/або внутрішньоклітинних нуклеаз і висока афінність й специфічність до нуклеїнової кислоти-мішені. LNA-аналог є особливо переважним, наприклад, стосовно згаданих вище властивостей. Таким чином, в особливо переважному втіленні олігомер відповідно до винаходу створюють із молекул нуклеотиду й аналога нуклеотиду, наприклад, молекул LNA або з різних груп молекул аналогів нуклеотидів, щоб створити олігонуклеотид довжиною 10-50, переважно 10-25 нуклеїнових основ, більш переважно 10-16 нуклеїнових основ і ще більш переважно 12-16 нуклеїнових основ. У різних втіленнях олігомер винаходу не включає в себе РНК (молекули). Переважно сполука відповідно до винаходу являє собою лінійну молекулу або синтезується у вигляді лінійної молекули. Олігомер являє собою одноланцюжкову молекулу і переважно не містить коротких ділянок, наприклад, щонайменше 3, 4 або 5 безперервних нуклеїнових основ, які комплементарні еквівалентним ділянкам усередині того ж самого олігомеру (тобто дуплекси) – в цьому відношенні, олігомер (по суті) не є дволанцюжковим. У різних втіленнях олігомер в основному не є дволанцюжковим, наприклад, не є siРНК. Олігомер включає в себе або складається з безперервної послідовності нуклеїнових основ. У різних втіленнях олігомер винаходу може повністю складатися з безперервної ділянки нуклеїнових основ. У різних втіленнях послідовність нуклеїнових основ олігомеру складається з безперервної послідовності нуклеїнових основ. Мішень Термін "нуклеїнова кислота-мішень", застосовуваний в описі, стосується ДНК, що кодує поліпептид бета-катеніну ссавців, наприклад, бета-катенін людини, наприклад, SEQ ID NO: 173, нуклеїнових кислот, що кодують бета-катенін, або їх варіантів, що зустрічаються в природі, і РНК-нуклеїнових кислот, що походять з них, переважно мРНК, наприклад, пре-мРНК, хоча переважною є зріла мРНК. У різних втіленнях, наприклад, у випадку застосування в дослідженні або в діагностиці "нуклеїнова кислота-мішень" може являти собою кДНК або синтетичний олігонуклеотид, одержаний зі згаданої вище ДНК або РНК нуклеїнової кислоти-мішені. Олігомерна сполука відповідно до винаходу переважно здатна до гібридизації з нуклеїновою кислотою-мішенню. Термін "нуклеїнова кислота-мішень" може бути в різних втіленнях, наприклад, екзонами генів людини, що мають номера доступу No X89579, X89593, X89592, X89591, X89588, X89585, X89584 і X89578), або мРНК бета-катеніну ссавців, наприклад, SEQ ID NO: 173. Приклади інших мРНК бета-катеніну ссавців включають в себе без обмеження мРНК, що мають номери доступу NM_001098209, NM_0010987210 (мРНК бета-катеніну людини); NM_007614 (мРНК бетакатеніну миші); NM_053357 (мРНК бета-катеніну щура); NM-001122762, DQ267491 (мРНК бетакатеніну коня); NM_214367 (мРНК бета-катеніну свині); BC119949, BT030683 (мРНК бетакатеніну корови). Варто розрізняти, що згадані вище номери доступу стосуються послідовності кДНК, а не послідовності мРНК безпосередньо - послідовність зрілої мРНК може бути одержана безпосередньо з послідовності кДНК - залишки тиміну (T) повинні бути заміщені залишками урацилу (U). 3 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Застосовуваний в описі термін "гібридизація" означає водневе зв'язування, яке може бути уотсон-криківським, хугстенівським, зворотним хугстенівським водневим зв'язуванням і т. д. між комплементарними нуклеотидними/нуклеїновими основами. Уотсон і Крик показали приблизно п'ятдесят років тому, що дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК) складається із двох ланцюжків, які утримуються разом у конфігурації спіралі водневими зв'язками, які утворюються між розташованими один навпроти одного комплементарними нуклеїновими основами із двох ланцюжків. Чотири нуклеїнових основи, що звичайно виявляються в ДНК, являють собою гуанін (G), аденін (A), тимін (T) і цитозин (C), з них нуклеїнова основа G утворює пару з C, і нуклеїнова основа A утворює пару з T. У РНК нуклеїнова основа тимін заміщається нуклеїновою основою урацил (U), яка аналогічна нуклеїновій основі T і утворює пару з A. Хімічні групи в нуклеїнових основах, які беруть участь в утворенні стандартного дуплекса, складають уотсон-криківську поверхню. Хугстен показав через два роки, що пуринові нуклеїнові основи (G і A) додатково до їх уотсон-криківської поверхні мають хугстенівську поверхню, яка може бути розпізнана із зовнішньої сторони дуплекса й використана для зв'язування піримідинових нуклеотидів водневим зв'язком з утворенням потрійної спіральної структури. Особливо переважно, що сполуки винаходу здатні гібридизуватися з нуклеїновою кислотоюмішенню, наприклад, мРНК. Відповідно, олігомер або кон’югат винаходу здатний до інгібування, наприклад, до пригнічення експресії гена бета-катеніну. У різних втіленнях олігомери винаходу зв'язуються з нуклеїновою кислотою-мішенню й викликають інгібування експресії щонайменше на 10% або 20%, у порівнянні з нормальним рівнем експресії, більш переважно щонайменше інгібування на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% або 95%, у порівнянні з нормальним рівнем експресії. У деяких втіленнях зазначену модуляцію спостерігають у випадку застосування 1-25 нМ олігомеру або кон’югата винаходу. У тому ж самому або в іншому втіленні інгібування експресії становить менше ніж 100%, наприклад, менше ніж 98% інгібування, менше ніж 95% інгібування, менше ніж 90% інгібування, менше ніж 80% інгібування, наприклад, менше ніж 70% інгібування. Модуляція рівня експресії може бути визначена шляхом вимірювання рівнів білка, наприклад, за допомогою методів, таких як SDS-PAGE, з наступним вестерн-блотингом, із застосуванням відповідних антитіл, викликаних проти білка-мішені. Альтернативно, модуляція, наприклад, інгібування рівнів експресії, може бути визначена шляхом вимірювання мРНК, наприклад, за допомогою нозерн-блотингу або кількісної ПЛР-РВ. У випадку вимірювання за допомогою рівнів мРНК, рівень інгібування або знижувальної регуляції при застосуванні відповідної дози, наприклад, 1-25 нМ, становить у різних втіленнях звичайно 10-20% від нормальних рівнів за відсутності сполуки винаходу. Таким чином, винахід надає спосіб знижувальної регуляції або інгібування експресії білка й/або мРНК бета-катеніну в клітині, що експресує білок і/або мРНК бета-катеніну, зазначений спосіб включає в себе введення олігомеру або кон’югата відповідно до винаходу в зазначену клітину для знижувальної регуляції або інгібування експресії білка й/або мРНК бета-катеніну в зазначеній клітині. Відповідно, клітина являє собою клітину ссавця, наприклад, клітину людини. Введення може здійснюватися в різних втіленнях in vitro. Введення може здійснюватися в різних втіленнях in vivo. Термін "нуклеїнова кислота-мішень", застосовуваний в описі, стосується ДНК, що кодує поліпептид бета-катеніну ссавців, наприклад, бета-катеніну людини, наприклад, SEQ ID NO: 173, нуклеїнових кислот, що кодують бета-катенін, або їх варіантів, що зустрічаються в природі, і РНК-нуклеїнових кислот, що походять з них, переважно мРНК, наприклад, пре-мРНК, хоча переважною є зріла мРНК. У різних втіленнях, наприклад, у випадку застосування в дослідженні або в діагностиці "нуклеїнова кислота-мішень" може являти собою кДНК або синтетичний олігонуклеотид, одержаний зі згаданої вище ДНК або РНК нуклеїнової кислоти-мішені. Олігомерна сполука відповідно до винаходу переважно здатна до гібридизації з нуклеїновою кислотою-мішенню. Термін "їх варіанти, що зустрічаються в природі" стосується варіантів поліпептиду або послідовності нуклеїнової кислоти бета-катеніну, які зустрічаються в природі в певній таксонометричній групі, наприклад, ссавців, наприклад, миша, мавпа і переважно людина. Звичайно, при посиланні на "варіанти полінуклеотиду, що зустрічаються в природі", термін також може охоплювати будь-який алельний варіант геномної ДНК, що кодує бета-катенін, який знаходять у хромосомі Chr 3:41.22 - 41.26 Mb, за допомогою хромосомної транслокації або дуплікації, і РНК, наприклад, мРНК одержуваної з нього. При згадуванні "специфічної поліпептидної послідовності", термін також включає в себе, наприклад, форми білка, що зустрічаються в природі, які можуть бути процесовані, наприклад, шляхом ко- або посттрансляційних модифікацій, наприклад, розщеплення сигнального пептиду, протеолітичне розщеплення, глікозилування і т. д. 4 UA 101317 C2 5 10 15 Термін "щонайменше один" включає в себе цілі числа, які більше або дорівнюють 1, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 і так далі. У різних втіленнях, наприклад, якщо мають на увазі нуклеїнову кислоту або білок - мішені сполуки винаходу, термін "щонайменше один" включає в себе терміни "щонайменше два" і "щонайменше три" і "щонайменше чотири", також терміни "щонайменше два" може включати в себе терміни "щонайменше три" і "щонайменше чотири". Послідовності Олігомери винаходу можуть мати своєю мішенню мРНК бета-катеніну людини, і, наприклад, вони включають в себе або складаються з безперервної послідовності нуклеїнових основ, яка відповідає нуклеотидній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 173, або послідовності, вибраній із групи, що складається з SEQ ID NO: 1-132, де зазначений олігомер (або його частина, що складається з безперервних нуклеїнових основ) може при бажанні включати в себе одну, дві або три розбіжності, у порівнянні із зазначеною вибраною послідовністю. У різних втіленнях олігонуклеотидні послідовності складаються з або включають в себе послідовність із 10-16 (безперервних) нуклеїнових основ. Приклади олігонуклеотидних послідовностей, що включають у себе 16 нуклеїнових основ, показані в SEQ ID NO: 1, 16, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73, 88, 103 і 118. Більш короткі послідовності можуть бути одержані на основі представлених послідовностей. Більш довгі послідовності можуть включати в себе всі або щонайменше 10 нуклеїнових основ з відповідної SEQ ID NO. 20 5 UA 101317 C2 6 UA 101317 C2 7 UA 101317 C2 8 UA 101317 C2 9 UA 101317 C2 5 10 15 Винахід далі надає послідовності-мішені в гені бета-катеніну, зокрема послідовності, що відповідають (тобто зворотно комплементарні) SEQ ID NO: 1-132, де антисмислові олігонуклеотиди (олігомери), що відповідають зазначеним послідовностям-мішеням, здатні до знижувальної регуляції бета-катеніну. Наприклад, послідовності-мішені, які відповідають антисмисловим олігонуклеотидним послідовностям SEQ ID NO: 1, 16, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73, 88, 103 і 118, відповідно, показані на фіг. 1 (виділені товстим шрифтом і підкреслені, з відповідними оліго SEQ ID NO, показаними вище). Олігомер винаходу, відповідно, може включати в себе або складатися з, або бути одержаний з (наприклад, включати в себе відповідну безперервну послідовність нуклеїнових основ, що виявляється в зазначеній SEQ ID) послідовності, вибраної з SEQ ID NO: 174-193. Переважно, послідовність включає в себе послідовність із 10-16 нуклеїнових основ. Приклади послідовностей, що включають в себе 16 нуклеїнових основ, показані в SEQ ID, вибраній із групи, що складається з SEQ ID NO: 1, 16, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73, 10 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 88, 103 і 118. Послідовності, які мають менше нуклеїнових основ, наприклад, 10, 11, 12, 13, 14 або 15, можуть, таким чином, мати безперервну послідовність нуклеїнових основ, яка відповідає субпослідовності, наприклад, щонайменше з 8, щонайменше з 9, щонайменше з 10, щонайменше з 11, щонайменше з 12, щонайменше з 13, щонайменше з 14 або 15 безперервних нуклеїнових основ, що виявляються в SEQ ID NO: 1, 16, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73, 88, 103 і 118. Отже, більш короткі послідовності можуть бути одержані на основі зазначених послідовностей. Більш довгі послідовності можуть включати в себе всі або щонайменше 10 нуклеїнових основ з послідовностей, представлених як приклади SEQ ID NO. Звичайно хоча б частина послідовності олігонуклеотиду представлена в SEQ ID, вибраній з SEQ ID NO: 1, 16, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73, 88, 103 і 118, у такому випадку частина послідовності олігонуклеотиду, що залишилася, є гомологічною відповідним нуклеотидам, фланкуючим зазначену SEQ ID. Два мотиви послідовності, які викликають інтерес, являють собою SEQ ID NO: 58 і SEQ ID NO: 103. Також розкриті конкретні структури олігомерів винаходу, наприклад, олігомерів, показаних в SEQ ID NO: 133-152, особливо SEQ ID NO: 133, 134, 135, 136, 138, 141, 148, 149, 150, 151 і 152. Також розкриті конкретні структури LNA-олігонуклеотидів, наприклад, LNA-олігонуклеотидів, показаних в SEQ ID NO: 153-172, особливо SEQ ID NO: 153, 154, 155, 156, 158, 161, 168, 169, 170, 171 і 172. У переважних втіленнях олігомери винаходу розглядають як ефективні інгібітори мРНК і експресії білка бета-катеніну. У певних втіленнях олігомер може включати в себе або складатися з безперервної послідовності нуклеїнових основ, які повністю комплементарні (абсолютно комплементарні) еквівалентній ділянці нуклеїнової кислоти, що кодує бета-катенін ссавців. Однак у деяких втіленнях олігомер може включати в себе 1, 2, 3 або 4 (або більше) розбіжностей і в той же час гібридизуватися з послідовністю-мішенню і як і раніше адекватно зв'язуватися з мішенню й проявляти бажаний ефект, тобто знижувальну регуляцію мішені. Розбіжності можуть бути компенсовані, наприклад, за допомогою збільшення довжини олігомерної послідовності нуклеїнових основ і/або збільшення числа нуклеотидних аналогів, наприклад, LNA, представлених у послідовності нуклеїнових основ. У різних втіленнях безперервна послідовність нуклеїнових основ включає в себе не більше ніж 3, наприклад, не більше ніж 2 розбіжності з послідовністю-мішенню, наприклад, з відповідною ділянкою нуклеїнової кислоти, що кодує бета-катенін ссавців. У різних втіленнях безперервна послідовність нуклеїнових основ включає в себе не більше ніж одну розбіжність із послідовністю-мішенню, наприклад, відповідну ділянку нуклеїнової кислоти, що кодує бета-катенін ссавців. Послідовність нуклеїнових основ олігомерів винаходу або безперервна послідовність нуклеїнових основ є переважно щонайменше на 80% гомологічною відповідній послідовності, вибраній із групи, що складається з SEQ ID NO: 1-132, наприклад, щонайменше на 85%, щонайменше на 90%, щонайменше на 91%, щонайменше на 92%, щонайменше на 93%, щонайменше на 94%, щонайменше на 95%, щонайменше на 96%, щонайменше на 97%, щонайменше на 98%, щонайменше на 99% гомологічною, наприклад, на 100% гомологічною (ідентичною). Послідовність нуклеїнових основ олігомерів винаходу або безперервна послідовність нуклеїнових основ є переважно щонайменше на 80% гомологічною відповідній послідовності, представленій в SEQ ID NO: 173, наприклад, щонайменше на 85%, щонайменше на 90%, щонайменше на 91%, щонайменше на 92%, щонайменше на 93%, щонайменше на 94%, щонайменше на 95%, щонайменше на 96%, щонайменше на 97%, щонайменше на 98%, щонайменше на 99% гомологічною, наприклад, на 100% гомологічною (ідентичною). Послідовність нуклеїнових основ олігомерів винаходу або безперервна послідовність нуклеїнових основ є переважно щонайменше на 80% комплементарною субпослідовності, представленій в SEQ ID NO: 173, наприклад щонайменше на 85%, щонайменше на 90%, щонайменше на 91%, щонайменше на 92%, щонайменше на 93%, щонайменше на 94%, щонайменше на 95%, по меншій мері на 96% комплементарною, щонайменше на 97%, щонайменше на 98%, щонайменше на 99%, наприклад, на 100% комплементарною (абсолютно комплементарною). У різних втіленнях олігомер (або його частина з безперервних нуклеїнових основ) вибраний з або включає в себе одну з послідовностей, вибраних із групи, що складається з SEQ ID NO: 1132 або SEQ ID NO: 174-193, або субпослідовність щонайменше з 10 безперервних нуклеїнових основ з даних послідовностей, де зазначений олігомер (або його частина з безперервних нуклеїнових основ) може за бажанням включати в себе одну, дві або три розбіжності, у порівнянні із зазначеною вибраною послідовністю. 11 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У різних втіленнях субпослідовність може складатися з 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 або 29 безперервних нуклеїнових основ, наприклад, 10-15, 12-25, 12-22, наприклад, 12-18 нуклеїнових основ. Відповідно, у різних втіленнях субпослідовність має таку ж довжину, як безперервна послідовність нуклеїнових основ олігомеру винаходу. Однак варто розуміти, що в різних втіленнях послідовність нуклеїнових основ олігомеру може включати в себе додаткові 5'- або 3'-нуклеїнові основи, наприклад, незалежно 1, 2, 3, 4 або 5 додаткових нуклеїнових основ по 5'- і/або по 3'-кінцю, які некомплементарні послідовностімішені. Відносно цього олігомер винаходу може в різних втіленнях включати в себе безперервну послідовність нуклеїнових основ, яка фланкована по 5'- і/або по 3'-кінцю додатковими нуклеїновими основами. У різних втіленнях 3'-кінець безперервної послідовності нуклеїнових основ фланкований 1, 2 або 3 молекулами ДНК або РНК. При твердофазному синтезі олігомерів часто застосовують 3'-ДНК молекули. У різних втіленнях, які можуть бути одними й тими самими або різними, 5'-кінець безперервної послідовності нуклеїнових основ фланкований 1, 2 або 3 молекулами ДНК або РНК. У різних втіленнях додаткові 5'- або 3'нуклеїнові основи являють собою нуклеотиди, що зустрічаються в природі, наприклад ДНК або РНК. У різних втіленнях додаткові 5'- або 3'-нуклеїнові основи можуть являти собою ділянку D, що згадується в описі в контексті гепмерних олігомерів (gapmer oligomers). У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 1 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 16 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 17 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 18 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 33 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 34 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 49 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 50 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 51 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 52 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 53 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 54 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 55 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 56 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 57 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 58 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 73 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 88 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 103 або її субпослідовність. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з або включає в себе послідовність нуклеїнових основ згідно з SEQ ID NO: 118 або її субпослідовність. При визначенні "гомології" або "комплементарності" між олігомерами винаходу (або безперервною послідовністю нуклеїнових основ) і нуклеїновою кислотою, що кодує бета-катенін ссавців, наприклад, послідовності, розкриті в описі, визначення гомології може бути здійснене 12 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 за допомогою простого вирівнювання відповідної послідовності нуклеїнових основ сполуки винаходу й відповідної ділянки нуклеїнової кислоти, що кодує бета-катенін ссавців (або нуклеїнової кислоти-мішені), або їх комплементарних послідовностей, і гомологію визначають шляхом підрахунку числа основ, які вирівняні, ділення на загальне число безперервних нуклеїнових основ у сполуці (олігомері) винаходу й множення на 100. При зазначеному порівнянні, якщо є розриви, переважно, щоб дані розриви являли собою тільки розбіжності, а не області, де число нуклеїнових основ всередині розриву відрізняється в послідовності нуклеїнових основ винаходу й в нуклеїновій кислоті-мішені. Амінокислотна й полінуклеотидна гомологія може бути визначена за допомогою алгоритму ClustalW із застосуванням стандартних установок: див. http://www.ebi.ac.uk/emboss/aliqn/index.html. Метод: EMBOSS: : вода (локально) : Відкриття гепа = 10,0, Довжина гепа = 0,5, із застосуванням Blosum 62 (білок), або повної ДНК-послідовності нуклеотидних/нуклеїнових основ. Дані вирівнювання також можуть бути застосовані для ідентифікації ділянок нуклеїнових кислот, що кодують бета-катенін людини й різних видів ссавців, наприклад, мавпи, миші й/або щура, де є достатні по довжині відрізки комплементарності нуклеїнових кислот, для розрізнення структури олігонуклеотидів, які мають своєю мішенню нуклеїнову кислоту-мішень бета-катеніну людини й відповідні нуклеїнові кислоти, представлені в різних видах ссавців, наприклад, олігомери, які складаються з або включають в себе ділянки із щонайменше 10, наприклад, щонайменше 12, наприклад, щонайменше 14, наприклад, щонайменше 16, наприклад, щонайменше 18, наприклад, з 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 або 18 безперервних нуклеїнових основ, які на 100% комплементарні еквівалентним ділянкам нуклеїнової кислоти, що кодує бета-катенін людини, і нуклеїнової кислоти (кислот), що кодує бета-катенін різних видів ссавців. У різних втіленнях олігомер винаходу включає в себе або складається з безперервної послідовності нуклеїнових основ, що є щонайменше на 80%, наприклад, щонайменше на 85%, наприклад щонайменше на 90%, наприклад, щонайменше на 95%, наприклад, щонайменше на 98%, наприклад, щонайменше на 99%, або на 100% гомологічною відповідній ділянці нуклеїнової кислоти, що кодує бета-катенін людини, і нуклеїнової кислоти (кислот), що кодують бета-катенін різних видів ссавців, наприклад, нуклеїнової кислоти, що кодує бета-катенін миші (тобто на 80-100% комплементарний еквівалентній ділянці людини й послідовності миші). Переважно, безперервна послідовність нуклеїнових основ олігомеру є на 100% комплементарною еквівалентній ділянці мРНК бета-катеніну людини. Терміни "відповідний" і "відповідає" стосуються порівняння послідовності нуклеїнових основ олігомеру або безперервної послідовності нуклеїнових основ і еквівалентної нуклеотидної послідовності i) зворотної комплементарної послідовності нуклеїнової кислоти-мішені, наприклад, мРНК, що кодує білок бета-катенін, наприклад, SEQ ID NO: 173, і/або ii) послідовності нуклеотидів, наданих в описі, наприклад, група, що складається з SEQ ID NO: 1132 або SEQ ID NО: 174-193. Нуклеотидні аналоги порівнюють безпосередньо з їх еквівалентом або з відповідними нуклеотидами. Терміни "відповідний нуклеотидний аналог" і "відповідний нуклеотид" призначені для того, щоб показати, що нуклеїнові основи в нуклеотидному аналозі й нуклеотид, що зустрічається в природі, є ідентичними. Наприклад, якщо молекула 2-дезоксирибози нуклеотиду пов'язана з аденіном, "відповідний нуклеотидний аналог" містить молекулу пентози (що відрізняється від 2дезоксирибози), пов'язану з аденіном. Довжина Олігомер включає в себе або складається з безперервної послідовності нуклеїнових основ загальною довжиною 10-50 нуклеїнових основ, наприклад, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 або 30 безперервних нуклеїнових основ. У різних втіленнях олігомери включають в себе або складаються з безперервної послідовності нуклеїнових основ загальною довжиною 10-25, 10-24, 12-25, 12-24 або 10-22, наприклад, 12-18, наприклад, 13-17 або 12-16, наприклад, 13, 14, 15, 16 безперервних нуклеїнових основ. У різних втіленнях, олігомери включають в себе або складаються з безперервної послідовності нуклеїнових основ загальною довжиною 10, 11, 12, 13 або 14 безперервних нуклеїнових основ. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу складається з не більше ніж 22 нуклеїнових основ, наприклад, не більше ніж 20 нуклеїнових основ, наприклад, не більше ніж 18 нуклеїнових основ, наприклад, 15, 16 або 17 нуклеїнових основ. У різних втіленнях олігомер винаходу включає в себе менше ніж 20 нуклеїнових основ. Нуклеотиди й нуклеотидні аналоги Термін "нуклеотид", застосовуваний в описі, стосується глікозиду, що включає в себе цукрову частину, основну частину й ковалентно зв'язану фосфатну групу, і охоплює нуклеотиди, 13 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 що зустрічаються в природі, наприклад, ДНК або РНК, переважно ДНК. Нуклеотиди, що не зустрічаються в природі, які містять модифіковані цукрові й/або основні частини, позначені в описі як "нуклеотидні аналоги". Термін "нуклеїнова основа" охоплює природні (ДНК- або РНКтипу) нуклеотиди, а також нуклеотидні аналоги. Нуклеотиди, що не зустрічаються в природі, включають в себе нуклеотиди, які мають модифіковані цукрові частини, наприклад, біциклічні нуклеотиди або 2'-модифіковані нуклеотиди, наприклад, 2'-заміщені нуклеотиди. "Нуклеотидні аналоги" являють собою варіанти природних нуклеотидів, наприклад, ДНК- або РНК-нуклеотидів, на основі модифікацій у цукровій і/або в основній частинах. Аналоги в принципі можуть бути просто "мовчазними" або "еквівалентними" природним нуклеотидам у контексті олігонуклеотиду, тобто можуть не мати функціонального ефекту на шлях впливу олігонуклеотиду при інгібуванні експресії гена-мішені. Зазначені "еквівалентні" аналоги проте можуть бути корисні, якщо, наприклад, вони є більш простими або дешевими в одержанні, або більш стабільними при зберіганні або при одержанні, або являють собою таг або мітку. Переважно, однак, аналоги будуть мати функціональний ефект на шлях впливу олігонуклеотиду при інгібуванні експресії; наприклад, шляхом створення підвищеної афінності зв'язування з мішенню й/або підвищеної стійкості до внутрішньоклітинних нуклеаз і/або полегшення транспорту усередину клітини. Термін "нуклеїнова основа" застосовують як загальний термін, що охоплює нуклеотиди й нуклеотидні аналоги. Послідовність нуклеїнових основ являє собою послідовність, що включає в себе щонайменше два нуклеотиди або нуклеотидні аналоги. У різних втіленнях послідовність нуклеїнових основ може включати в себе тільки нуклеотиди, наприклад, молекули ДНК, в альтернативному втіленні послідовність нуклеїнових основ може включати в себе тільки нуклеотидні аналоги, наприклад, молекули LNA, або в різних втіленнях послідовність нуклеїнових основ може включати в себе молекули нуклеотидів і нуклеотидних аналогів. Термін "нуклеїнова кислота" означає молекулу, утворену шляхом ковалентного зв'язування двох або більше нуклеотидів. Терміни "нуклеїнова кислота" і "полінуклеотид" застосовують в описі взаємозамінно. Термін "основна частина" нуклеїнової основи охоплює основи нуклеїнових основ, які зустрічаються в природі, а також які не зустрічаються в природі. Таким чином, основна частина включає в себе не тільки відомі пуринові й піримідинові гетероцикли, але також гетероциклічні аналоги і їх таутомери. Приклади таких основних частин включають в себе без обмеження аденін, гуанін, цитозин, тимідин, урацил, ксантин, гіпоксантин, 5-метилцитозин, ізоцитозин, псевдоізоцитозин, 5-бромурацил, 5-пропінілурацил, 6-амінопурин, 2-амінопурин, інозин, діамінопурин і 6-амінопурин. У різних втіленнях щонайменше одна з нуклеїнових основ, представлених в олігомері, включає в себе модифіковану основу, наприклад, вибрану із групи, що складається з 5метилцитозину, ізоцитозину, псевдоізоцитозину, 5-бромурацилу, 5-пропінілурацилу, 6амінопурину, 2-амінопурину, інозину, діамінопурину й 6-амінопурину. Конкретні приклади нуклеозидних/нуклеотидних аналогів описані, наприклад, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 і Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, і в Схемі 1. 14 UA 101317 C2 Схема 1 5 10 15 20 25 Таким чином, олігомер може включати в себе або складатися із простої послідовності нуклеотидів, що зустрічаються в природі - переважно 2'-деоксинуклеотидів (звичайно позначуваних в описі як "ДНК"), але також можливі рибонуклеотиди (звичайно позначувані в описі як "РНК"), або комбінація таких нуклеотидів, що зустрічаються в природі, і одного або більше нуклеотидів, що не зустрічаються в природі, тобто нуклеотидних аналогів. Дані нуклеотидні аналоги можуть відповідно підсилювати афінність олігомеру до послідовностімішені. Приклади придатних і переважних нуклеотидних аналогів описані в WO 2007/031091, які включені за допомогою посилання або згадуються в описі. Одна переважна модифікація нуклеотиду включає в себе нуклеотиди, де цукрова частина модифікована для одержання 2'заміщеної групи або для створення з'єднаної місточковим зв'язком (закрита нуклеїнова кислота - LNA) структури, що підсилює афінність зв'язування й можливо також забезпечує деяке зростання нуклеазної стійкості; заміна звичайного фосфодіефірного внутрішньонуклеотидного зв'язку на зв'язок, більш стійкий до нуклеазної атаки, наприклад, на фосфоротіоатний або боранофосфатний зв'язки - зазначені два зв'язки розщеплюються РНКазою H - також робить можливим зазначений шлях антисмислового інгібування при модуляції експресії бета-катеніну. Включення в олігомер нуклеотидних аналогів, що підсилюють афінність, наприклад, LNA або 2'заміщених цукрів, може забезпечити необхідне зменшення розміру олігомери, що специфічно зв'язується, і також може знизити верхню межу розміру олігомеру, перше ніж відбудеться неспецифічне або аберантне зв'язування. У різних втіленнях олігомер включає в себе щонайменше 2 нуклеотидні аналоги. У деяких втіленнях олігомер включає в себе 3-8 нуклеотидних аналогів, наприклад, 6 або 7 нуклеотидних аналогів. У деяких переважних втіленнях щонайменше один з нуклеотидних аналогів являє собою закриту нуклеїнову кислоту (LNA); наприклад, щонайменше 3 або щонайменше 4, або 15 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 щонайменше 5, або щонайменше 6, або щонайменше 7, або щонайменше 8 нуклеотидних аналогів можуть бути LNA. У деяких втіленнях всі нуклеотидні аналоги можуть бути LNA. Варто розуміти, що при посиланні на мотив переважної нуклеотидної послідовності або на нуклеотидну послідовність, що складається тільки з нуклеотидів, олігомери винаходу, які визначають за допомогою зазначеної послідовності, можуть включати в себе відповідний нуклеотидний аналог замість одного або більше нуклеотидів, представлених у зазначеній послідовності, наприклад, молекули LNA або інші нуклеотидні аналоги, які підвищують стабільність дуплекса/Tm для олігомер/дуплекс-мішень (тобто нуклеотидні аналоги, що підсилюють афінність). У різних втіленнях будь-які розбіжності між нуклеотидною послідовністю олігомеру й послідовністю-мішенню зустрічаються переважно в ділянках за межами нуклеотидних аналогів, що підсилюють афінність (наприклад, ділянки A і C), наприклад, у ділянці B, яка згадується в описі, і/або в ділянці D, який згадується в описі, і/або в сайті немодифікованих, наприклад, нуклеотидів ДНК в олігонуклеотиді, і/або в ділянках, які являють собою 5'-кінець або 3'-кінець безперервної послідовності нуклеїнових основ. Приклади зазначеної модифікації нуклеотиду включають в себе зміну цукрової частини для одержання 2'-заміщені групи або для створення з'єднаної місточковим зв'язком (закрита нуклеїнова кислота) структури, яка підсилює афінність зв'язування й також може забезпечувати збільшення стійкості до нуклеаз. Переважний нуклеотидний аналог являє собою LNA, наприклад, окси-LNA (наприклад, бетаD-окси-LNA і альфа-L-окси-LNA) і/або аміно-LNA (наприклад, бета-D-аміно-LNA і альфа-L-аміноLNA), і/або тіо-LNA (наприклад, бета-D-тіо-LNA і альфа-L-тіо-LNA), і/або ENA (наприклад, бетаD-ENA і альфа-L-ENA). У різних втіленнях молекули LNA являють собою бета-D-окси-LNA. У деяких втіленнях нуклеотидні аналоги, представлені в олігомері винаходу (наприклад, у ділянках A і C, згадуваних в описі), незалежно вибрані, наприклад, з: молекул 2'-O-алкіл-РНК, молекул 2'-аміно-ДНК, молекул 2'-фтор-ДНК, молекул LNA, молекул арабінонуклеїнової кислоти (ANA), молекул 2'-фтор-ANA, молекул HNA, молекул INA (інтеркалююча нуклеїнова кислота Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925, включено в опис за допомогою посилання) і молекул 2'-MOE. У різних втіленнях є тільки один зі згаданих вище типів нуклеотидних аналогів, представлених в олігомері винаходу або в його безперервній послідовності нуклеїнових основ. У різних втіленнях нуклеотидні аналоги являють собою 2'-O-метоксіетил-РНК (2'-MOE), мономери 2'-фтор-ДНК або LNA-нуклеотидні аналоги, і, як зазначений олігонуклеотид винаходу, можуть включати в себе нуклеотидні аналоги, які незалежно вибрані із трьох аналогів, або можуть включати в себе тільки один тип аналога, вибраний із трьох типів. У різних втіленнях щонайменше один із зазначених нуклеотидних аналогів являє собою 2'-MOE-РНК, наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 нуклеотидних молекул 2'-MOE-РНК. У різних втіленнях щонайменше один із зазначених нуклеотидних аналогів являє собою 2'-фтор-ДНК, наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 нуклеотидних молекул 2'-фтор-ДНК. У різних втіленнях олігомер відповідно до винаходу включає в себе щонайменше одну молекулу закритої нуклеїнової кислоти (LNA), наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 молекул LNA, наприклад, 3-7 або 4-8 молекул LNA або 3, 4, 5, 6 або 7 молекул LNA. У різних втіленнях всі нуклеотидні аналоги являють собою LNA. У деяких втіленнях олігомер може включати в себе бета-D-окси-LNA і одну або більше з наступних молекул LNA: тіо-LNA, аміно-LNA, окси-LNA і/або ENA або в конфігурації бета-D, або в конфігурації альфа-L, або в їх комбінації. У різних втіленнях всі молекули LNA-цитозину являють собою 5'-метилцитозин. У різних втіленнях винаходу олігомер може включати в себе молекули LNA і ДНК. Переважно загальне число молекул LNA і ДНК становить 10-25, переважно 10-20, ще більш переважно 12-16. У різних втіленнях винаходу послідовність нуклеїнових основ олігомеру, наприклад, безперервна послідовність нуклеїнових основ, складається із щонайменше однієї LNA і нуклеотидні молекули, що залишилися, являють собою молекули ДНК. У різних втіленнях олігомер включає в себе тільки нуклеотидні аналоги LNA і нуклеотиди, що зустрічаються в природі (наприклад, РНК або ДНК, найбільш переважно нуклеотиди ДНК), за бажанням з модифікованими з'єднувальними групами, наприклад, з фосфоротіоатними групами. У різних втіленнях щонайменше одна з нуклеїнових основ, представлених в олігомері, має модифіковану основу, вибрану із групи, що складається з 5-метилцитозину, ізоцитозину, псевдоізоцитозину, 5-бромурацилу, 5-пропінілурацилу, 6-амінопурину, 2-амінопурину, інозину, діамінопурину й 6-амінопурину. LNA Термін "LNA" стосується біциклічного нуклеотидного аналога, відомого як "закрита нуклеїнова кислота". Термін може стосуватися мономера LNA або, у випадку застосування в 16 UA 101317 C2 контексті "олігонуклеотиду LNA" або "олігомеру" LNA, може стосуватися олігомеру, що містить один або більше таких біциклічних нуклеотидних аналогів. Застосовувана в олігомерах винаходу LNA переважно має структуру із загальною формулою I 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 , N* 6 6* де X вибирають із -О-, -S-, -N(R )-, -C(R R )-; B вибирають із водню, при бажанні заміщеного C 1-4-алкокси, при бажанні заміщеного C1-4алкілу, при бажанні заміщеного C1-4-ацилокси, нуклеїнових основ, інтеркаляторів ДНК, фотохімічно активних груп, термохімічно активних груп, хелатоутворювальних груп, "репортерних" груп і лігандів; P означає положення радикала для внутрішньонуклеотидного зв'язку з наступним мономером або 5'-кінцеву групу, такий внутрішньонуклеотидний зв'язок або 5'-кінцева група за 5 бажанням включає в себе заміщувальну групу R або рівною мірою застосовну заміщувальну 5* групу R ; P* означає внутрішньонуклеотидний зв'язок з попереднім мономером або 3'-кінцеву групу; 4* 2* a b R і R разом означають бірадикал, що складається з 1-4 груп/атомів, вибраних з -C(R R )-, a b a a a -C(R )=C(R )-, -C(R )=N-, -O-, -Si(R )2-, -S-, -SO2-, -N(R )- і >C=Z, a a b де Z вибраний з -О-, -S- і -N(R )-, і R і R кожний незалежно вибраний з водню, за бажанням заміщеного на C1-12-алкіл, за бажанням заміщеного на C2-12-алкеніл, за бажанням заміщеного на C2-12-алкініл, гідрокси, C1-12-алкокси, C2-12-алкоксіалкіл, C2-12-алкенілокси, карбокси, C1-12алкоксикарбоніл, C1-12-алкілкарбоніл, форміл, арил, арилоксикарбоніл, арилокси, арилкарбоніл, гетероарил, гетероарилоксикарбоніл, гетероарилокси, гетероарилкарбоніл, аміно, моно- і ді(C16-алкіл)аміно, карбамоїл, моно- і ді(C1-6-алкіл)амінокарбоніл, аміно-C1-6-алкіламінокарбоніл, моно- і ді(C1-6-алкіл)аміно-C1-6-алкіламінокарбоніл, C1-6-алкілкарбоніламіно, карбамідо, C1-6алканоїлокси, сульфоно, C1-6-алкілсульфонілокси, нітро, азидо, сульфаніл, C1-6-алкілтіо, галоген, інтеркалятори ДНК, фотохімічно активні групи, термохімічно активні групи, хелатуючі групи, "репортерні" групи й ліганди, де арил і гетероарил можуть бути за бажанням заміщені, й a b де два гемінальних замісники R і R разом можуть означати за бажанням заміщений метилен (=CH2), і 1* 2 3 5 5* 6 6* кожний із замісників R , R , R , R , R , R і R , які представлені, вибраний незалежно з водню, за бажанням заміщеного на C1-12-алкіл, за бажанням заміщеного на C2-12-алкеніл, за бажанням заміщеного на C2-12-алкініл, гідрокси, C1-12-алкокси, C2-12-алкоксіалкіл, C2-12алкенілокси, карбокси, C1-12-алкоксикарбоніл, C1-12-алкілкарбоніл, форміл, арил, арилоксикарбоніл, арилокси, арилкарбоніл, гетероарил, гетероарилоксикарбоніл, гетероарилокси, гетероарилкарбоніл, аміно, моно- і ді(C1-6-алкіл)аміно, карбамоїл, моно- і ді(C1аміно-C1-6-алкіламінокарбоніл, моноі ді(C1-6-алкіл)аміно-C1-66-алкіл)амінокарбоніл, алкіламінокарбоніл, C1-6-алкілкарбоніламіно, карбамідо, C1-6-алканоїлокси, сульфоно, C1-6алкілсульфонілокси, нітро, азидо, сульфаніл, C1-6-алкілтіо, галоген, інтеркалятори ДНК, фотохімічно активні групи, термохімічно активні групи, хелатуючі групи, "репортерні" групи й ліганди, де арил і гетероарил можуть бути за бажанням заміщені, і де два гемінальних замісники разом можуть означати оксо, тіоксо, іміно або за бажанням заміщений метилен, або разом можуть утворювати спіробірадикал, що складається з алкіленового ланцюга з 1-5 атомів вуглецю, що за бажанням переривається й/або закінчується одним або більше N N гетероатомами/групами, вибраними з -O-, -S- і -(NR )-, де R вибраний з водню й C1-4-алкілу, і де два сусідніх (негемінальних) замісники можуть означати додатковий зв'язок, даючи в N* результаті подвійний зв'язок; і R , у тих випадках, коли представлений і не залучений у бірадикал, вибраний з водню й C1-4-алкілу; і їх основні солі й кислі солі додавання. 5* 3 У різних втіленнях R вибраний з H, -CH3, -CH2-CH , -CH2-O-CH3 і -CH=CH2. 4* 2* a b a b У різних втіленнях R і R разом означають бірадикал, вибраний з -C(R R )-O, -C(R R )c d a b c d e f a b c d a b c d a b C(R R )-O, -C(R R )-C(R R )-C(R R )-O, -C(R R )-O-C(R R )-, -C(R R )-О-C(R R )-O, -C(R R )c d a b c d e f a b c d a b c a b c d C(R R )-, -C(R R )-C(R R )-C(R R )-, -C(R )=C(R )-C(R R )-, -C(R R )-N(R )-, -C(R R )-C(R R )с a b с a b a b c d a b c d e f N(R )-, -C(R R )-N(R )-O, -C(R R )-S- і -C(R R )-C(R R )-S-, де R , R , R , R , R і R кожний незалежно вибраний з водню, за бажанням заміщеного на C1-12-алкіл, за бажанням заміщеного на C2-12-алкеніл, за бажанням заміщеного на C2-12-алкініл, гідрокси, C1-12-алкокси, C2-12алкоксіалкіл, C2-12-алкенілокси, карбокси, C1-12-алкоксикарбоніл, C1-12-алкілкарбоніл, форміл, 17 UA 101317 C2 5 10 15 20 арил, арилоксикарбоніл, арилокси, арилкарбоніл, гетероарил, гетероарилоксикарбоніл, гетероарилокси, гетероарилкарбоніл, аміно, моно- і ді(C1-6-алкіл)аміно, карбамоїл, моно- і ді(C1аміно-C1-6-алкіламінокарбоніл, моноі ді(C1-6-алкіл)аміно-C1-66-алкіл)амінокарбоніл, алкіламінокарбоніл, C1-6-алкілкарбоніламіно, карбамідо, C1-6-алканоїлокси, сульфоно, C1-6алкілсульфонілокси, нітро, азидо, сульфаніл, C1-6-алкілтіо, галоген, ДНК інтеркалятори, фотохімічно активні групи, термохімічно активні групи, хелатуючі групи, "репортерні" групи й ліганди, де арил і гетероарил можуть бути за бажанням заміщені, й де два гемінальних a b замісники R і R разом можуть означати за бажанням заміщений метилен (=CH2), 4* 2* В іншому втіленні R і R разом означають бірадикал, вибраний з -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-NH-, CH2-N(CH3)-, -CH2-CH2-O-, -CH2-CH(CH3)-, -CH2-CH2-S-, -CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2CH2-O-, -CH2-CH2-CH(CH3)-, -CH=CH-CH2-, -CH2-O-CH2-O-, -CH2-NH-O-, -CH2-N(CH3)-O-, -CH2-OCH2-, -CH(CH3)-O-, -CH(CH2-O-CH3)-O-. Для всіх хіральних центрів асиметричні групи можуть бути виявлені або в R- або в Sорієнтації. Переважно LNA, використовуваний в олігомері винаходу, включає в себе щонайменше одну молекулу LNA відповідно до будь-якої з формул: , , H де Y являє собою -O-, -О-CH2-, -S-, -NH- або N(R ); Z і Z* незалежно вибрані з міжнуклеотидного зв'язку, кінцевої групи або захисної групи; B являє собою частину молекули, H що відповідає нуклеотидній основі що зустрічається або не зустрічається в природі, і R вибраний з водню й C1-4-алкілу. Особливо переважні молекули LNA показані на схемі 2. Схема 2 25 30 Термін "тіо-LNA" включає в себе закриту нуклеїнову основу (LNA), в якій Y у загальній формулі, представленій вище, вибраний з S або -CH2-S-. Тіо-LNA може бути представлений як у бета-D-, так і в альфа-L-конфігурації. Термін "аміно-LNA" включає в себе закриті нуклеїнові основи (LNA), в яких Y у загальній формулі, представленій вище, вибраний з -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)- і -CH2-N(R)-, де R вибраний з 18 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 водню й C1-4-алкілу. Аміно-LNA може бути представлений як у бета-D-, так і в альфа-Lконфігурації. Термін "окси-LNA" включає в себе закриту нуклеїнову основу (LNA), в якій Y у загальній формулі, представленій вище, являє собою -O- або -CH2-O-. Окси-LNA може бути представлений як у бета-D-, так і в альфа-L-конфігурації. Термін "ENA" включає в себе закриту нуклеїнову основу (LNA), в якій Y у загальній формулі, представленій вище, являє собою -CH2-O- (де атом кисню -CH2-O- приєднується в 2'-положенні відносно основи B). У переважному втіленні LNA вибраний з бета-D-окси-LNA, альфа-L-окси-LNA, бета-D-аміноLNA і бета-D-тіо-LNA, особливо бета-D-окси-LNA. У контексті даного опису термін "C1-4-алкіл" означає лінійний або розгалужений насичений вуглеводний ланцюг, де ланцюг містить від одного до чотирьох атомів вуглецю, наприклад, метил, етил, n-пропіл, ізопропіл, n-бутил, ізобутил, сек-бутил і трет-бутил. Розпізнавання РНКазою H Очевидно, що олігомерна сполука може діяти через неопосередковувану РНКазою деградацію мішені мРНК, наприклад, шляхом стеричного блокування трансляції, або іншими способами, однак, переважні олігомери винаходу здатні розпізнаватися ендорибонуклеазами (РНКазами), наприклад, РНКазою H. У різних втіленнях зазначений олігомер або безперервна послідовність нуклеїнових основ включає в себе ділянку щонайменше з 6, наприклад, щонайменше з 7 послідовних нуклеотидів або молекул нуклеїнових основ, наприклад, щонайменше з 8 або щонайменше з 9 послідовних молекул нуклеїнових основ (залишків), включаючи 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 або 16 послідовних нуклеотидів або нуклеїнових основ, яка при формуванні дуплекса з комплементарною мішенню РНК здатна розпізнаватися РНКазою. Безперервна послідовність, здатна розпізнаватися РНКазою, може являти собою ділянку B, що згадується в контексті гепмеру, що описаний у даному документі. У різних втіленнях розмір безперервної послідовності, що здатна до розпізнаватися РНКазою, наприклад, ділянки B, може бути більше, наприклад, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 молекул нуклеїнових основ. Європейська патентна заявка EP 1222309 надає методи визначення активності РНКзи H in vitro, які можуть бути застосовані для визначення здатності розпізнаватися РНКазою H. Олігомер вважають здатним розпізнаватися РНКазою H, якщо при наявності комплементарної РНК-мішені початкова швидкість РНКази H, виміряна в пмоль/л/хв., становить щонайменше 1%, наприклад, щонайменше 5%, наприклад, щонайменше 10% або менше ніж 20%, від швидкості, що визначається із застосуванням еквівалентного тільки ДНК-олігонуклеотиду, який не має замін в 2'-положенні, з фосфоротіоатними з'єднувальними групами між всіма нуклеотидами в олігонуклеотиді, із застосуванням методології, наданої в прикладах 91-95 в EP 1222309. У різних втіленнях олігомер вважають по суті нездатним до розпізнавання РНКазою H, якщо при наявності комплементарної мішені РНК, початкова швидкість РНКази H, виміряна в пмоль/л/хв., становить менше 1%, наприклад, менше 5%, наприклад, менше 10% або менше 20% від швидкості, що визначається із застосуванням еквівалентного тільки ДНКолігонуклеотиду, який не має замін в 2'-положенні, з фосфоротіоатними з'єднувальними групами між всіма нуклеотидами в олігонуклеотиді, із застосуванням методології, наданої в прикладах 91-95 в EP 1222309. В інших втіленнях олігомер вважають здатним розпізнаватися РНКазою H, якщо при наявності комплементарної мішені РНК і РНКази H, початкова швидкість РНКази H, виміряна в пмоль/л/хв., становить щонайменше 20%, наприклад, щонайменше 40%, наприклад, щонайменше 60%, наприклад, щонайменше 80% від початкової швидкості, що визначається з еквівалентним тільки ДНК-олігонуклеотидом (тобто який має таку ж послідовність основ, але містить тільки молекули ДНК), без замін в 2'-положенні, з фосфоротіоатними з'єднувальними групами між всіма нуклеотидами в олігонуклеотиді, із застосуванням методології, наданої в прикладах 91-95 в EP 1222309. Звичайно ділянка олігомеру, яка утворює безперервну послідовність нуклеїнових основ, при утворенні дуплекса з комплементарною мішенню РНК, здатна розпізнаватися РНКазою, складається з нуклеотидних молекул, які утворюють ДНК/ РНК-подібний дуплекс із мішенню РНК, і можуть включати в себе молекули ДНК і молекули LNA, які знаходяться в альфа-Lконфігурації, особливо переважною є альфа-L-окси-LNA. Олігомер винаходу може включати в себе послідовність нуклеїнових основ, що містить нуклеотиди й нуклеотидні аналоги, і може бути у формі гепмеру (a gapmer), хедмеру (a headmer) або міксмеру (a mixmer). 19 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Хедмером називають безперервну послідовність аналогів нуклеотидів на 5'-кінці, які не розпізнаються РНКазою, за якими у напрямку до 3'-кінця іде безперервна послідовність молекул ДНК або модифікованих нуклеотидів (аналогів), що розпізнаються і розщеплюються РНКазою (наприклад, щонайменше 7 таких нуклеотидів), і тейлмером називають безперервну послідовність ДНК або модифікованих нуклеотидів (аналогів), що розпізнаються і розщеплюються РНКазою на 5'-кінці (наприклад, щонайменше 7 таких нуклеотидів), за якими іде в напрямку до 3'-кінця безперервна послідовність нуклеотидних аналогів, що не розпізнаються РНКазою. Інші "химерні" олігомери, називані у винаході "міксмерами", складаються зі сполучення почергових i) ДНК або модифікованих нуклеотидів, що розпізнаються і розщеплюються РНКазою, і ii) аналогів нуклеотидів, що не розпізнаються РНКазою. Крім того, деякі аналоги нуклеотидів можуть опосередковувати зв'язування й розщеплення РНКази, такої як РНКаза H. Оскільки активність РНКази викликається певною ділянкою α-L-LNA, для конструкції гепмеру можуть знадобитися невеликі ділянки (наприклад, гепи - або ділянка B) ДНК або модифікованих нуклеотидів, що розпізнаються і розщеплюються РНКазою, і в конструкцію міксмеру може бути внесена більша гнучкість. Структура гепмеру Переважно, олігомер винаходу являє собою гепмер. Гепмерний олігомер являє собою олігомер, що включає в себе безперервну ділянку нуклеотидів або нуклеїнових основ, розпізнавану РНКазою, наприклад РНКазою H, наприклад, ділянку щонайменше з 6 або 7 ДНКнуклеотидів, називану в описі ділянка B, де ділянка B фланкована по 5'- і 3'-кінцях ділянками нуклеотидних аналогів, наприклад, нуклеотидних аналогів, що підсилюють афінність, наприклад, 1-6 нуклеотидних аналогів по 5'- і 3'-кінцях безперервноїділянки нуклеотидів, яка розпізнається РНКазою, зазначені ділянки позначають як ділянки A і C, відповідно. Переважно гепмер включає в себе (полі)нуклеотидну послідовність формули (від 5' до 3'), AB-C, або за бажанням A-B-C-D або D-A-B-C, де ділянка A (5'-ділянка) складається з або включає в себе щонайменше один нуклеотидний аналог, наприклад, щонайменше одну молекулу LNA, наприклад, 1-6 нуклеотидних аналогів, наприклад, молекул LNA; і ділянка B складається з або включає у себе щонайменше п'ять послідовних нуклеотидів або нуклеїнових основ, здатних розпізнаватися РНКазою (при утворенні дуплекса з комплементарною молекулою РНК, наприклад, мРНК-мішень), наприклад, ДНК-нуклеотиди; і ділянка C (3'-ділянка) складається з або включає в себе щонайменше один нуклеотидний аналог, наприклад, щонайменше одну молекулу LNA, наприклад, 1-6 нуклеотидних аналогів, наприклад, молекул LNA; і ділянка D, якщо представлена, складається з або включає в себе 1, 2 або 3 нуклеотидних молекули, наприклад, ДНК-нуклеотиди. У різних втіленнях ділянка A складається з 1, 2, 3, 4, 5 або 6 нуклеотидних аналогів, наприклад, молекул LNA, наприклад, 2-5 нуклеотидних аналогів, наприклад, 2-5 молекул LNA, наприклад, 3 або 4 нуклеотидних аналогів, наприклад, 3 або 4 молекули LNA; і/або ділянка C складається з 1, 2, 3, 4, 5 або 6 нуклеотидних аналогів, наприклад, молекул LNA, наприклад, 2-5 нуклеотидних аналогів, наприклад, 2-5 молекул LNA, наприклад, 3 або 4 нуклеотидних аналогів, наприклад, 3 або 4 молекули LNA. У різних втіленнях B складається з або включає в себе 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12 послідовних нуклеотидів або нуклеїнових основ, які здатні розпізнаватися РНКазою, або 6-10, або 7-9, наприклад, 8 послідовних нуклеотидів або нуклеїнових основ, які здатні розпізнаватися РНКазою. У різних втіленнях ділянка B складається з або включає в себе щонайменше одну молекулу ДНК-нуклеотиду, наприклад, 1-12 молекул ДНК, переважно 4-12 молекул ДНК, більш переважно 6-10 молекул ДНК, наприклад, 7-10 молекул ДНК, найбільш переважно 8, 9 або 10 молекул ДНК. У різних втіленнях ділянка A складається з 3 або 4 нуклеотидних аналогів, наприклад, LNA, ділянка B складається з 7, 8, 9 або 10 молекул ДНК, і ділянка C складається з 3 або 4 нуклеотидних аналогів, наприклад, LNA. Такі структури включають в себе (A-B-C) 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3 і далі можуть включати в себе ділянку D, що може мати одну або 2 нуклеотидних молекули, наприклад, молекули ДНК. Інші структури гепмеру розкриті в WO 2004/046160 і вони включені в опис за допомогою посилання. Попередня заявка США 60/977409, включена в опис за допомогою посилання, стосується "коротких" гепмерних олігомерів, які в різних втіленнях можуть бути гепмерним олігомером згідно із даним винаходом. У різних втіленнях олігомер складається з безперервної послідовності нуклеїнових основ загальною довжиною 10, 11, 12, 13 або 14 молекул нуклеїнових основ, де безперервна послідовність нуклеїнових основ являє собою за формулою (5'-3'), A-B-C, або за бажанням A-BC-D або D-A-B-C; де A складається з 1, 2 або 3 молекул нуклеотидних аналогів, наприклад 20 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекул LNA; B складається з 7, 8 або 9 безперервних молекул нуклеотидів або нуклеїнових основ, які здатні до розпізнавання РНКазою при утворенні дуплекса з комплементарною молекулою РНК (наприклад, мішень мРНК); і C складається з 1, 2 або 3 молекул нуклеотидних аналогів, наприклад, молекул LNA. Якщо представлено, ділянка D складається з однієї молекули ДНК. У різних втіленнях A складається з 1 молекули LNA. У різних втіленнях A складається з 2 молекул LNA. У різних втіленнях A складається з 3 молекул LNA. У різних втіленнях C складається з 1 молекули LNA. У різних втіленнях C складається з 2 молекул LNA. У різних втіленнях C складається з 3 молекул LNA. У різних втіленнях B складається з 7 нуклеотидних молекул. У різних втіленнях B складається з 8 нуклеотидних молекул. У різних втіленнях B складається з 9 нуклеотидних молекул. У різних втіленнях ділянка B включає в себе 1-9 молекул ДНК, наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 молекул ДНК. У різних втіленнях ділянка B складається з молекул ДНК. У різних втіленнях ділянка B включає в себе щонайменше одну молекулу LNA, що має альфа-L-конфігурацію, наприклад 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або 9 молекул LNA в альфа-L-конфігурації. У різних втіленнях B включає в себе щонайменше одну молекулу альфаL-окси-LNA або де всі молекули LNA в альфа-L-конфігурації являють собою альфа-L-окси-LNAмолекули. У різних втіленнях число нуклеотидів, представлених в A-B-C, вибирають із групи, що складається з (молекули нуклеотидних аналогів - ділянка B - молекули нуклеотидних аналогів): 1-8-1, 1-8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4, або 1-9-l, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 4-9-1, 1-9-4, або 1-10-1, 1-10-2, 2-10-1, 2-10-2, 1-10-3, 3-10-1. У різних втіленнях число нуклеотидів в A-B-C вибране із групи, що складається з: 2-7-1, 1-7-2, 2-7-2, 3-73, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4 і 4-7-3. У різних втіленнях ділянки A і C складаються із двох молекул LNA кожна, і ділянка B складається з 8 або 9 нуклеотидних молекул, переважно молекул ДНК. Інші структури гепмерів включають в себе структури, де ділянка A і/або C складається з 3, 4, 5 або 6 нуклеотидних аналогів, наприклад, нуклеотидних аналогів, вибраних із групи, що складається з 2'-O-метоксіетил-РНК (2'-MOE) і 2'-фтор-ДНК мономерів, і ділянка B складається з 8, 9, 10, 11 або 12 нуклеотидів, наприклад молекул ДНК (або нуклеїнових основ), наприклад, 510-5 і 4-12-4 гепмерні структури. Інші структури гепмерів розкриті в міжнародному патенті WO 2007/146511A2, що включений в опис за допомогою посилання. З'єднувальні групи Терміни "з'єднувальна група" або "міжнуклеотидний зв'язок" означають групу, здатну ковалентно з'єднати разом два нуклеотиди або нуклеїнових основи, два нуклеотидних аналоги, і нуклеотид і нуклеотидний аналог і т. д. Специфічні й переважні приклади включають в себе фосфатні групи й фосфоротіоатні групи. Нуклеїнові основи олігомеру винаходу або його безперервна послідовність нуклеїнових основ з'єднані за допомогою з'єднувальних груп. Відповідно, кожна нуклеїнова основа з'єднується із сусідньою 3'-нуклеїновою основою через з'єднувальну групу. Відповідні з'єднувальні групи включають в себе групи, які перераховані в міжнародному патенті WO 2007/031091, наприклад, з'єднувальні групи, перераховані в першому параграфі на сторінці 34 міжнародного патенту WO 2007/031091 (який включений в опис за допомогою посилання). У різних втіленнях переважно замінити звичайну фосфодіефірну зв’язувальну групу на групу, більш стійку до нуклеазної атаки, наприклад, на фосфоротіоатну або боранофосфатну групи, зазначені два зв'язки розщеплюються РНКазою H і також забезпечують зазначений шлях антисмислового інгібування для зменшення експресії гена-мішені. Відповідні сірковмісні з'єднувальні групи (S), що містять групи зв'язування, надавані в даному документі, можуть бути переважними. Фосфоротіоатні з'єднувальні групи також є переважними, особливо в гепмерній ділянці (B). Фосфоротіоатні зв'язки також можуть бути застосовані у фланкуючих ділянках (A і C, і для зв'язування A або C з D, і усередині ділянки D у відповідних випадках). Ділянки A, B і C можуть, однак, включати в себе з'єднувальні групи, інші, ніж фосфоротіоат, наприклад, фосфодіефірні з'єднувальні групи, особливо, якщо, наприклад, застосування нуклеотидних аналогів захищає з'єднувальні групи усередині ділянок A і C від ендонуклеазної деградації, наприклад, якщо ділянки A і C містять нуклеотиди LNA. З'єднувальні групи в олігомері можуть являти собою фосфодіефіри, фосфоротіоат або боранофосфат, за умови, що можливе розщеплення РНКазою H РНК-мішені. Фосфоротіоат є переважним через збільшення нуклеазної стійкості й через інші причини, наприклад, простоту одержання. В одному аспекті олігомеру винаходу, нуклеотиди й/або нуклеотидні аналоги з'єднуються один з одним за допомогою фосфоротіоатних груп. 21 UA 101317 C2 5 10 15 20 Варто розуміти, що включення фосфодіефірних зв'язків, наприклад, одного або двох зв'язків, в інший фосфоротіоатний олігомер, особливо між або поруч із молекулами нуклеотидних аналогів (звичайно в ділянку A і/або C), може змінити біодоступність і/або біорозподіл олігомеру, див. WO 2008/053314, включений в опис за допомогою посилання. У деяких втіленнях, наприклад, у втіленнях, згадуваних вище, де це застосовно й спеціально не зазначено, всі інші з'єднувальні групи являють собою або фосфодіефір, або фосфоротіоат, або їх суміш. У деяких втіленнях всі групи міжнуклеотидного зв'язку являють собою фосфоротіоат. При згадуванні специфічних гепмерних олігонуклеотидних послідовностей, наприклад, послідовностей, що надаються в описі, варто розуміти, що в різних втіленнях, якщо зв'язки являють собою фосфоротіоатні зв'язки, можуть бути застосовані альтернативні зв'язки, наприклад, зв'язки, розкриті в описі, наприклад, фосфатні (фосфодіефірні) зв'язки, особливо для зв'язків між нуклеотидними аналогами, наприклад, молекулами LNA. Аналогічно при згадуванні специфічних гепмерних олігонуклеотидних послідовностей, наприклад, послідовностей, що надаються в описі, якщо C-залишки позначені як 5'-метилмодифікований цитозин, в різних втіленнях, один або більше C, представлені в олігомері, можуть являти собою немодифіковані C-залишки. Олігомерні сполуки Олігомери винаходу можуть бути вибрані із групи, що складається з SEQ ID NO: 133-152, які показані в таблиці 2. Таблиця 2 Структури олігомерів SEQ ID NO: 133-152, великі букви означають молекули нуклеотидних аналогів і підрядкова буква "s" означає фосфоротіоатний зв'язок. Малі букви являють собою нуклеотидні (ДНК) молекули. Відсутність "s" (якщо є) означає фосфодіефірний зв'язок. 25 22 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 Кон’югати У даному контексті термін "кон’югат" означає гетерогенну молекулу, утворену шляхом ковалентного з'єднання ("кон'югації") олігомеру, що описаний у даному документі, з одним або більше ненуклеотидами/ненуклеотидними аналогами (тобто ненуклеїнова основа), або неполінуклеотидні молекули. Приклади ненуклеотидних або неполінуклеотидних молекул включають в себе макромолекулярні агенти, наприклад, білки, ланцюги жирних кислот, залишки цукрів, глікопротеїни, полімери або їх комбінації. Звичайно білки можуть являти собою антитіла до білка-мішені. Типові полімери можуть являти собою поліетиленгліколь. Таким чином, у різних втіленнях олігомер винаходу може включати в себе полінуклеотидну ділянку, тобто ділянку з нуклеотидів/нуклеїнових основ, яка звичайно складається з безперервної послідовності нуклеїнових основ, і іншу ненуклеотидну ділянку. При посиланні на олігомер винаходу, що складається з безперервної послідовності нуклеїнових основ, сполука може включати в себе компоненти, що не є нуклеотидами/нуклеїновими основами, наприклад, кон’югатний компонент. У різних втіленнях винаходу олігомерна сполука з'єднана з лігандами/кон’югатами, які можуть бути застосовані, наприклад, для збільшення клітинного захоплення олігомерних сполук. Міжнародний патент WO 2007/031091 надає відповідні ліганди й кон’югати, які включені в опис за допомогою посилання. Винахід також надає кон’югат, що включає в себе сполуку відповідно до винаходу, що описана в даному документі, і щонайменше одну ненуклеотидну або неполінуклеотидну молекулу, ковалентно приєднану до зазначеної сполуки. Таким чином, у різних втіленнях, де сполука винаходу складається із заданої нуклеїнової кислоти або послідовності нуклеїнових основ, що розкрита в описі, сполука також може включати в себе щонайменше одну ненуклеотидну або неполінуклеотидну молекулу (наприклад, яка не містить один або більше нуклеотидів або нуклеотидних аналогів), ковалентно приєднану до зазначеної сполуки. Кон’югати можуть збільшувати активність, клітинний розподіл або клітинне захоплення олігомеру винаходу. Зазначені молекули включають в себе без обмеження антитіла, поліпептиди, молекули ліпідів, наприклад, молекулу холестерину, холеву кислоту, простий тіоефір, наприклад, гексил-s-тритилтіол, тіохолестерин, аліфатичний ланцюг, наприклад, додекантіол або ундецилові залишки, фосфоліпіди, наприклад, дигексадецил-рац-гліцерин або триетиламоній 1,2-ди-o-гексадецил-рац-гліцеро-B-h-фосфонат, поліамін або поліетиленгліколевий ланцюг, адамантаноцтову кислоту, пальмітиловий фрагмент, октадециламін або молекулу гексиламінокарбонілоксихолестерину. Олігомери винаходу також можуть бути кон’юговані з активними лікарськими субстанціями, наприклад, з аспірином, ібупрофеном, сульфамідним препаратом, протидіабетичним, антибактеріальним препаратом або з антибіотиком. 23 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У певних втіленнях кон’югована частина являє собою стирол, наприклад, холестерин. У різних втіленнях кон’югована частина включає в себе або складається з позитивно зарядженого полімеру, наприклад, з позитивно заряджених пептидів довжиною, наприклад, 150, наприклад, 2-20, наприклад, 3-10 амінокислотних залишків і/або поліалкіленоксиду, наприклад, поліетиленгліколю (PEG) або поліпропіленгліколю, див. міжнародний патент WO 2008/034123, що включений в опис за допомогою посилання. Відповідно, позитивно заряджений полімер, наприклад, поліалкіленоксид, може бути приєднаний до олігомеру винаходу через лінкер, наприклад, відокремлюваний лінкер, описаний у міжнародному патенті WO 2008/034123. Активовані олігомери Термін "активований олігомер", застосовуваний в описі, стосується олігомеру винаходу, що ковалентно зв'язаний (тобто функціоналізований) щонайменше з однією функціональною молекулою, яка забезпечує ковалентне зв'язування олігомеру з однією або більше кон’югованими молекулами, тобто молекулами, які не є нуклеїновими кислотами або мономерами, для формування кон’югатів, описуваних у даному документі. Звичайно функціональна молекула включає в себе хімічну групу, яка здатна до ковалентного зв'язування з олігомером, наприклад, через 3'-гідроксильну групу або екзоциклічну NH2-групу аденінової основи, спейсер, що переважно являє собою гідрофільну й термінальну групу, яка здатна до зв'язування з кон’югованою молекулою (наприклад, аміно, сульфгідрильна або гідроксильна група). У деяких втіленнях зазначена термінальна група не захищена й, наприклад, є NH 2групою. В інших втіленнях термінальна група захищена, наприклад, будь-якою придатною захисною групою, наприклад, групами, описаними в "Protective Gpoups in Organic Synthesis" Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999). Приклади придатних гідроксильних захисних груп включають в себе складні ефіри, наприклад, ефір оцтової кислоти, аралкільні групи, наприклад, бензил, дифенілметил або трифенілметил і тетрагідропіраніл. Приклади придатних амінопротективних груп включають в себе бензил, альфа-метилбензил, дифенілметил, трифенілметил, бензилоксикарбоніл, трет-бутоксикарбоніл і ацильні групи, наприклад, трихлорацетил або трифторацетил. У деяких втіленнях функціональна молекула є саморуйновною. В інших втіленнях функціональна молекула є біодеградовною. Див., наприклад, патент США № 7087229, що у всій повноті включений за допомогою посилання в даний опис. У деяких втіленнях олігомери винаходу функціоналізовані по 5'-кінцю, щоб зробити можливим ковалентне приєднання кон’югованої молекули до 5'-кінця олігомеру. В інших втіленнях олігомери винаходу можуть бути функціоналізовані по 3'-кінцю. В інших втіленнях олігомери винаходу можуть бути функціоналізовані по скелету молекули або по гетероциклічній основі молекули. В інших втіленнях олігомери винаходу можуть бути функціоналізовані по більше ніж одному положенню, незалежно вибраному з 5'-кінця, 3'-кінці, скелета молекули й основи. У деяких втіленнях активовані олігомери винаходу синтезують шляхом введення до складу під час синтезу одного або більше мономерів, які ковалентно приєднують до функціональної молекули. В інших втіленнях активовані олігомери винаходу синтезують із мономерами, які не були функціоналізовані, і олігомер функціоналізують після завершення синтезу. У деяких втіленнях олігомери функціоналізують зв'язаним складним ефіром, що містить аміноалкільний лінкер, де алкільна частина має формулу (CH2)w, де w являє собою ціле число в межах від 1 до 10, переважно 6, де алкільна частина алкіламіногрупи може бути нерозгалуженим ланцюгом або розгалуженим ланцюгом, і де функціональна група приєднана до олігомеру за допомогою складноефірної групи (-О-C(O)-(CH2)wNH). В інших втіленнях олігомери функціоналізують зв'язаним складним ефіром, що містить (CH2)w-сульфгідрильний (SH) лінкер, де w являє собою ціле число в межах від 1 до 10, переважно 6, де алкільна частина алкіламіногрупи може бути нерозгалуженим ланцюгом або розгалуженим ланцюгом, і де функціональна група приєднана до олігомеру за допомогою складноефірної групи (-О-C(O)-(CH2)wSH). У деяких втіленнях сульфгідрилактивовані олігонуклеотиди кон’югують з полімерними молекулами, наприклад, поліетиленгліколем або пептидами (шляхом утворення дисульфідного зв'язку). Активовані олігомери, що містять зв'язані складні ефіри, які описані вище, можуть бути синтезовані будь-яким способом, відомим у даній галузі техніки, і, зокрема, способами, розкритими в публікації PCT № WO 2008/034122 і прикладах в ній, які у всій повноті включені в даний опис за допомогою посилання. В інших втіленнях олігомери винаходу функціоналізують шляхом введення сульфгідрильної, аміно або гідроксильної групи в олігомер за допомогою функціоналізуючого реагенту, головним 24 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 чином, як описано в патентах США № 4962029 і 4914210, тобто по суті нерозгалужений реагент, що має фосфорамідит на одному кінці, зв'язаний через ланцюжок гідрофільного спейсера із протилежним кінцем, що включає в себе захищену або незахищену сульфгідрильну, аміно або гідроксильну групу. Такі реагенти, насамперед, реагують із гідроксильними групами олігомеру. У деяких втіленнях такі активовані олігомери мають функціоналізуючий реагент, з'єднаний з 5'гідроксильною групою олігомеру. В інших втіленнях активовані олігомери мають функціоналізуючий реагент, з'єднаний з 3'-гідроксильною групою. В інших втіленнях активовані олігомери винаходу мають функціоналізуючий реагент, з'єднаний з гідроксильною групою на скелеті олігомеру. В інших втіленнях олігомер винаходу функціоналізують більше ніж одним з функціоналізуючих реагентів, описаних у патенті США № 4962029 і 4914210, які у всій повноті включені в даний опис за допомогою посилання. Способи синтезування таких функціоналізуючих реагентів і введення їх у мономери й олігомери розкриті в патентах США № 4962029 і 4914210. У деяких втіленнях 5'-кінець олігомеру, зв'язаного на твердій фазі, функціоналізують похідним діенілфосфорамідиту з наступною кон’югацією депротектованого олігомеру, наприклад, з амінокислотою або пептидом за допомогою реакції циклоприєднання ДільсаАльдера. У різних втіленнях включення в олігомер мономерів, що містять модифікації в 2'-положенні цукру, наприклад, 2'-карбаматзаміщений цукор або 2'-(О-пентил-N-фталімідо)дезоксирибоза, сприяє ковалентному приєднанню кон’югованих молекул до цукрів олігомеру. В інших втіленнях олігомер з аміновмісним лінкером в 2'-положенні одного або більше мономерів одержують із застосуванням реагенту, такого як, наприклад, 5'-диметокситритил-2'-O-(eфталімідиламінопентил)-2'-деоксіаденозин-3'-N,N-діізопропілціаноетоксифосфо-рамідит. Див., наприклад, Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171. В інших втіленнях олігомери винаходу можуть мати аміновмісні функціональні молекули в нуклеїновій основі, включаючи аміногрупи, розташовані на N6 пурину, на екзоциклічному N2 гуаніну, або в положеннях N4 або 5 цитозину. В одному втіленні зазначена функціоналізація може бути досягнута шляхом застосування комерційного реагенту, що є вже функціоналізованим при синтезі олігомеру. Деякі функціональні молекули є комерційно доступними, наприклад, гетеробіфункціональні й гомобіфункціональні зв’язувальні молекули доступні в Pierce Co. (Rockford, III). Інші комерційно доступні зв’язувальні групи являють собою реагенти 5'-аміномодифікатор C6 і 3'аміномодифікатор, доступні в Glen Research Corporation (Sterling, Va.). Також 5'аміномодифікатор C6 доступний в ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.) як Амінолінк-2, і також 3'-аміномодифікатор доступний в Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.). Композиції Олігомер винаходу може бути застосований у фармацевтичних формулах і композиціях. Відповідно, такі композиції включають в себе фармацевтично прийнятний розріджувач, носій, сіль або ад’ювант. Міжнародний патент WO 2007/031091 надає придатні й переважні фармацевтично прийнятні розчинники, носії й ад’юванти, які включені в опис за допомогою посилання. Придатні дозування, формули, шляхи введення, композиції, лікарські форми, комбінації з іншими терапевтичними агентами, формулами проліків також представлені в міжнародному патенті WO 2007/031091, що також включений в опис за допомогою посилання. Застосовуваний в описі термін "фармацевтично прийнятні солі" стосується солей, які зберігають бажану біологічну активність установлених у даному описі сполук і проявляють мінімальні небажані токсичні ефекти. Необмежувальні приклади таких солей можуть бути одержані з органічною амінокислотою й солями приєднання основи, утвореними з катіонами металів, наприклад, цинку, кальцію, вісмуту, барію, магнію, алюмінію, міді, кобальту, нікелю, кадмію, натрію, калію й т. п., або з катіоном, одержаним з амонію, N,N-дибензилетилендіаміну, D-глюкозаміну, тетраетиламонію або етилендіаміну; або (c) з комбінаціями (a) і (b); наприклад, сіль танату цинку й т. п. Застосування Олігомери винаходу можуть бути застосовані як дослідницькі реагенти, наприклад, для діагностики, лікування й профілактики. У дослідженні дані олігомери можуть бути застосовані для специфічного інгібування експресії або синтезу білка бета-катеніну (звичайно шляхом деградації або інгібування мРНК і попередження тим самим утворення білка) у клітинах і у експериментальних тварин, тим самим полегшуючи функціональний аналіз мішені або оцінки застосовності як мішені для терапевтичного впливу. 25 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У діагностиці олігомери можуть бути застосовані для виявлення й кількісного аналізу експресії бета-катеніну в клітинах і тканинах за допомогою нозерн-блотингу, гібридизації in situ або подібних методів. У лікуванні тварини або людини, які передбачувано мають захворювання або порушення, які можна лікувати шляхом модуляції експресії бета-катеніну, тварину або людину лікують введенням олігомерних сполук, наприклад, ефективної кількості олігомеру (або його кон’югата) згідно з даним винаходом. Далі надані способи лікування ссавця, наприклад, лікування людини, яка передбачувано має або піддана захворюванню або стану, асоційованому з експресією бетакатеніну, шляхом введення терапевтично або профілактично ефективної кількості одного або більше олігомерів або композицій винаходу. Винахід також забезпечує застосування сполук або кон’югата винаходу, які описані, в одержанні медикаменту для лікування порушення, згадуваного в описі, або в способі лікування порушення, згадуваного в описі. Винахід також стосується олігомеру, композиції або кон’югата, які описані в даному документі, для застосування як медикаменту. Відповідно, при посиланні на способи винаходу, введення олігомеру або кон’югата винаходу виконують шляхом введення ефективної кількості олігомеру або кон’югата, наприклад, кількості, яка є ефективною для забезпечення лікування, або кількості, яка є ефективною для інгібування або пригнічення експресії бета-катеніну в клітині або в клітинах. Винахід також надає спосіб лікування порушення, як описано в даному документі, зазначений спосіб включає в себе введення сполуки відповідно до винаходу, як описано в даному документі, і/або кон’югата відповідно до винаходу, і/або фармацевтичної композиції відповідно до винаходу пацієнту, який цього потребує. У різних втіленнях олігомер або його кон’югат викликає бажаний терапевтичний ефект у людини, наприклад, шляхом утворення водневого зв'язку з нуклеїновою кислотою-мішенню. Олігомер або його кон’югат викликає зниження (інгібування) експресії мішені шляхом утворення водневого зв'язку (гібридизації) з мРНК мішені, викликаючи тим самим зменшення експресії гена. Також передбачається, що олігомерні сполуки й кон’югати, розкриті в описі, можуть мати нетерапевтичні застосування, наприклад, діагностичні застосування. Медичні показання Порушення, згадуване в описі, вибирають у різних втіленнях із групи, що складається з гіперпроліферативного захворювання, такого як рак, вибраний із групи, що складається з колоректального раку, гепатоцелюлярного раку, раку ендометрія, злоякісної меланоми, раку яєчників, раку підшлункової залози, раку гіпофіза, раку стравоходу, раку легень, раку молочної залози, раку нирок, раку гематопоетичної системи, раку шийки матки, раку ЦНС, раку кісток, раку жовчовивідних шляхів і раку надниркових залоз. У різних втіленнях порушення, згадуване в описі, являє собою рак, вибраний із групи, що складається з колоректального раку, гепатоцелюлярного раку, раку ендометрія й злоякісної меланоми. У різних втіленнях порушення, згадуване в описі, являє собою рак, вибраний із групи, що складається з раку печінки й раку нирок. Олігомери й інші композиції відповідно до винаходу можуть бути застосовані для лікування станів, асоційованих з підвищеною експресією або експресією видозміненої версії бетакатеніну. Винахід далі забезпечує застосування сполуки винаходу в одержанні або у виробництві медикаменту для лікування захворювання, порушення або стану, згадуваного в описі. Винахід далі стосується застосування сполуки, композиції або кон’югата, як визначено в описі, для виробництва медикаменту для лікування аномальних рівнів бета-катеніну або експресії мутантних форм бета-катеніну (наприклад, алельні варіанти, такі як варіанти, асоційовані з одним із захворювань, згадуваних в описі). Один аспект винаходу спрямований на спосіб лікування ссавця, що має або підданий станам, асоційованим з аномальними рівнями бета-катеніну, який включає в себе введення ссавцеві терапевтично ефективної кількості олігомеру, що має своєю мішенню бета-катенін, наприклад, олігомеру, що включає в себе одну або більше молекул LNA. Тому способи винаходу можуть бути застосовані для лікування або профілактики захворювань, викликаних аномальними рівнями бета-катеніну. Альтернативно затверджується, що, крім того, у різних втіленнях винахід спрямований на спосіб лікування аномальних рівнів бета-катеніну, зазначений спосіб, включає в себе введення олігомеру винаходу або кон’югата винаходу, або фармацевтичної композиції винаходу пацієнту, який цього потребує. Захворювання або порушення, згадуване в описі, може бути асоційоване в різних втіленнях з мутацією гена бета-катеніну або гена, білковий продукт якого асоційований або взаємодіє з 26 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 бета-катеніном. Отже, у різних втіленнях мРНК-мішень являє собою мутовану форму послідовності бета-катеніну. Аспект винаходу, що викликає інтерес, спрямований на застосування описуваного олігомеру (сполуки) або описуваного кон’югата для приготування медикаменту для лікування захворювання, порушення або стану, згадуваного в описі. Винахід також стосується олігомеру, композиції або кон’югата, які згадуються в описі, для застосування як медикаменту. Крім того, винахід стосується способу лікування суб'єкта, що має захворювання або стан, наприклад, захворювання або стан, згадувані в описі, зазначений спосіб включає в себе введення сполуки, відповідно до винаходу, як описано в даному документі, і/або кон’югата відповідно до винаходу, й/або фармацевтичної композиції відповідно до винаходу пацієнту, який цього потребує. Відповідні дозування, рецептури, шляхи введення, композиції, лікарські форми, комбінації з іншими терапевтичними агентами рецептури проліків також представлені в міжнародному патенті WO 2007/031091, що включений у даний опис за допомогою посилання. Винахід також надає фармацевтичну композицію, яка включає в себе сполуку або кон’югат, як описано в даному документі, або кон’югат і фармацевтично прийнятний розріджувач, носій або ад’ювант. Міжнародний патент WO 2007/031091 надає придатний і переважний фармацевтично прийнятні розріджувач, носій і ад’юванти, які включені в опис за допомогою посилання. Способи винаходу переважно застосовують для лікування або профілактики захворювань, викликаних аномальними рівнями бета-катеніну. Далі описуваний в даному документі винахід охоплює спосіб попередження або лікування захворювання, який включає в себе введення терапевтично ефективної кількості олігомеру, що модулює бета-катенін, людині, яка має потребу в зазначеному лікуванні. Винахід далі охоплює застосування короткого періоду введення олігонуклеотидної сполуки (олігомеру або кон’югата), що модулює бета-катенін. Альтернативно затверджується, що, крім того, у різних втіленнях винахід спрямований на спосіб лікування аномальних рівнів бета-катеніну, зазначений спосіб включає в себе введення олігомеру винаходу або кон’югата винаходу, або фармацевтичної композиції винаходу пацієнту, який цього потребує, і далі включає в себе введення наступного агента або наступного активного інгредієнта. Зазначене наступне введення може бути таким, що наступний агент або наступний активний інгредієнт кон’югований із сполукою винаходу, представлений у фармацевтичній композиції або введений в окремій рецептурі. Винахід також стосується олігомеру, композиції або кон’югата, які визначені в описі, для застосування як медикаменту. Винахід далі стосується застосування сполуки, композиції або кон’югата, які визначені в описі, для виробництва медикаменту для лікування аномальних рівнів бета-катеніну або експресії мутантних форм бета-катеніну (наприклад, алельних варіантів, таких як алельні варіанти, асоційовані з одним із захворювань, згаданих в описі). Крім того, винахід стосується способу лікування суб'єкта, який має захворювання або стан, такі як захворювання або стан, згадані в описі. Пацієнт, який має потребу в лікуванні, являє собою пацієнта, що має або можливо має захворювання або порушення. У різних втіленнях термін "лікування", використовуваний в описі, стосується лікування існуючого захворювання (наприклад, захворювання або порушення, які згадуються в описі) або попередження захворювання, тобто профілактики. Тому варто розуміти, що лікування, яке згадується в описі, у різних втіленнях може бути профілактичним. Захворювання або порушення, згадуване в описі, у різних втіленнях може бути асоційоване з мутацією в гені бета-катеніну або в гені, білковий продукт якого асоційований з бетакатеніном, наприклад, ген APC. Отже, у різних втіленнях мРНК-мішень являє собою видозмінену форму послідовності бета-катеніну, наприклад, вона може включати в себе одну або більше точкових мутацій, наприклад, SNP, асоційованих з раком. Приклади таких захворювань, де мутації в гені бета-катеніну або в гені APC приводять до аномальних рівнів активності бета-катеніну, включають в себе: (1) колоректальний рак, APC і бета-катенін, обидва мутовані більше ніж в 70% всіх випадків (Powell et al., Nature, 1992; Morin et al., Science, 1997; Sparks et al., Cancer Res, 1998); (2) гепатоцелюлярний рак, бета-катенін мутований більше ніж в 25% випадків (de La Coste A, PNAS, 1998); (3) рак ендометрія, бетакатенін мутований >10% випадків; і (4) злоякісна меланома, бета-катенін мутований >10% випадків (Rubinfeld et al., Science, 1997). 27 UA 101317 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Інші приклади зазначених захворювань включають в себе рак яєчників, підшлункової залози, гіпофіза, стравоходу, легенів, молочної залози, нирок, гематопоетичної системи, шийки матки, ЦНС, кісток, жовчних шляхів і надниркових залоз. Було показано, що мутації гена бета-катеніну або гена APC асоційовані із зазначеними захворюваннями (каталог соматичних мутацій при раку доступний на Веб-сторінці Інституту Сандера (Великобританія) http://www.sanger.ac.uk/). Згадуваний відповідно до винаходу рак може бути вибраний зі згаданих вище форм раку. Інші втілення Наступні втілення також стосуються опису й короткого викладу винаходу йможуть бути поєднані із втіленнями винаходу, згадуваними в описі, включаючи втілення, згадувані у формулі винаходу. 1. Антисмисловий олігонуклеотид (наприклад, олігомер) здатний до зв'язування з послідовністю-мішенню гена бета-катеніну SEQ ID NO: 173 або його алелями й до пригнічення експресії бета-катеніну, зазначений олігонуклеотид включає в себе послідовність із 10-50 нуклеїнових основ, яка відповідає послідовності-мішені. 2. Антисмисловий олігонуклеотид втілення 1, де послідовність-мішень вибрана з ділянок гена бета-катеніну, показаних в SEQ ID NO: 1-132, або їх алельних варіантів. 3. Олігонуклеотид втілення 1 або втілення 2, який включає в себе послідовність із 10-16 нуклеїнових основ, показаних в SEQ ID NO: 1, 16, 17, 18, 33, 34, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 73, 88, 103, і 118, або їх алельних варіантів. 4. Олігонуклеотид за будь-яким із втілень 1-3, який включає в себе послідовності, показані як SEQ ID NO: 1-132. 5. Олігонуклеотид будь-якого з попередніх втілень, показаний за допомогою SEQ ID NO: 133-172. 6. Олігонуклеотид за будь-яким з попередніх втілень, де зазначена послідовність нуклеїнових основ включає в себе міжнуклеотидні зв'язки, незалежно вибрані з фосфодіефірного, фосфоротіоатного і боранфосфатного зв'язку. 7. Олігонуклеотид за будь-яким з попередніх втілень, де щонайменше дві із зазначених нуклеїнових основ являють собою нуклеотидні аналоги. 8. Олігонуклеотид за втіленням 5, де зазначена послідовність нуклеїнових основ включає в себе в 5'-3'-напрямку (i) ділянку A: фрагмент із 2-4 нуклеотидних аналогів, за якою іде (ii) ділянка B: фрагмент із 6-11 нуклеотидів або нуклеотидних аналогів, що відрізняються від нуклеотидних аналогів ділянки A, за якою іде (iii) ділянка C: фрагмент із 2-4 нуклеотидних аналогів, і за якою іде за бажанням (iv) ділянка D: один або два нуклеотиди. 9. Олігонуклеотид за втіленням 8, де ділянка A включає в себе щонайменше один фосфодіефірний зв'язок між двома молекулами нуклеотидних аналогів і/або молекулою нуклеотидного аналога й молекулою нуклеїнової основи ділянки B. 10. Олігонуклеотид за втіленням 8 або втіленням 9, де ділянка C включає в себе щонайменше один фосфодіефірний зв'язок між двома молекулами нуклеотидних аналогів і/або молекулою нуклеотидного аналога й молекулою нуклеїнової основи ділянки B. 11. Олігонуклеотид за будь-яким із втілень 1-6, де всі міжнуклеотидні зв'язки є фосфоротіоатними. 12. Олігонуклеотид за будь-яким із втілень 7-11, де зазначені молекули нуклеотидних аналогів незалежно вибрані з 2'-O-алкіл-РНК, 2'-аміно-ДНК, 2'-фтор-ДНК, закритої нуклеїнової кислоти (LNA), арабінонуклеїнової кислоти (ANA), 2'-фтор-ANA, HNA, INA і 2'-MOE. 13. Олігонуклеотид за втіленням 12, де нуклеотидні аналоги незалежно вибрані з 2'-MOEРНК, 2'-фтор-ДНК і LNA. 14. Олігонуклеотид за втіленням 13, де щонайменше один із зазначених нуклеотидних аналогів являє собою закриту нуклеїнову кислоту (LNA). 15. Олігонуклеотид за втіленням 14, де всі нуклеотидні аналоги являють собою LNA. 16. Олігонуклеотид за будь-яким із втілень 12-15, де LNA вибрана з бета-D-окси-LNA, альфа-L-окси-LNA, бета-D-аміно-LNA і бета-D-тіо-LNA. 17. Кон’югат, який включає в себе олігонуклеотид будь-якого з попередніх втілень і щонайменше одну ненуклеотидну або неполінуклеотидну молекулу, ковалентно з'єднану із зазначеним олігонуклеотидом. 18. Кон’югат за втіленням 17, де зазначена ненуклеотидна або неполінуклеотидна молекула складається з або включає в себе стеринову групу, наприклад холестерин. 19. Фармацевтична композиція, яка включає в себе олігонуклеотид за будь-яким із втілень 116 або кон’югат за втіленням 17 або за втіленням 18 і фармацевтично прийнятний дилюент, носій або ад’ювант. 28