Антивірусний препарат альтабор та спосіб його одержання

Застосування екстракту суплідь вільхи клейкої та/або сірої із вмістом похідних галоелаготанінів як антивірусного препарату. 1. Застосування екстракту за п. 1, яке відрізняється тим, що антивірусний препарат виконаний у вигляді порошку, мазі та в ін'єкційній формі. (19) (21) 2003054865 (22) 28.05.2003 (24) 17.04.2006 (46) 17.04.2006, Бюл. № 4, 2006 р. (72) Бікбулатова Тамата Нігматовна, Шаламай Анатолій Севастянович, Безпалько Людмила Василівна, Кобилінська Валентина Іванівна, Сова Євген Олександрович, Рибалко Світлана Леонтівна, Дядюн Світлана Терентівна (73) ЗАКРИТЕ АКЦІОНЕРНЕ ТОВАРИСТВО НАУКОВО-ВИРОБНИЧИЙ ЦЕНТР "БОРЩАГІВСЬКИЙ ХІМІКО-ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ ЗАВОД" 3 63674 4 Доцільним є те, щоб антивірусний препарат її до нижньої ємності апарату, яка є збірником екбув приготовлений у лікарських формах мазей, страгенту, підведено вакуум. В технологічному стерильного порошку для ін'єкцій та таблеток. плані це дозволяє скоротити час екстрагування та Поставлена задача досягається також тим, що досягти повноти вимивання екстрактивних речов способі одержання антивірусного препарату вин. При фракційному збирані екстрагенту шляхом вилучення екстрактивних речовин з суттєвим є те, що його останні порції зі збідненим рослинної сировини водним органічним розчиннивмістом активних речовин можуть бути ком, згідно винаходу, як рослинну сировину виковикористані для первинного екстрагування свіжої ристовують плоди вільхи клейкої та сірої, вилупорції рослинної сировини. Це здійснюється при чення екстрактивних речовин з останньої наявності батареї фільтраційних екстракторів. здійснюють фільтраційною екстракцією, при Саме завдяки підбору умов екстрагування порційній подачі екстрагенту, з використанням рослинної сировини досягається максимальне вакууму для його видалення, з наступним конценвилучення поліфенольних галоелаготанінових труванням екстракту та вилученням із залишку сполук з мінімальним вмістом побічних ліпофільних речовин. ліпофільних восків, стеринів та хлорофілів. При цьому вилучення екстрактивних речовин Технологічні можливості фільтраційної екстракції здійснюють при масовому співвідношенні сировисуттєво оптимізують та здешевлюють виробничий на-екстрагент 1:7-10, водним ацетоном при процес одержання субстанції Альтабор, а це, в співвідношенні вода-ацетон 1-4:1-3 та швидкості свою чергу, забезпечує розширення асортименту екстракції сировини 2,0-3,5л/кг/год. антивірусних препаратів з вмістом екстрактивних Крім того, перед фільтраційною екстракцією речовин - глікозидів галоелаготанінів різного супліддя вільхи подрібнюють до розміру часток 1полімерного складу з рослинної сировини. 1,2мм та роздавлюють їх вальцюванням до товДля інтенсифікації процесу екстрагування щини 0,3-0,5мм. супліддя вільхи попередньо подрібнюють та Доцільно також останні фракції екстрагенту зі піддають роздавлюванню вальцюванням. Екстразбідненим вмістом екстрактивних речовин викоригування цієї сировини відбувається у стовувати для первинної фільтраційної екстракції фільтраційному екстракторі з використанням в свіжої рослинної сировини. якості екстрагенту водного ацетону. Галоелаготаніни суплідь вільхи в субстанції, Підбір масового співвідношення сировинаяку автори назвали Альтабором, за своїм хімічним екстрагент 1:7-10 суттєво позначається на виході складом досить близькі до сполук, виділених з екстрактивних речовин та вмісті супутніх обліпихи крушиноподібної в препараті Гіпораміні. ліпофільних сполук. На якісні та кількісні показники Для дубильних речовин найбільш яскраво висухого екстракту Альтабора також впливає масове раженими є, насамперед, антиоксидантні, співвідношення компонентів екстрагенту водаантигіпоксичні, протизапальні та в'яжучі ацетон, яка має бути в межах 1-4:1-3. властивості. ЗАТ НВЦ "Борщагівський ХФЗ" освоїв Орієнтовними характеристиками якісного та виробництво субстанції Альтан, яка містить сукількісного складу зразків субстанції поліфенолів марний поліфенольний комплекс, виділений з одержуваної в різних прикладах винаходу є вище суплідь вільхи клейкої та сірої. На основі цієї наведений компонентний вміст похідних субстанції розроблено препарат "Альтан" - таблетгалоелаготанінів та загальна кількість ки по 0,01г, який є лікарським засобом для поліфенольних сполук в межах 55-65% в розралікування різних форм гастриту та виразки шлунку. хунку на сухий порошок. Мазь Альтанова 2% знайшла застосування при Екстрагування суплідь вільхи в умовах лікуванні раневих пошкоджень різного походження фільтраційного способу на відміну від найближчоі, в тому числі, опіків. го аналогу відбувається за значно менший час і У відповідності з винаходом з суплідь вільхи при застосуванні мінімальних об'ємів екстракту. одержано препарат "Альтабор", який відрізняється Від ліпофільних речовин також звільняються значвід препарату "Альтан" складом но простішим шляхом декантації та центрифугугалоелаготанінових похідних та чітко вираженим вання водного залишку від упарювання первинноантивірусним ефектом, який раніше не був го екстракту. Важливим є те, що останні фракції відомий для препаратів вільхи. екстракту з малим вмістом екстрактивних речовин Було встановлено, що різні лікарські форми використовують в послідуючих процесах екстрагуАльтабору (ін'єкційна та мазева) пригнічують вання свіжої рослинної сировини. репродукцію вірусів грипу та двох штамів герпесу, До переваг винаходу слід віднести також і те, вірусу Епштейн-Барр in vitro та vivo. Механізми що екстракти після фільтраційної екстракції не антивірусної дії препаратів Альтабору пов'язані з потребують додаткової очистки фільтруванням. індукцією інтерферонів, інгібуванням Технологічною особливістю фільтраційного вірусспецифічних ферментів - нейромінідази та екстрагування є динамічне вимивання екстрактивтимідилаткінази, ДНК-полімерази. них речовин з твердої фази підготовленої Технологія фільтраційного екстрагування рослинної сировини до повного її виснаження. Екполягає в промиванні шару рослинної сировини страгування настоюванням є рівноважним процебезперервно свіжими порціями екстрагенту в сом масопереносу в гетерофазній системі, де апараті, який конструктивно схожий на пристрій швидкості десорбції та сорбції вирівняні при певній для фільтрації будь-яких розчинів і фільтруючим концентрації цих речовин в екстракті. У випадку елементом, чи матеріалом в цьому випадку є шар фільтраційного екстрагування рівновага масаперослинної сировини. Для прискорення промивання реносу зміщена в сторону десорбції та вилучення 5 63674 6 з твердої фази сировини екстрактивних речовин В кінці зібрану останню фракцію з I-го екстраквнаслідок динамічного омивання її поверхні свіжим тора об'ємом 20л подають на II-й екстрактор. розчинником. З цих причин суттєвими є зростання Аналогічним чином починають екстрагування на виходу екстрактивних речовин та значне зменІІІ-му екстракторі. Протягом 10 год сумарно збишення кількості екстрагенту. Особливості фізикорають 224л екстракту, упарюють в вакуумі до стахімічних процесів фільтраційного екстрагування ну густого екстракту об'ємом 2 л, який обробляють позначаються також на хімічному складі екстраканалогічно прикладу 1. Сиропоподібну масу висутивних речовин, а саме на значному зниженні шують в розпилювальній сушці при температурі кількості низькополярних ліпофільних сполук (восповітря на вході 160-165°С та на виході 80-85°С. ки, стерини, хлорофіли). При екстрагуванні сироВихід аморфного порошку субстанції Альтабору вини суплідь вільхи у звичайних умовах настоюскладає 5,45кг (18%) з вмістом дубильних речовин ванням ці речовини екстрагуються в значно 59,87%. більшій кількості, ніж при фільтраційному варіанті. Приклад 5. Екстрагування 1,2кг сировини Тому для звільнення екстракту галоелаготанінів суплідь вільхи виконують 10л 30% водного ацетовід ліпофільних сполук завжди застосовується їх ну (d 0,941г/см3) протягом 4 год аналогічно придодаткова екстракція низькополярними розчинникладу 1. Вихід порошку субстанції Альтабор ками. складає 182г (15,2%) з вмістом дубильних речовин Приклади здійснення винаходу, що 58,32%. заявляється. З наведених прикладів винаходу видно, що Приклад 1. Сировину суплідь вільхи сірої (Alмасове співвідношення сировина-екстрагент та nus іnсаnа) та/або клейкої (Alnus glutinosa) вміст в ньому ацетону суттєво впливає на вихід подрібнюють до розмірів часток 1мм та вальцюють субстанції Альтабор та кількість в ній дубильних до товщини 0,5мм. В ємність, яка одночасно слуречовин. Найбільш результативними є жить фільтром, укладають та ущільнюють 1кг співвідношення сировина-екстрагент 1 8 з 50% підготовленої сировини. Зазначена посудина на вмістом ацетону і коли швидкість проходження дні має сітку, покриту тканиною для фільтрування і екстрагенту через масу сировини складає 2,0нижньою частиною з'єднана з ємністю для збору 3,5л/кг/год. При цьому зазначені швидкості екстраекстрагента. До останньої підведено вакуум. Екстгування не повинні залежати від площі рагент - 50% водний ацетон (d 0,934г/см3) в фільтрувального пристрою та висоти сировини в кількості 10л подають на сировину, постійно ньому. При цьому оптимум швидкості досягається підтримуючи над її поверхнею шар в 2-3см. В регулюванням величини вакууму в приймальній приймальній ємності протягом 4 год підтримують ємності. вакуум в межах 100-150мм рт. ст. Швидкість Економічна вигідність фільтраційної екстракції екстракції складає 2,5л/кг/год. Зібраний екстракт сировини суплідь вільхи зростає при застосуванні упарюють у вакуумі роторного випарника до батареї з трьох екстракторів, позаяк, це дозволяє об'єму 500мл (вміст ацетону 0,03%). зменшувати кількість екстрагента за рахунок викоСиропоподібний залишок відстоюють протягом 18 ристання останніх фракцій екстракту, збіднених год. Верхній водний розчин декантують від екстрактивними речовинами для початкової смолянистої маси, центрифугують, фугат упарюекстракції на сусідньому екстракторі. ють до об'єму 100мл, залишок висушують за доЗа даними високоефективної рідинної помогою ліофільної сушки. Вихід коричневої хроматографії (ВЕРХ) склад субстанції Альтабор, пористої маси субстанції Альтабор складає 178г одержаної у відповідності з прикладами винаходу (17,8%), вміст дубильних речовин - 60,2%. майже сталий. Зокрема, в сухому порошку Приклад 2. Екстрагування 1кг підготовленої субстанції міститься близько 32,5% суміші сировини суплідь вільхи виконують 8,0л 65% водагліконів, серед якої елагова, дилактон валонієвої ного ацетону (d 0,912г/см3) протягом 3,5 год при кислоти та її етиловий ефір відповідно складають швидкості екстракції 2,25л/кг/год, аналогічно 23,7%, 3,6% та 5,2%. Глікозидні похідні методиці прикладу 1. Вихід порошку субстанції галоелаготанінів різного складу за вуглеводними Альтабор складає 192г (19,2%) з вмістом дубильфрагментами представлені мономерними, димерних речовин 59,2%. ними та полімерними похідними відповідно 8,7%, Приклад 3. Екстрагування 2,4кг підготовленої 3,4% та 19,8%. Хімічний склад виділених сировини суплідь вільхи виконують 20,0л 75% полімерних сполук поки що мало вивчений, проте, водного ацетону (d 0,904г/см3) протягом 3 год та відомо, що вони містять якусь кількість меланинів швидкості екстракції 2,4л/кг/год, аналогічно зі сталим вмістом азоту до 2,4%. Ці речовини могметодиці прикладу 1. Одержують 335г (18,1%) поли утворитись внаслідок реакцій конденсації рошку субстанції Альтабор з вмістом дубильних вільних амінокислот та вуглеводів на різних речовин 57,3%. стадіях дозрівання суплідь, чи при зберіганні Приклад 4. 30кг підготовленої сировини рослинної сировини. В цілому, в одержаних зразрозміщують в трьох екстракторах порівну і екстраках субстанції Альтабору поліфенольні речовини 3 гують 230л 50% водним ацетоном (d 0,931г/см ) складають 57,3-60,2%. при швидкості екстракції 2,7л/кг/год, виконують Антивірусна дія Альтабору вивчена в умовах аналогічно прикладу 1 з тією різницею, що експерименту in vitro та in vivo і з метою забезпепочаткові об'єми екстрагенту розподіляють на чення "чистоти" дослідів була приготовлена стекожний екстракт таким чином: на I-й - 90л, II-й та рильна форма ліофілізованого порошку препарату III-й по 70л. по 0,08г у флаконах з вмістом активної речовини суми дубильних поліфенольних сполук 62,5%. Та 7 63674 8 ка форма препарату є лікарською формою для вання методу врахування інфекційності молекуін'єкційного введення, стерильність препарату лярним методом ЦПР було встановлено зниження дозволяє проводити будь-які біологічні експериМПК та МАК Альтабору та привело до зростання менти, не вносячи мікробіологічну контамінацію. ХТІ в 10 раз. Спочатку для ін'єкційної форми Альтабору на З попередніх досліджень було встановлено, клітинах нирки теляти була встановлена максищо препарат є активним по відношенню і до РНК мально переносима концентрація (МПК), яка склавірусів, зокрема до вірусу грипу. Можливий ла 5,0мг/мл і відповідала 3,125мг/мл активної ремеханізм протигрипозної дії Альтабору було встачовини. На прикладі пригнічення репродукції новлено в дослідах по визначенню вірусу везикулярного стоматиту (ВВС) встановлеінтерфероногенної активності препарату в культуно хіміко-терапевтичний індекс (ХТІ) Альтабору, рах лейкоцитів людини. який дозволяє судити про рівень антивірусної дії Досліди по встановленню зазначеної препарату. ХТІ в ін'єкційній формі Альтабору по активності зводились до введення визначених доз відношенню до ВВС складає 40 при мінімально Альтабора до клітин лейкоцитів, які культивуваактивній концентрації (МАК) активної речовини лись при 37°С протягом 24 годин. Потім в 0,78мг/мл. надосадковій рідині був визначений рівень На прикладі пригнічення репродукції вірусу інтерферону у відповідності з вищенаведеною герпеса 1-го типу штаму VC з інфікуючим титром методикою вивчення цитопригнічуючої дії вірусу 6,5lg ТЦД50 на культурі клітин Vero було встановвезикулярного стоматита. Контрольним був дослід лено, що в межах концентрацій ін'єкційної форми визначення рівня інтерферону під дією стандарт2,0-0,125мг/мл Альтабор проявляє чітку ного індуктора полі-І-полі-Ц. Результати цих противірусну активність. дослідів наведені в таблиці 1. При визначенні профілактичної дії препарат Таблиця 1 вносився в культуру клітин перед їх інфікуванням і МАК складає 0,078мг/мл активної речовини. Рівень інтерферону, індукованого Альтабором в Лікувальний ефект препарату при внесені його до культурі лейкоцитів людини інфікованої культури клітин, відповідає МАК 0,156мг/мл. Альтабор - в дозах, Активність ІФН, ІЕ50/мл З метою встановлення механізму антивірусної мг/мл дії ін'єкційної форми Альтабору по відношенню 2,0 80 ДНК-вірусів вивчався вплив препарату на 1,0 160 активність ферментів, які приймають участь в 0,5 160 синтезі нуклеїнових кислот вірусів - ДНК0,25 320 полімеразу та тимідинкіназу (ТК). Активність цих 0,125 640 ферментів визначали в гомогенатах клітин мозку 0,064 160 мишей інфікованих вірусом герпеса простого шта0,032 20 му VC. Було показано, що препарат в дозах Полі-І-полі-Ц 2560 125мкг/мл та 150мкг/мл знижує активність ДНКполімерази відповідно на 35% та 50%. Таким чином, найбільш ефективною дозою Вплив препарату на активність тимідинкінази індукції інтерферону є 0,125мг/мл, тобто вивчався у відповідності до методу Фурлонга, де 0,078мг/мл активної речовини. величина активності фермента в інфікованих Ферментом, який відповідає за початковий вірусом клітинах без застосування препарату процес інфікування клітин вірусом грипу є прийнято за 100%. Було показано, що Альтабор нейрамінідаза, тому були проведені досліди по знижує тимідинкіназну активність в дозах вивченню впливу Альтабору на її активність. 150мкг/мл та 175мкг/мл відповідно на 30% та 38%. Антинейромінідазину активність Альтабору в Таким чином, позаяк вірусна тимідинкіназа концентрації 1мг/мл, тобто 0,625мг/мл активної забезпечує синтез вірусспецифічних ДНК, то речовини, визначали використовуючи противірусна дія препарату Альтабор відбувається нейромінідазу штамів вірусів грипу, нейрамінідазу завдяки пригніченню кіназної системи клітин і тим з Astrobacter ureafaciens з активностями 103 та самим спричинює інгібування репродукції вірусної 51,5 /мг/мл. ДНК. Результати дослідів наведені в таблиці 2. Антивірусна дія Альтабору по відношенню до віруса Епштейн-Барр (ВЕБ) була вивчена в Таблиця 2 діапазоні концентрацій препарату від 0,51200,0мкг/мл на лімфобластних клітинах Rajі, Показники антинейрамінідазної активності інфікованих вірусом, який було вилучено з суперін'єкційної форми Альта бору натанту клітин В95-8 з концентрацією 0,5мкл на 1млн клітин. Було встановлено, що МПК складає Показ оптичної 1000мкг/мл, МАК - 2мкг/мл, ХТІ - 500, а оптимальНейрамінідаза в % густини при но ефективна доза, яка в 6 раз пригнічує інгібування /мл/хв 549нм репродукцію ВЕБ складає 250мкг/мл. 105 0,990 0,210 78,8 Ці результати були одержані методом 51,5 0,595 0,090 100,0 підрахування живих та мертвих клітин при А/Гонконг/68/ 0,820 0,120 84,2 забарвленні тропановим синім. Тоді як, при підрахуванні більш чутливими методами і застосуА/Вікторія/75/ 0,690 0,110 84,2 9 63674 10 енцефаліту за лікувальною схемою введення А/Хабаровськ/H1N1/ 0,700 0,105 85,0 складав 0,05мг/кг активної речовини. Антигрипозна активність препарату Альтабор Таким чином, препарат в дозі 1мг/мл вивчалась на моделі грипозної інфекції in ovo. При (0,625мг/мл активної речовини) повністю інгібує 1/6 цьому в алантоїсну порожнину 10-11-денних куряферментної одиниці, або 52,5 / мл / хв чих ембріонів вводили препарат в дозі нейрамінідази Astrobacter ureafaciens, на 84,2% та 100мкг/ембріон. Через 1 год ембріони інфікували 85,0% активності нейрамінідази зазначених штамів вірусом грипу в дозі 100ЕІД50. Через 72 год вірусу грипу. інкубації ембріонів при 37°С в рідині алантоїсній Антигерпетична активність ін'єкційного препавизначали активність гемаглютиніну та рату Альтабор по відношенню до вірусу простого інфекційний титр вірусу з послідуючим титрувангерпеса (ВПГ-1) in vivo вивчалась на моделі ням на курячих ембріонах. Результати дослідів герпесвірусного менінгоенцефаліту білих безпонаведені в таблиці 5. родних мишах. Тварин інфікували введенням Таким чином, ін'єкційна форма Альтабору в внутрішньочеревно 0,1мл розчину препарату дозі 100мкг/ембріон проявляє дуже високу концентраціями 0,5; 0,05; 0,01 та 0,005мг/кг за інгібуючу дію на процес реплікації віруса і тим сапрофілактичною та лікувальною схемою. Конмим знижує його репродуктивні можливості на 5,5 трольними були варіанти: інфіковані тварини та одиниць lg ЕІД50. ліковані розчином препарату Віролекс (KRKA). Антивірусна дія Альтабору вивчалась у формі Активність препарату оцінювали шляхом мазі з 1%, 2,5% та 5% вмістом субстанції препарапорівняння смертності тварин в дослідній та ту. контрольній групах з врахуванням відсотків Антивірусну активність зразків мазі Альтабор смертності, кратності захисту (КЗ - кратність досліджувалась на моделі генітального герпеса зменшення кількості мертвих тварин в дослідній морських свинок в порівнянні з лікуванням препагрупі в порівнянні з контрольною), індексу ратом Ацикловір - крем Віролекс 5% (KRKA), після ефективності (ІЕ) по формулі: інфікування через 2 год (таблиця 6). КЗ 1 ІЕ х100 Антивірусна дія зразків мазі Альтабор ноКЗ сила дозозалежний характер, проте, в порівнянні з Ефективність препарату оцінювали за даними контрольним препаратом крем Віролекс 5%, зраінгібуючого інфекційного титру вірусу в тканинах зок мазі препарату з 2,5% вмістом субстанції Альмозку мишей як lg ID50. табору був більш ефективнішим. В серії дослідів було встановлено, що Наведені приклади антивірусної активності ін'єкційна форма Альтабору проявляє чітку препарату Альтабор у двох лікарських формах профілактичну дію в дозі 0,005мг/кг. свідчать про значну перспективність та В серії дослідів при лікуванні інфікованих миефективність лікарських засобів на основі екстракшей через 24 години препарат Альтабор проявляв тивних галоелаготанінів суплідь вільхи. Вивчений виражену лікувальну дію в усіх досліджуваних домеханізм антивірусної активності Альтабору зах. Позаяк ІЕ складав 30,0 та вище, то це й було свідчить про низьку токсичність його препаратів, показником високої антивірусної активності препабезпечність та направленість його терапевтичної рату. МАК препарату in vivo на моделі менінгодії в порівнянні з відомими синтетичними антивірусними препаратами. Таблиця 3 Захисна дія ін'єкційної форми Альтабору при профілактичному введенні препарату Препарат Альтабор Альтабор Альтабор Альтабор Віролекс Плацебо Доза, мг/кг К-сть мишей 0,5 0,05 0,01 0,005 100 12 10 10 12 10 10 З них загинуло всього % 8 66,6 8 80,0 5 50,0 4 33,4 7 70,0 10 100 КЗ ІЕ 1,5 1,25 2,0 3,0 1,4 33,3 20,0 50,0 66,6 28,0 Інгіб. інф. титр в тканині мозку lg ID50 2,0 1,0 3,0 3,0 2,5 Таблиця 4 Захисна дія ін'єкційної форми Альтабору при профілактичному введенні препарату Препарат Альтабор Альтабор Альтабор Альтабор Віролекс Доза, мг/кг К-сть мишей 5,0 0,5 0,1 0,05 100 10 10 12 10 12 З них загинуло всього % 7 70,0 6 60,0 4 40,0 6 60,0 7 58,0 КЗ ІЕ 1,43 1,66 3,0 1,66 1,7 30,0 40,0 60,0 40,0 41,17 Інгіб. інф. титр в тканині мозку lg ID50 1,5 2,0 3,0 2,0 2,5 11 63674 Плацебо 10 10 12 100 Таблиця 5 Вплив ін'єкційної форми Альтабору на вірус грипу Доза в мкг на ембріон 100мкг 1 серія 2 серія 3 серія Дія препарату Альтабор Титр гемаглютининів в Інфекц. титр вірусу РГА в lg ЕІД50 Контроль вірусу 0 0 0 512 2,0 2,0 2,0 7,5 Показник інгібування в lg ЕІД50 5,5 5,5 5,5 Таблиця 6 Ефективність мазі Альтабор на моделі генітального герпесу морських свинок Групи тварин 1 2 3 4 5 Препарат Контроль інфікування Віролекс Мазь Альтабор 1% Мазь Альтабор2,5% Мазь Альтабор 5% Комп’ютерна верстка М. Клюкін Період захворювання, діб 15,0±3,2 9,75±2,86 12,5±1,39 9,0 1,39 5,0±0,5 Підписне р 0,05