Спосіб одержання регулятора росту рослин

Спосіб одержання регулятора росту рослин, який включає культивування штаму Myceha steriha 1MB F-100005 на рідкому поживному середовищі, який відрізняється тим, що культивування проводять при температурі 22-28°С впродовж 30-60 діб, після чого біомасу грибів ВІДДІЛЯЮТЬ ВІД культуральної рідини шляхом фільтрації або центрифугування, після чого до фільтрату або фугату додають етиловий спирт в об'ємному співвідношенні культуральна рідина - етиловий спирт 3 1-1,3 і отримують цільовий продукт Винахід відноситься до біотехнологм і сільськогосподарської мікробіологи, а саме, до способу одержання регулятора росту рослин для широкого кола сільськогосподарських культур Застосування регуляторів росту рослин надає можливість спрямованої дії на рослини з метою прискорення їх розвитку, підвищення продуктивності, СТІЙКОСТІ до несприятливих факторів та стресів В останні роки у світовому землеробстві пріоритет надається низькотоксичним регуляторам росту рослин природного походження Серед них значне місце займають біопрепарати, отримані шляхом мікробіологічного синтезу Продукти метаболізму мікроорганізмів-продуцентів містять широкий спектр біологічно активних речовин, які складно або практично неможливо отримати ХІМІЧНИМ синтезом Відомо декілька регуляторів росту рослин мікробіологічного походження Це препарати Агат-25, Бюенерпя, Емістим, Симбіонт, Фузикокцин [Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, Москва, 1999г, Пат РФ №2130261, №2100932] Але, незважаючи на високу фізіологічну активність і широкий спектр дії, зазначені препарати не отримали широкого розповсюдження через складність і високу вартість технологій їх виробництва ВІДОМІ [АВТ СВ СРСР №№ 14223550, 1555320, 16982242, 1699990, 1712348, Пат США №4818530, №4718931] способи отримання біопрепаратів з властивостями регуляторів росту ро слин шляхом культивування мікроміцетів грибів з подальшим суспендуванням їх біомаси у фізіологічному розчині або воді Але такі препарати, отримані з монокультури, як правило, регулюють ріст і розвиток лише однієї культури ВІДОМІ способи [Японія з №62-20163, з №1-79101, РСТ №87/06796, Краснопольський Л М , Горбатюк М С та ш "Бютехнолопя - 1993 Т Ю - С 18-21, Пат України №17558А], в яких після культивування мікроорганізмів-продуцентів для виділення окремих метаболітів з біологічною активністю використовуються методи адсорбції, фракціонування, екстракції, кристалізації із застосуванням різноманітних розчинників і сорбентів Недоліками цих методів є складність виділення цільових продуктів та їх низький вихід внаслідок втрат при багаторазових операціях виділення та очищення Найближчим аналогом (прототипом) до запропонованого винаходу є спосіб отримання регулятора росту рослин [пат України №17482А] шляхом культивування штаму гриба Myceha steriha Продукти метаболізму гриба адсорбуються з культурального середовища активованим вугіллям, а потім екстрагуються з нього 70% етиловим спиртом Недоліком цього способу є високі витрати і низький вихід цільового продукту Проведеними нами дослідженнями встановлено, що значна частина біологічно активних продуктів метаболізму не адсорбується активованим вугіллям, а залишається в культуральному середовищі, яке в подальшо О (О 61190 му не використовується В основу винаходу поставлене завдання створити спосіб одержання регулятора росту рослин, в якому за рахунок культивування мікроскопічного гриба в оптимальних для нього умовах забезпечується отримання на основі продуктів метаболізму біопрепарату з високою фізіологічною активністю і широким спектром дії, недорогого і зручного при використанні Поставлене завдання досягається тим, що культивують штам мікроскопічного гриба Мусеїіа stenha 1MB F-100005 на рідкому поживному середовищі в умовах обмеженої аерації при температурі 22-28°С протягом 30-60 діб, після чого біомасу гриба ВІДДІЛЯЮТЬ від культурального середовища шляхом фільтрування або центрифугування, до фільтрату або фугату додають етиловий спирт в об'ємному співвідношенні культуральна рідина етиловий спирт 3 1-1,3 і отримують регулятор росту рослин у вигляді розчину продуктів метаболізму гриба Myceha stenha в 25-30% спирті При цьому усі продукти метаболізму гриба-продуцента потрапляють у цільовий продукт, в той час, як у прототипі після завершення циклу культивування продукти метаболізму адсорбуються активованим вугіллям впродовж 6-8 годин і далі екстрагуються з вугілля протягом 6-8 годин 70% етиловим спиртом Таким чином значна частина продуктів метаболізму залишається в культуральній рідині, яка не використовується і вилучається з технологічного процесу Результати досліджень, виконаних в Національному аналітичному центрі України з використанням високоефективної газорідинної хроматографії, хроматомасспектроскопм, Міжнародного банку даних хроматомасспектрів ХІМІЧНИХ сполук, показали, що в прототипі разом з культуральною рідиною викидається від 40 до 90% мікроелементів, 70-75% цукрів, 18-20% амінокислот В кінцевий продукт - спиртовий екстракт продуктів метаболізму - практично не потрапляють високоактивні речовини, наприклад, пббереліни, які через розгалужену просторову будову погано адсорбуються активованим вугіллям Запропонований винахід дає можливість не тільки поліпшити якісний і КІЛЬКІСНИЙ склад цільового продукта, але й значно зменшити його вартість за рахунок підвищення продуктивності технологічного процесу Так, з нього вилучаються дві трудомісткі стадії - адсорбція продуктів метаболізму з культурального середовища активованим вугіллям та їх екстракції з вугілля спиртом Кожна стадія має тривалість 7-9 годин Запропонований процес одержання регулятора росту рослин є безвідходним 3 кожного літра культуральної рідини отримується 1,25-1,33л готового продукту, в той час, як в прототипі - 0,4л, тобто продуктивність процесу збільшується втричі Зниження в готовому продукті вмісту етилового спирту з 70% до 25-30% сприяє зменшенню пожежобезпечності виробничого процесу і самого продукту Усі вказані особливості способу одержання регулятору росту рослин дозволяють вважати, що запропоноване технічне рішення відповідає критерію "винахідницький рівень" Сутність винаходу пояснюємо прикладами Для зручності викладення матеріалу надалі регу лятор росту рослин будемо іменувати Бюстимулятором Приклад 1 Спосіб одержання регулятора росту рослин Культивують штам гриба Myceha stenha [Пат України №22644А], виділеного з кореневої системи женьшеню Штам депонований в Інституті мікробіологи і вірусологи НАН України під № 1MB F100005 Мікроміцет гриба культивують в плоскодонних колбах Ерленмейера об'ємом 500, 750, 1000см3, в плоскодонних скляних судинах об'ємом 1, 1,5, 2дм 3 з вузьким горлом або в спеціальних бюреакторах в стерильних умовах в рідкому поживному розчині, що має такий склад, г/л глюкоза 10,0, L-аспарапн - 0,02, КН2РО4 - 0,9, К2НРО4 - 0,3, MgSO4 - 0,1, K2SO4 - 0,1, MnSO4 - 0,02, FeSO4 CuSO4 - 0,02, вода дистильована - 1,0дм3 Культивування проводять при температурі 22-28°С впродовж 30-60 діб при денному освітленні Для запобігання утворення корки, що перешкоджає проникненню кисню в культуральне середовище, судини для культивування періодично стряхують В процесі росту культура набуває вигляду слизуватої безбарвної або з кремовим забарвленням медузоподібної біомаси, що розповсюджується по всьому об'єму культуральної рідини По завершенні циклу культивування біомасу розбивають за допомогою механічної мішалки або міксеру і ВІДДІЛЯЮТЬ ВІД культуральної рідини шляхом фільтрації або центрифугування Для більш повного виділення продуктів метаболізму, які можуть залишитися в біомасі біомаси, м після відділення суспендують в етиловому спирті, об'єм якого відноситься до об'єму культуральної рідини як 1-1,3 3 Суспензію біомаси фільтрують, спиртовий екстракт об'єднують з фільтратом або фугатом культуральної рідини і отримують цільовий продукт (Бюстимулятор) - розчин продуктів метаболізму штаму Myceha stenha 1MB F-100005 в 25-30% етиловому спирті В результаті досліджень, проведених в Національному аналітичному центрі України та скринінга на спеціальних біологічних тест-об'єктах у складі отриманого препарату ідентифіковано 75 компонентів, в тому числі фітогормони (ЦИТОКІНІНИ, пббереліни, ауксини, абсцизова кислота), насичені і ненасичені вищі карбонові кислоти, поліцукри, амінокислоти, мікроелементи Ефективність препарату перевіряють біологічним методом по його здатності стимулювати фізіологічні процеси у вищих рослин Фізіологічну активність препарату визначають шляхом порівняння приросту довжини паростків озимої пшениці, вирощених з насіння, обробленого препаратом, та паростків з необробленого насіння Насіння озимої пшениці дезинфікують шляхом занурення на 15 хвилин у 1% розчин КМпО4, промивають дистильованою водою і розкладають по ЗО штук у 3 стерильні чашки Петрі з 5мл водного розчину препарату, розведеного у 1000 разів (1мл препарату розводять дистильованою водою до ЮООмл) і 3 контрольних чашки з 5мл дистильованої води Чашки накривають кришками і витримують в термостаті 3 доби при температурі 20-24°С Потім вимірюють довжину корінців або висоту надземної частини досліджуваних паростків 61190 Фізіологічну активність А розраховують за формулою А=(Х2Хі)х100%, де Хг - середня довжина корінців (висота надземної частини) дослідних паростків, Хі - середня довжина корінців (висота надземної частини) контрольних паростків Препарат вважається активним, якщо А не менше 20% Приклад 2 Насіння високопродуктивних сортів і гібридів кукурудзи обробляють регуляторами росту рослин напівсухим способом з використанням в якості прилипача МаКМЦ Висушене насіння висаджують в грунт по 50 штук в 4-разовому повторенні і після появи сходів освітлюють люмінесцентними лампами Дослід проводили в термостаті при температурі 22-24°С Фізіологічну активність досліджуваних сполук визначають по схожості насіння, росту надземної частини паростків та їх сирій масі Енергію проростання визначають на водній культурі в чашках Петрі через 5 днів Для порівняння в якості еталону використовують регулятор росту рослин Гумат натрію Результати досліду представлені в таблиці 1 Таблиця 1 Вплив регуляторів росту на ріст паростків кукурудзи Варіант досліду Енергія проростання, % 1 Контроль 2 Гумат натрію 3 Бюстимулятор 81 85 87 1 Контроль 2 Гумат натрію 3 Бюстимулятор 77 76 79 1 Контроль 2 Гумат натрію 3 Бюстимулятор 53 52 54 1 Контроль 2 Гумат натрію 3 Бюстимулятор 80 81 82 Схожість, Довжина ростків % мм % до контролю Сорт "Мир" 93 136,9 100 95 146,9 108 95 151,0 111 Сорт "Мона" 97 159,3 100 96 174,0 114 98 175,6 110 Сорт "Наташа" 66 136,8 100 68 151,8 111 70 157,3 115 Сорт "Скандія" 95 151,0 100 95 164,6 109 96 169,1 112 Приклад 2 Насіння цукрового буряку сорту Білоцерківський однонасінний обробляють напівсухим способом розчином, що містить Бюстимулятор з розрахунку 15млл~ насіння, протруйник - фунгіцид Сульфокарбатюн, 4Krn~, плівкоутворювач ЫаКМЦ - 1%, вода - 20лл~ Оброблене насіння ви Сира маса ростків г % до контролю 38,9 43,2 44,8 100 111 115 43,1 48,3 49,6 100 112 115 36,8 42,3 43,0 100 115 117 35,3 39,9 40,6 100 113 115 саджують в грунт по 50шт, повторення - чотириразове Через 5 діб визначають енергію проростання, через 15 - довжину і сиру масу паростків Як столон використовують регулятор росту цукрового буряку Етамон, для порівняння - Гумат натрію Результати досліду представлені в таблиці 2 Таблиця 2 Вплив регуляторів росту рослин на ріст паростків цукрового буряка Варіант досліду 1 2 3 4 Енергія проростання, % Схожість, % Контроль, Бюстимулятор Етамон Гумат натрію 82,7 85,5 83,4 83,1 79 88 83 81 Приклад 3 Випробування бюстимулятора проводились в 1998 році на чотирьох обласних державних дослідних сільськогосподарських станціях Української академії аграрних наук (УААН) Бюстимулятор застосовувався для передпосівної обробки (інкрустації) насіння озимої пшениці, в окремих дослідах - при обприскуванні ПОСІВІВ у фазі виходу в трубку Облікові ділянки становили Довжина паростків мм 40,15 47,79 44,57 43,76 % 100,0 119,0 111,0 109 Сира маса надземної частини, 100 паростків г % 4,16 100,0 4,91 118,0 4,58 110,0 4,49 108,0 25-50м , повторення - три- або чотириразове Як еталон використовували Гумат натрію, для порівняння - регулятор росту рослин Триман HIPogs найменша істотна різниця - показник статистичної обробки обліку урожаю, що характеризує ступінь точності обліку по повтореннях Результати досліду наведені в таблиці З 61190 Таблиця З Ефективність застосування регуляторів росту рослин при вирощуванні озимої пшениці Варіант досліду 1 Контроль 2 Бюстимулятор 3 Гумат натрію 4 Триман НІРо95, ц/га Обласні державні ДОСЛІДНІ сільськогосподарські станції УААН Волинська Вінницька Чернігівська Черкаська Урожай, Прибавка Урожай, Прибавка Урожай, Прибавка Урожай, Прибавка ц/га ц/га ц/га ц/га ц/га % ц/га % ц/га % ц/га % 37,6 48,4 38,6 43,5 1,3 10,8 1,0 5,9 Передпосівна обробка насіння 13,0 41,4 29 17,7 4,7 36 43,5 26 19,2 6,2 48 16 16,0 3,0 23 43,6 1,3 3,0 2,1 2,2 5 5 18,1 22,8 20,4 24,8 4,7 2,3 6,7 26 13 37 2,6 2,4 2,3 6,1 5,6 5,4 1,2 Обприскування ПОСІВІВ 1 2 3 4 Контроль Бюстимулятор Гумат натрію Триман НІРо95, Ц/га 35,0 39,1 36,7 37,4 4,2 4,1 1,7 2,5 12 5 7 34,1 36,7 31,7 41,6 1,5 2,6 -2,4 6,5 Дані таблиці свідчать, що застосування Біостимулятора в бакових сумішах із фунгіцидом сприяє не тільки підвищенню врожайності і цукристості коренеплодів, але й дає можливість зменшити дози використання Імпакта без зниження його захисної дії Приклад 4 В польовому ДОСЛІДІ, ЩО проводився спільно з фахівцями Інституту захисту рослин 8 -7 19 27,8 39,4 28,6 34,6 11,6 0,8 6,8 3,2 42 3 24 42,3 44,9 44,7 44,6 1,09 УААН в Пирятинському районі Полтавської області, вивчалася ефективність спільного застосування Біостимулятора з фунгіцидом Імпактом при фітосанітарних обробках цукрового буряка сорту Ялтушківський однонасінний проти основних хвороб Імпакт використовувався в різних фазах - від 1л/га (100%) до 0,5л/га (50%) Результати досліду наведені в таблиці 4 Таблиця 4 Ефективність спільного застосування Біостимулятора з фунгіцидом Імппактом на посівах, цукрового буряка Варіант досліду 1 Контроль 2 Бюстимулятор, 5мл/га 3 Імпакт, 1л/га 4 Імпакт + Бюстимулятор 5 Імпакт + Бюстимулятор 6 Імпакт + Бюстимулятор Інтенсивність поРозповсюдженість Урожайність Цукришкодження, % хвороб, % стість, церкос- борошни- церкос- борошни± до конт% ц/га пороз ста роса пороз ста роса ролю, ц/га 5,9 16,2 90 100 373,3 16,6 Збір цукру 61,9 ± до контролю ц/га 6,1 15,5 90 100 423,2 +49,9 17,2 72,8 10,8 0,5 5,5 60 70 418,9 +45,6 16,6 69,5 7,5 0,5 6,2 70 70 466,5 +93,2 17,2 80,2 18,2 0,7 6,5 80 80 426,7 +53,4 17,2 73,4 11,4 1,2 9,0 80 90 416,6 +43,3 17,2 71,6 9,7 Приклад 5 Випробування Біостимулятора проводили в 1999-2000 роках на обласних державних дослідних сільськогосподарських станціях УААН Препарат застосовували як для допосівної обробки насіння, так і для обприскування ПОСІВІВ В залежності від культури для обробки 1 тонни насіння використовували 10-20мл препарату, для обприскування 1га ПОСІВІВ - 5-20мл в 250-400 літрах води Наземну обробку насіння проводили в певні періоди вегетації Наприклад, озиму пшеницю і яровий ячмінь обробляли у фазі виходу в трубку, гречиху - у фазі гілкування, горох - у фазі бу тонізації і т і Для порівняння і в якості еталону використовували ВІДОМІ регулятори росту рослин Гумат натрію, Етамон а також нові препарати Триман, Метіур Посіви сільськогосподарських культур розміщували на ділянках з обліковою площею 25-50м у три- або читириразовому повторенні Усі агротехнічні заходи - обробка ріллі, внесення добрив, підживлення, догляд за посівами і т і виконувались ВІДПОВІДНО ДО технологій вирощування Вибіркові результати випробувань наведені втабл 5 61190 10 Таблиця 5 Ефективність Біостимулятора при вирощуванні основних сільськогосподарських культур Варіант досліду 1 2 3 4 Контроль Гумат натрію Бюстимулятор Триман НІРо95, ц/га 1 2 3 4 Контроль Гумат натрію Бюстимулятор Триман НІР095, Ц/га 1 2 3 4 Контроль Бюстимулятор Триман Етамон НІР095, Ц/га 1 2 3 4 Контроль Гумат натрію Бюстимулятор Триман НІР095, Ц/га 1 2 3 4 Контроль Гумат натрію Бюстимулятор Триман НІР095, Ц/га 1 2 3 4 Контроль Бюстимулятор Етамон Триман НІР095, Ц/га Допосівна обробка насіння Обприскування ПОСВІВІВ Прибавка урожаю Прибавка урожаю Урожай, ц/га Урожай, ц/га ц/га % ц/га % Озима пшениця, Чернігівська станція 29,9 31,8 34,9 5,0 16,7 33,2 1,4 4,4 38,2 8,3 27,7 38,3 6,5 20,4 37,2 7,3 24,4 36,9 16,0 5,1 2,6 3,1 Ярий ячмінь, Тернопільська станція 32,3 32,5 35,3 3,0 9,3 34,5 2,0 6,1 40,7 8,4 26,0 36,2 3,7 11,4 38,8 6,5 20,1 1,5 1,2 Горох, Вінницька станція 11,5 16,0 18,1 2,6 16,8 20,4 4,4 27,5 16,6 7,1 1,1 18,0 2,5 16,1 20,1 4,1 25,6 2,1 1,8 Кукурудза на зерно, Вінницька станція 81,6 77,8 82,7 80,4 2,6 3,3 1,3 1,1 87,6 6,0 7,4 86,3 8,5 10,9 87,4 5,8 83,0 5,2 6,7 7,1 5,7 3,8 Кукурудза на силос, Полтавська станція 391 421 425 34,0 8,7 432 11,0 2,6 467 76,0 19,4 459 38,0 9,0 443 52,0 13,3 439 18,0 4,3 31 31,3 Соняшник, Полтавська станція 16,9 20,1 19,5 2,6 15,4 23,7 3,67 17,9 18,2 7,7 1,3 19,3 2,4 14,2 22,2 10,4 2,1 2,2 1,7 Збір олії 1 2 3 4 Контроль Бюстимулятор Етамон Триман 1 2 3 4 Контроль Бюстимулятор Триман Метіур НІР095, Ц/га 1 2 3 4 Контроль Бюстимулятор Триман Метіур НІР095, Ц/га 1 Контроль 9,1 10,6 10,5 1,4 15,4 11,5 9,6 0,5 5,5 10,2 12,1 11,4 1,1 Льон-довгунець (соломка), Волинська станція 31,1 48,5 36,7 5,6 18,0 54,8 34,8 3,7 11,9 53,8 34,0 2,9 9,3 2,8 2,4 Льон-довгунець (насіння) 6,0 5,8 8,5 2,5 41,7 7,1 8,3 2,3 38,3 7,0 7,9 1,9 31,7 0,5 0,5 Люцерна (насіння), Полтавська станція 3,3 3,2 0,9 0,8 8,5 7,5 6,3 5,3 13,0 10,9 1,3 1,2 22,4 20,7 11 12 61190 Продовження таблиці 5 Варіант досліду 2 3 Бюстимулятор Метіур 4 Триман НІРо95, ц/га 1 2 3 4 Контроль Бюстимулятор Метіур Триман НІР095, Ц/га 1 2 3 4 Контроль Бюстимулятор Триман Етамон НІР095, Ц/га Обприскування ПОСВІВІВ Допосівна обробка насіння Прибавка урожаю Прибавка урожаю Урожай, ц/га Урожай, ц/га ц/га % ц/га % 4,0 0,8 25,0 4,2 0,9 27,3 3,8 0,6 18,7 4,0 0,7 21,2 3,9 0,7 21,9 4,0 0,7 21,2 0,44 0,6 Люцерна (зелена маса), Полтавська станція 261 306 45,0 17,2 271 10,0 3,8 265 4,0 1,5 13,1 Цукровий буряк, Миколаївська станція 451 463 508 57,0 12,6 561 98 21,2 502 51,0 11,3 531 68 14,7 489 38,0 8,4 518 55 11,9 30,3 45,0 Збір цукру 1 2 3 4 Контроль Бюстимулятор Триман Етамон 72,2 93,1 87,1 87,6 1 Контроль 2 Бюстимулятор 3 Триман 306 371 370 46,9 НІР095, Ц/га 1 2 3 4 Контроль Гумат натрію Бюстимулятор Триман НІР095, Ц/га 1 Контроль 2 Бюстимулятор 3 Триман НІРо95, Ц/га 20,9 28,9 14,9 20,6 15,4 21,3 Картопля, Волинська станція 65 21,2 64 20,9 71,3 83,4 80,9 77,9 12,1 9,6 6,5 17,0 13,5 9,1 314 346 25,0 32 13 10,2 4,3 1,1 3,0 0,9 12,5 34,1 10,2 Гречка, Івано-Франківська станція 8,8 7,1 9,9 8,5 1,4 19,7 11,8 11,0 3,9 54,6 9,7 9,4 2,3 32,4 0,4 0,9 Травосуміші (зелена маса), Волинська станція 498 601 103 21,0 559 61 12,3 11,3 Таким чином, поставлене завдання виконано Створено економічно дешевий і технологічно простий спосіб одержання регулятора росту рослин, який підвищує енергію проростання і польову схо Комп'ютерна верстка О Гапоненко жість насіння, збільшує врожайність широкого кола важливих сільськогосподарських культур, покращує якість рослинної продукції Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119