Спосіб визначення іn vitro чутливості клітин злоякісних гліом головного мозку до цитотоксичної дії хіміопрепарату

Реферат: Спосіб визначення in vitro чутливості клітин злоякісних гліом головного мозку до цитотоксичної дії хіміопрепарату включає вилучення тканини злоякісної гліоми головного мозку хворого. Потім фрагмент біопату ріжуть лезом на невеликі частинки та механічно дезагригують. Після цього звільнюють суспензію від крупних фрагментів. Відмивають клітини центрифугуванням у живильному середовищі. Готують суспензію клітин стандартної концентрації. Далі нашаровують верографін на суспензію клітин та центрифугують. На рівні розподілу фаз градієнт-суспензія проводять збір шару клітин відповідної щільності. Далі відмивають зібрані клітини живильним середовищем. Потім осад ресуспендують у живильному середовищі та проводять підрахунок кількості клітин. Переносять краплину цього розчину в камеру Горяєва. Підраховують кількість клітин і визначають питому вагу опалесцюючих клітин. Після суспензію розносять по пробіркам та додають живильне середовище з різними дозами хіміопрепарату. Контрольна пробу культивують у живильному середовищі та переносять у термостат. Потім центрифугують та видаляють супернатант. До осаду додають живильне середовище та перемішують. Після підраховують загальну кількість клітин та питому вагу опалесцюючих клітин. UA 69879 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ІN VITRO ЧУТЛИВОСТІ КЛІТИН ЗЛОЯКІСНИХ ГЛІОМ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ДО ЦИТОТОКСИЧНОЇ ДІЇ ХІМІОПРЕПАРАТУ UA 69879 U UA 69879 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, а саме до нейроонкології, і може бути використана для більш точного визначення in vitro чутливості клітин злоякісних гліом головного мозку до цитотоксичної дії хіміопрепарату, що необхідно для більш коректного вибору хіміопрепаратів для раціональної хіміотерапії нейроонкологічних хворих. Сучасна онкологія спрямовує зусилля на подальшу оптимізацію результатів лікування хворих на злоякісні гліоми головного мозку. Вже підтверджена доцільність комбінованого лікування злоякісних гліом з залученням оперативного лікування, хіміотерапії, рентгенотерапії, імунокорекції [1]. Разом з тим, лишається невирішеною проблема індивідуалізації комбінованого лікування злоякісних гліом, бо застосування будь-яких узгоджених схем призначення хіміопрепаратів у комбінації з іншими впливами є ефективним лише у частини пацієнтів. Одним з шляхів вирішення проблеми індивідуалізації комбінованого лікування злоякісних гліом вважають попереднє дослідження чутливості клітин гліоми до цитотоксичної дії хіміотерапевтичного агента. У теперішній час запропоновані і використовуються різні способи дослідження чутливості клітин гліоми до цитотоксичної дії хіміопрепарату. Як правило, ці способи передбачають вилучення тканини злоякісної гліоми з головного мозку хворого, отримання біоптату, подрібнення фрагменту ножицями, механічну дезагрегацію подрібненої тканини за допомогою піпеток або голок і шприца, звільнення суспензії від крупних фрагментів, відмивання клітин центрифугуванням у живильному середовищі, приготування суспензії клітин стандартної 6 концентрації (510 в 1 мл), культивування визначеної дози клітин у живильному середовищі, що містить різні дози хіміопрепарату (контролем служить проба, живильне середовище якої не містить хіміопрепарату). Інкубація клітин гліоми з хіміопрепаратом триває 48-72 години, потім у проби додають тимідин, що мічений по тритію, і інкубація триває. Потім суспензії фільтрують (кожну окремо) на спеціальні фільтри і визначають кількість радіонукліда (за допомогою лічильника радіоактивності). Результат розраховують математично, як індекс інгібіції пухлинного росту у відсотках [2]. Цей спосіб спрямований на дослідження проліферації клітин гліоми і є досить адекватним поставленій меті, сучасним і доступним. До недоліків цього способу можна віднести необхідність застосування радіоактивних ізотопів, відповідних лічильників, фільтрів, додаткового обладнання. 3 Загальновизнаним є спосіб, коли тканину гліоми людини ріжуть на фрагменти (1 мм ), потім ці фрагменти інокулюють під капсулу нирки наркотизованих та лапаротомованих мишей СВА. Потім на стінку черевної порожнини та шкіру накладають шви, тварин виводять з наркотичного сну і проводять введення різних хіміопрепаратів в дозі ЛД10 (внутрішньоочеревно) протягом 3-х діб з початком на 4-й день після трансплантації. На 7 добу після введення інокулята тварин наркотизують, вилучають нирки та порівнюють вагу фрагменту пухлини, що знаходилася під капсулою нирки контрольних тварин (системневведення фізіологічного розчину) та тварин, яким системно вводили хіміопрепарати (дослідна група). Регресію пухлини визначають розрахунком відношення зміни ваги лікованих та контрольних пухлин у відсотках [3]. Цей спосіб максимально наближує дослідників до умов, які мають місце в організмі пацієнта, дозволяє врахувати особливості фармакодинаміки та фармакокінетики хіміопрепарату. Разом з тим, цей спосіб має низку недоліків організаційного характеру: по-перше, спосіб передбачає оперативне втручання (наркотизацію тварин, розтини шкіри та стінки черевної порожнини, маніпуляцію з капсулами нирок і т.і.), а це висококваліфікована робота і повинна проводитися відповідним фахівцем; по-друге, операції на тваринах і 7 діб очікування результату уповільнює вибір тактики лікування; по-третє, тварини і корм для них обтяжують кошторис обстеження хворого і не передбачені бюджетом лікарень. Крім того, утримувати експериментальних тварин необхідно у віварії, існування таких підрозділів не передбачено у обласних лікарнях. Ця низка недоліків суттєво звужує можливості використання цього способу у онкології. Найближчим аналогом вибрано дослідження протипухлинної дії препарату, згідно з яким після вилучення тканини злоякісної гліоми з головного мозку хворого, отримання біоптату, проводять подрібнення фрагменту біоптату ножицями, механічну дезагрегацію подрібненої тканини за допомогою піпеток або голок і шприца, звільнення суспензії від крупних фрагментів, відмивання клітин центрифугуванням у живильному середовищі, приготування суспензії клітин 6 стандартної концентрації (510 в 1 мл), культивування визначеної дози клітин у живильному середовищі, що містить різні дози хіміопрепарату (контролем служить проба, живильне середовище якої не містить хіміопрепарату). Суспензії клітин пухлини інкубували протягом 24 годин при температурі 37 °C, цитотоксичну дію різних доз препарату визначали шляхом фарбування 0,2 % розчином вітального барвника (трипанового синього) з визначенням кількості пофарбованих та непофарбованих клітин у відсотках і розрахунок цитотоксичного індексу [3]. 1 UA 69879 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Задачею корисної моделі є підвищення точності визначення цитотоксичної дії препарату, прискорення проведення дослідження, зменшення фінансових витрат при проведенні досліджень та спрощення процедури дослідження цитотоксичної дії протипухлинного препарату. Поставлена задача вирішується тим, що після встановлення діагнозу (МРТ-дослідження), під час оперативного втручання проводиться вилучення тканини злоякісної гліоми головного мозку хворого, фрагмент біоптату ріжуть лезом або ножицями на невеликі частинки, механічно дезагригують за допомогою піпеток або голок і шприца, звільнюють суспензію від крупних фрагментів, відмивають клітини центрифугуванням у живильному середовищі, готують 6 суспензію клітин стандартної концентрації (510 в 1 мл), далі нашаровують на 1,0-2,0 мл верографіну (d=1,078) 2,0-4,0 мл суспензії клітин, отриманих з біоптата, та центрифугують 15 хвилин на настільній центрифузі (кількість обертів - 3000 за хвилину), пробірки виймають з ротора центрифуги, на рівні розподілу фаз градієнт-суспензія проводять збір шару (у вигляді "хмаринки") клітин відповідної щільності і переносять у центрифужну пробірку, далі відмивають зібрані клітини 10-кратною кількістю живильного середовища, після центрифугування осад ресуспендують у 1,0 мл живильного середовища, проводять підрахунок кількості клітин (змішують 400 мкл 0,2-%вого розчину трипанового синього та 20 мкл суспензії клітин, переносять краплину цього розчину в камеру Горяєва, рахують згідно з інструкцією кількість клітин (забарвлених та опалесцюючих) і визначають як загальну кількість клітин, так і питому вагу опалесцюючих клітин, як правило, питома вага життєздатних клітин збільшується у 2,5-3,5 рази, отриману таким способом суспензію розносять по пробіркам, додають живильне середовище, що містить різні дози хіміопрепарату, контрольна проба культивується тільки у живильному середовищі, пробірки переносять у термостат (37 °C, 5 % СО2), через 24 години пробірки центрифугують, видаляють супернатант, до осаду додають 200 мкл живильного середовища, обережно перемішують і проводять підрахунок (за допомогою 0,2 %-ного розчину трипанового синього та камери Горяєва) загальної кількості клітин і питомої ваги опалесцюючих клітин. Корисна модель, що пропонується, дозволяє удосконалити найближчий аналог. Згідно з корисною моделлю, що пропонується, після вилучення тканини злоякісної гліоми з головного мозку хворого та отримання біоптату, проводять подрібнення фрагменту ножицями, механічну дезагрегацію подрібненої тканини за допомогою піпеток або голок і шприца, звільнення суспензії від крупних фрагментів, відмивання клітин центрифугуванням у живильному середовищі, додатково отриману суспензію звільнюють від гинучих та загиблих клітин нашаруванням суспензії на розчин верографіну (d=1,078) та 15-ти хвилинним центрифугуванням на настільній центрифузі (3000 обертів/хв.), вилученням шару клітин, що утворюється на верографіні, відмивають клітини центрифугуванням у живильному середовищі, 6 проводять підрахунок та приготування суспензії клітин стандартної концентрації (2×10 в 1 мл), культивування протягом 24 годин клітин у живильному середовищі, що містить різні дози хіміопрепарату, при температурі 37 °C, визначають за допомогою вітального фарбування 0,2 % розчином трипанового синього кількість пофарбованих та непофарбованих клітин у відсотках і розраховують цитотоксичний індекс (контролем слугує проба, живильне середовище якої не містить хіміопрепарату). Спосіб виконується наступним чином. Пропонований спосіб виконується таким чином. Після встановлення діагнозу (МРТдослідження), під час оперативного втручання проводиться вилучення тканини злоякісної гліоми з головного мозку хворого. Фрагмент біоптату ріжуть лезом або ножицями на невеликі частинки, механічно дезагригують за допомогою піпеток або голок і шприца, звільнюють суспензію від крупних фрагментів, відмивають клітини центрифугуванням у живильному середовищі, готують 6 суспензію клітин стандартної концентрації (510 в 1 мл). Потім нашаровують на 1,0-2,0 мл верографіну (d=1,078) 2,0-4,0 мл суспензії клітин, отриманих з біоптата, та центрифугують 15 хвилин на настільній центрифузі (кількість обертів - 3000 за хвилину). Пробірки виймають з ротора центрифуги, на рівні розподілу фаз градієнт-суспензія проводять збір шару (у вигляді "хмаринки") клітин відповідної щільності і переносять у центрифужну пробірку. Відмивають зібрані клітини 10-кратною кількістю живильного середовища. Після центрифугування осад ресуспендують у 1,0 мл живильного середовища, проводять підрахунок кількості клітин (змішують 400 мкл 0,2 %-ого розчину трипанового синього та 20 мкл суспензії клітин, переносять краплину цього розчину в камеру Горяєва, рахують згідно з інструкцією кількість клітин (забарвлених та опалесцюючих) і визначають як загальну кількість клітин, так і питому вагу опалесцюючих клітин. Як правило, питома вага життєздатних клітин збільшується у 2,5-3,5 рази. Отриману таким способом суспензію розносять по пробіркам, додають живильне 2 UA 69879 U 5 10 15 20 25 30 35 середовище, що містить різні дози хіміопрепарату. Контрольна проба культивується тільки у живильному середовищі. Пробірки переносять у термостат (37 °C, 5 % СО2). Через 24 години пробірки центрифугують, видаляють супернатант, до осаду додають 200 мкл живильного середовища, обережно перемішують і проводять підрахунок (за допомогою 0,2 %-ого розчину трипанового синього та камери Горяєва) загальної кількості клітин і питомої ваги опалесцюючих клітин. Цитотоксичну дію препарату визначають згідно з [4]. Спосіб, що пропонується, має переваги перед прототипом, бо суспензія клітин злоякісної гліоми звільнюється від мертвих клітин та клітин, що перебувають на заключних стадіях апоптичної загибелі (у прототипі життєздатність клітин у контрольних пробах суттєво коливалася і складала 63,8±20,88 %). Перевагою пропонованого способу є можливість уникати присутності гинучих та загиблих клітин у суспензіях, отриманих із злоякісних гліом, бо після нашарування на верографіні клітини, мембрана яких вже має отвори (гинучі і загиблі клітини) і через які верографін входить у внутрішньоклітинний простір, збільшують свою вагу і вони при центрифугуванні осідають на дно пробірки. Це дозволяє отримати з шару клітин, які залишаються на градієнті (ці клітини мають збережену мембрану і вагу, відповідну щільність 1,078), суспензію клітин злоякісної гліоми, яка містить 85,0-95,0 відсотків життєздатних клітин. Дослідження клітинної суспензії з високим вмістом збережених та життєздатних клітин відповідає існуючим вимогам клітинної біології і значно підвищує точність дослідження. В порівнянні із найближчим аналогом, запропонований спосіб має ряд переваг: підвищує точність визначення цитотоксичної дії препарату; прискорює проведення дослідження; здешевлює фінансові витрати при проведенні досліджень; спрощує процедуру дослідження цитотоксичної дії протипухлинного препарату. Джерела інформації:: 1. Главацький О.Я. Диференційоване лікування гліом супратенторіальної локалізації та прогнозування його результатів: Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук. - Київ, 2001. - 476 с. 2. Васильєва И.Г., Розуменко В.Д., Главацький А.Я., Олексенко Н.П., Таланта Е.С., Чопик Н.Г., Цюбко О.И., Вашуленко Т.Н. Исследование пролиферативного потенциала глиом человека в краткосрочной культуре для определения чувствительности к антибластическим химиопрепаратам //Укр.нейрохирург. журн. - 2005. - № 4. - с. 19-24. 3. Олейник Г.М. Прогнозирование активности противоопухолевых средств при злокачественных опухолях головного мозга // Автореферат дисс. на соискание ученой степени канд.биол.наук. - Москва, 1986. - 26 с. 4. Лісяний М.І., Бельська Л.М., Ключникова АЛ. Імуномодулююча та протипухлинна дія препаратів чистотілу на пухлини головного мозку //Укр. нейрохирург. журн. - 2011. - № 1. - с. 1924. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 45 50 55 60 Спосіб визначення in vitro чутливості клітин злоякісних гліом головного мозку до цитотоксичної дії хіміопрепарату, який відрізняється тим, що після встановлення діагнозу, під час оперативного втручання проводиться вилучення тканини злоякісної гліоми головного мозку хворого, фрагмент біоптату ріжуть лезом або ножицями на невеликі частинки, механічно дезагригують за допомогою піпеток або голок і шприца, звільнюють суспензію від крупних фрагментів, відмивають клітини центрифугуванням у живильному середовищі, готують 6 суспензію клітин стандартної концентрації 5×10 в 1 мл, далі нашаровують на 1,0-2,0 мл верографіну 2,0-4,0 мл суспензії клітин, отриманих з біоптату, та центрифугують 15 хвилин на настільній центрифузі при кількості обертів - 3000 за хвилину, пробірки виймають з ротора центрифуги, на рівні розподілу фаз градієнт-суспензія проводять збір шару, у вигляді "хмаринки", клітин відповідної щільності і переносять у центрифужну пробірку, далі відмивають зібрані клітини 10-кратною кількістю живильного середовища, після центрифугування осад ресуспендують у 1,0 мл живильного середовища, проводять підрахунок кількості клітин, для цього змішують 400 мкл 0,2 % розчину трипанового синього та 20 мкл суспензії клітин, переносять краплину цього розчину в камеру Горяєва, рахують згідно з інструкцією кількість клітин забарвлених та опалесцюючих клітин і визначають як загальну кількість клітин, так і питому вагу опалесцюючих клітин, як правило, питома вага життєздатних клітин збільшується у 2,5-3,5 рази, отриману таким способом суспензію розносять по пробіркам, додають живильне середовище, що містить різні дози хіміопрепарату, контрольна проба культивується тільки у живильному середовищі, пробірки переносять у термостат при 37 °C, 5 % СО2, через 24 години 3 UA 69879 U пробірки центрифугують, видаляють супернатант, до осаду додають 200 мкл живильного середовища, обережно перемішують і проводять підрахунок загальної кількості клітин і питомої ваги опалесцюючих клітин за допомогою 0,2 %-ного розчину трипанового синього та камери Горяєва. 5 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4