Біосенсор на основі локалізованого поверхневого плазмонного резонансу

1. Біосенсор для реєстрації біомолекулярних взаємодій у водних розчинах на основі явища поверхневого плазмонного резонансу, який має джерело випромінювання, прозорий оптичний елемент, на поверхню якого нанесений чутливий шар золота або срібла, робочу кювету, блок керування та фоточутливий елемент, який відрізняється тим, що джерело випромінювання дає світло з неперервним спектром видимого та ближнього U 2 (19) 1 3 плазмонного резонансу, є той факт, що вимірювана зміна показника заломлення залежить від концентрації або поверхневої густини зразка, а не від його повної маси. Це призводить до того, що сигнал виявлення не зменшується при зменшенні об'єму зразка, що є важливим при використанні дорогих аналітів. Найбільш близьким до запропонованого за технічною суттю є біосенсор для виявлення та визначення концентрації біомолекул на основі поверхневого плазмонного резонансу [3]. Згаданий біосенсор має чутливий елемент у вигляді тонкої металевої або напівпровідникової плівки, нанесеної на поверхню прозорого оптичного елемента у вигляді скляної призми повного внутрішнього відбивання, на якому розташована робоча кювета. Поверхневі плазмони у плівці збуджуються за допомогою p- поляризованого світла, що випромінюється джерелом світла, наприклад, гелій-неоновим лазером. Світло падає на поверхню тонкої плівки зі сторони призми під кутом падіння, який може змінюватись шляхом повороту призми за допомогою пристрою повороту призми, що керується зовнішнім контролером. Інтенсивність відбитого світла вимірюється за допомогою фоточутливого пристрою, наприклад, фотодіоду або фотопомножувача, та перетворюється у цифрову форму за допомогою аналогово-цифрового перетворювача. Управління поворотом призми, виконання вимірів та обробка даних виконується за допомогою програмного забезпечення, яке працює на обчислювально-керуючому пристрої, наприклад, персональному комп'ютері. Описаний пристрій має недоліки, що полягають у обмеженості можливостей мініатюризації чутливого елемента, наявності верхньої межі показника заломлення вимірюваної речовини, що звужує ряд речовин, що можуть бути досліджені, та складності механічної системи, що забезпечує обертання призми під час вимірювання інтенсивності відбитого від чутливого елементу світла. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу розробити такий біосенсор на поверхневому плазмонному резонансі, який би був портативним, мав більш просту конструкцію та менші габарити, був більш універсальним, що дасть змогу проводити спектральні вимірювання більш широкого ряду речовин в рідинному стані та дозволяв проводити мініатюризацію чутливого елемента. Поставлена задача вирішується біосенсором для реєстрації біомолекулярних взаємодій у водних розчинах на основі явища поверхневого плазмонного резонансу, який має джерело випромінювання, прозорий оптичний елемент, на поверхню якого нанесений чутливий шар золота або срібла, робочу кювету, блок керування та фоточутливий елемент, згідно з корисною моделлю, джерело випромінювання дає світло з неперервним спектром видимого та ближнього інфрачервоного діапазону довжин хвиль, прозорий оптичний елемент виконано у вигляді плоскопаралельної пластини, чутливий шар золота або срібла виконаний у вигляді впорядкованого рівномірно-орієнтованого однорідного двовимірного масиву наноструктур, 65947 4 робочу кювету виконано із прозорого матеріалу, фоточутливий елемент виконано у вигляді спектрометра видимого ближнього інфрачервоного діапазону. Біосенсор відрізняється також тим, що додатково містить систему фокусування для формування світлового пучка, що падає на поверхню масиву наноструктур. Біосенсор відрізняється також тим, що додатково містить поляризатор для виділення зі світлового пучка лінійно-поляризованої складової. Біосенсор відрізняється також тим, що додатково містить оптичний хвилевід, що подає світло, яке пройшло через масив наноструктур, до спектрометра. Сенсорний механізм пропонованого чутливого елемента базується на збудженні локалізованих поверхневих плазмонних коливань в чутливому шарі золота або срібла, виконаного у вигляді впорядкованого рівномірно-орієнтованого однорідного двовимірного масиву наноструктур при падінні світла на поверхню наноструктур та чутливості умов виникнення явища локалізованого поверхневого плазмонного резонансу (ЛППР) до процесів, що відбуваються на поверхні чутливого елемента і призводять до змін локального показника заломлення середовища. А саме, спектр екстинкції світла масивом наноструктур містить щонайменше один пік, форма, інтенсивність та спектральне положення якого залежать від значення локального показника заломлення середовища, що оточує наноструктури. Таким чином, відслідковуючи зміни параметрів ЛППР-піку у часі, можна дослідити такі процеси на поверхні чутливого елемента як адсорбція біомолекул, специфічне зв'язування, імунологічні реакції тощо з високою відтворюваністю та повторюваністю сенсорного відгуку. Зокрема, наявність біореагента, що детектується, та його концентрація можуть бути оцінені шляхом вимірювання величини та кінетики зміни екстинкції на фіксованій довжині хвилі світла або спектрального зсуву положення ЛППР-піку екстинкції, що супроводжують протікання біохімічної реакції. Так як для золотих та срібних наноструктур ЛППР-піки екстинкції розташовуються у видимій та ближній інфрачервоній ділянках спектра, то для вимірювання спектра екстинкції світла масивом наноструктур застосовується джерело випромінювання, що дає світло з неперервним спектром видимого та ближнього інфрачервоного діапазону довжин хвиль. Як підкладинка для чутливого елемента використовується прозорий оптичний елемент у вигляді плоскопаралельної пластини, що не поглинає світло у досліджуваному діапазоні довжин хвиль та вносить мінімальні зміни у вимірюваний спектр екстинкції світла. Так як оптична схема біосенсора сконструйована у геометрії на пропускання, то робоча кювета виконується із прозорого матеріалу, що не поглинає світло у досліджуваному діапазоні довжин хвиль. Так як ЛППР-піки можуть бути розташовані у різних ділянках спектра, то для реєстрації спектра екстинкції світла масивом наноструктур використовується спектрометр видимого ближнього інфрачервоного діапазону. Портативність біосенсора досягається шляхом 5 можливості використання як фоточутливий елемент компактного спектрометра. Спрощення конструкції та зменшення габаритів біосенсора забезпечується за рахунок зменшення оптичного шляху, відсутності механічної системи обертання прозорого оптичного елемента з розташованим на його поверхні чутливим елементом та виконання прозорого оптичного елемента у вигляді плоскопаралельної пластини. Підвищення універсальності біосенсора досягається за рахунок розширення ряду речовин, що можуть досліджуватися, за рахунок можливості проведення вимірювань у спектральному режимі з використанням спектрометра, а також відсутності обмеження на значення показника заломлення досліджуваної речовини. Присутність у прототипі обмеження на максимальне значення показника заломлення середовища, що досліджується, який має бути не вищим, ніж показник заломлення скляної призми, пов'язана з використанням скляної призми як елемента для підвищення імпульсу фотонів світла, що необхідно для збудження поверхневих плазмонних коливань у тонкій електропровідній плівці. Використання як чутливий елемент масиву наноструктур золота або срібла дозволяє збудити локалізовані поверхневі плазмонні коливання при будь-яких значеннях показника заломлення середовища, що їх оточує, за допомогою джерела випромінювання з суцільним спектром видимого та ближнього інфрачервоного діапазону довжин хвиль. Чутливий елемент на основі масиву наноструктур забезпечує широкі можливості мініатюризації за рахунок можливості зменшення розмірів наноструктур та періоду масиву, а також дозволяє проводити зменшення його площі при додатковому використанні системи фокусування світла. Для формування на поверхні чутливого елемента світлової плями необхідних розмірів та інтенсивності додатково використовується система фокусування світла. Збільшення інтенсивності світлового пучка, що проходить через чутливий елемент, покращує співвідношення сигнал-шум біосенсора. Так як наноструктури, що входять до складу чутливого елемента, можуть підтримувати одночасне збудження більш ніж однієї моди ЛППР внаслідок анізотропії їх геометричних параметрів, то для використання окремих мод коливань ЛППР додатково застосовується поляризатор, що виділяє зі світлового пучка лінійно-поляризовану складову. Використання лінійно-поляризованого світла разом з застосуванням масивів геометричноанізотропних наноструктур дозволяє підвищити відгук біосенсора. Для забезпечення збору корисного світлового сигналу та передачі його до спектрометра або зовнішнього спектрофотометра додатково використовується оптичний хвилевід, що зменшує рівень шуму біосенсора за рахунок зменшення кількості небажаного світла, що потрапляє до спектрометра. Суть запропонованої корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де на: фіг. 1 показано змінний чутливий елемент (сенсорний чіп), де 1 - прозорий тримач; 2 - прозора підкладка із роз 65947 6 ташованим на поверхні масивом наноструктур (далі - кристал); фіг. 2 показано а), б) зображення, отримані за допомогою атомно-силової мікроскопії (АСМ), та в) АСМ-переріз впорядкованого масиву наноструктур із золота, виготовлених за допомогою технології наноімпринт-літографії; фіг. 3 схематично представлено конструкцію біосенсора, де 3 - компактний спектрометр або зовнішній спектрофотометр; 4 - електронний блок керування; 5 кроковий двигун; 6 - джерело світла з неперервним спектром; 7 - система фокусування; 8 - поляризатор; 9 - закрита проточна кювета; 10 перистальтичний насос; 11 - оптичний хвилевід; фіг. 4 наведено кінетичний відгук біосенсора на біоспецифічну реакцію між бичачим сироватковим альбуміном (БСА) та імуноглобуліном IgG анти-БСА; фіг. 5 показано зміщення піку екстинкції світла масивом наноструктур внаслідок адсорбції молекул та протікання біоспецифічної реакції на їх поверхні. Виготовлення пропонованих масивів наноструктур для чутливого елемента може бути проведене за допомогою технології наноімпринтлітографії, що передбачає два етапи: виготовлення шаблону та використання отриманого шаблону для виробництва масивів наночастинок [4,5]. Пропонований сенсорний чип (фіг. 1) виготовляється наступним чином. Підкладка з прозорого матеріалу із розташованим на поверхні масивом наноструктур (фіг. 2) розрізається на частини розміром 2 від 11 мм (кристали) 2, які фіксуються за допомогою прозорого в видимій ділянці спектра клею посередині прямокутного прозорого тримача 1 (може бути використане стандартне мікроскопне 2 скло (25,476,2 мм )). Пропонований біосенсор (фіг. 3) складається із оптичної частини, до складу якої входять джерело світла з неперервним спектром 6, система фокусування 7, поляризатор 8, оптичний хвилевід 11 та реєстратор спектра видимого-ближнього інфрачервоного діапазону 3 (компактний спектрометр), системи подачі біологічної проби до поверхні сенсорного кристалу (масиву наноструктур високопровідного металу на прозорій діелектричній підкладці), що містить прозору закриту проточну кювету 9 із ущільненням і перистальтичний насос 10, та електронного блока керування оптичною системою 4 з кроковим двигуном 5. З'єднання оптичної системи та системи подачі проби проводиться у напівавтоматичному режимі із використанням змінних сенсорних чипів. Біосенсор також дозволяє працювати в режимі спектрофотометра з використанням стандартних спектрофотометричних кювет. Портативний прилад здатний працювати як у стаціонарному, так і у мобільному варіанті під керуванням персонального комп'ютера (ноутбука). Конструкція приладу дозволяє приєднання оптичного хвилеводу до зовнішнього спектрофотометра. Біосенсор, що заявляється, працює у режимі вимірювань кінетики досліджуваного процесу у проточному режимі наступним чином: 7 - Прозорий тримач без кристалу фіксується у отворі для сенсорних чипів, кювета заповнюється основним буферним розчином, що буде використовуватися при роботі; за допомогою елементів керування програми для управління біосенсором налаштовуються необхідні параметри роботи спектрометра та записується спектр джерела світла як опорний спектр з врахуванням темнового сигналу приймача світла. Кювета звільняється від буферного розчину та просушується; видаляється прозорий тримач; - змінний сенсорний чип (тримач з кристалом) фіксується у отворі для сенсорних чипів, кювета заповнюється основним буферним розчином, що буде використовуватися при роботі; записується спектр екстинкції світла масивом наноструктур; - вибирається режим вимірювання кінетики досліджуваного процесу та розпочинається вимірювання кінетики. За допомогою насосу розчини досліджуваних речовин доставляються до кювети відповідно до протоколу аналізу. Кінетичний сигнал екстинкції світла сенсорним чипом відслідковує процеси, що відбуваються на поверхні масиву наноструктур (адсорбцію, специфічне зв'язування, імунологічні реакції тощо). Приклад. Використовувався пропонований чутливий елемент у вигляді сенсорного чипу (фіг. 1) для біосенсора (фіг. 3) згідно вищеописаного протоколу. Чутливий елемент був виготовлений за допомогою запропонованого методу наноімпринтлітографії і являв собою нанесений на скляну плоскопаралельну пластину впорядкований масив нанопаралелепіпедів із золота, що характеризуються внутрішньоплощинними боковими розмірами 120 нм та 130 нм і висотою 50 нм, та рівномірно орієнтовані на квадратній ґратці з періодом 230 нм (фіг. 2). Експеримент проводився з прозорою кюветою об'ємом 20 мкл та перистальтичним насосом (швидкість протоку 10 мкл/хв.). Щоб оцінити кінетичний відгук біосенсора на адсорбцію реальних біологічних матеріалів, виготовлені сенсорні чипи були використані для детектування біоспецифічної реакції між бичачим сироватковим альбуміном (БСА, молекулярна вага 60 кДа) та імуноглобуліном (IgG анти-БСА, молекулярна вага 150 кДа). Результати експерименту зображені на фіг. 4, де показана кінетична залежність екстинкції в реальному часі для специфічної реакції між БСА та імуноглобуліном анти-БСА, розчиненими в фосфатному буферному сольовому (ФБС) розчині для різних концентрацій розчину ФБС/анти-БСА. Значення екстинкції світла вимірювалося на правому схилі піку екстинкції локалізованого поверхневого плазмонного резонансу на довжині хвилі 720 нм. 65947 8 Сенсорний чип промивався у буферному розчині ФБС впродовж 8 хв. для отримання базової лінії. Розчин БСА з концентрацією 500 мкг/мл доставлявся до сенсорного чипу на протязі 10 хв. (до стабілізації значення екстинкції). Інжекція БСА призвела до зростання екстинкції світла, пов'язаного зі зміщенням піку екстинкції внаслідок адсорбції молекул БСА на поверхню наноструктур (фіг. 5). Потім сенсорний чіп промивався у буферному розчині ФБС з метою видалення з кювети неадсорбованих молекул БСА до стабілізації значення екстинкції. Після цього у кювету були послідовно введені розчини імуноглобуліну анти-БСА різної концентрації (0,1,0,5,2,0,10,50 та 250 мкг/мл) із наступною промивкою буферним розчином. Зростання значення екстинкції при введенні розчинів імуноглобуліну пов'язане із протіканням специфічної реакції типу "антиген-антитіло" між молекулами БСА, адсорбованими на поверхні золотих наночастинок, та молекулами анти-БСА у буферному розчині, що також супроводжувалася зміщенням піку екстинкції (фіг. 5). Крім того, спостерігався високий ступінь специфічності реакції під час експерименту після змивання шару анти-БСА за допомогою 0,1 М розчину НСl, коли було усунуто майже 100 % антитіл, в той час як шар БСА повністю залишився на поверхні сенсора (фіг. 4). Таким чином, розроблений біосенсор придатний для багатократної регенерації та повторення специфічної реакції. Проведені експерименти підтверджують можливості запропонованого чутливого елементу та біосенсора на його основі для дослідження процесів адсорбції, міжмолекулярних взаємодій, для детектування біомолекул та моніторингу біологічних реакцій. Джерела інформації: 1. R. Narayanaswamy, О. S.Wolfbeis, Optical Sensors, Springer, New York, 2004. 2.W. E. Moerner, "New directions in singlemolecule imaging and analysis", Proc. Natl. Acad. ScL, 2007,104,12596-12602. 3. Патент 46018 Україна, Спосіб детектування та визначення концентрації біомолекул та молекулярних комплексів та пристрій для його здійснення, G01N21/25,15.05.2002. 4. В. D. Lucas, J.-S. Kim, С. Chin, and L.J. Guo, "Nanoimprint Lithography Based Approach for the Fabrication of Large-Area, Uniformly-Oriented Plasmonic Arrays". Adv.Mater. 2008,20, 1129-1134. 5. V. Chegel, B. Lucas, J. Guo, A. Lopatynskyi, O. Lopatynska, L. Poperenko, "Detection of biomolecules using optoelectronic biosensor based on localized surface plasmon resonance.Nanoimprint lithography approach, " Semicond.Phys.Quantum Electron.Optoelectron.2009,12,1,91-97. 9 65947 10 11 Комп’ютерна верстка І. Скворцова 65947 Підписне 12 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601