Спосіб глибинного культивування вищих базидіоміцетів

Реферат: UA 74241 U UA 74241 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, а саме до способів культивування штамів базидіоміцетів і може бути використана в науково-дослідницьких та промислових мікологічних лабораторіях для вирощування штамів - активних продуцентів біологічно активних речовин (БАР). Базидіоміцети на сьогоднішній день розглядаються як потенційні джерела багатьох фізіологічно активних речовин, що можуть знайти широке застосування в різних галузях промисловості, сільського господарства та медицині [7, 9]. Швидко розвивається штучне культивування їстівних грибів, що потребує розширення їх видового складу та розробки нових методів культивування. Задля отримання біомаси та метаболітів, базидіоміцети культивують на твердих субстратах чи рідких середовищах поверхневим або глибинним методами. Дослідження показали, що за вмістом найважливіших БАР, в т.ч. антиоксидантів, глибинний міцелій не поступається плодовим тілам, а за накопиченням білків, ліпідів, полісахаридів і каротиноїдів перевищує їх [1, 7]. Глибинне культивування має ряд переваг в порівнянні з поверхневим: економічно більш вигідне, надає можливість масштабування біотехнологічного процесу та керування ним. Міцеліальна культура розвивається в однакових повністю контрольованих умовах, що забезпечують фізіологічні потреби гриба. Крім того, механічне перемішування середовища і аерація сприяють максимальному росту міцелію і накопиченню продуктів метаболізму. Стає можливим абсолютне дотримання стерильності на всіх етапах ферментаційного процесу. Все це дозволяє скоротити тривалість процесу, підвищити вихід продукту з сировини та отримувати однорідну стандартизовану продукцію високої якості iз заданими властивостями, що гарантує ефективність та безпечність одержуваних препаратів цільового призначення [1, 2]. Отже, існує необхідність створення простих й ефективних способів культивування базидіоміцетів, які не потребують дорогого обладнання і можуть бути застосованими в науководослідницьких та промислових мікологічних лабораторіях для вирощування штамів - активних продуцентів БАР. Відомий спосіб вирощування грибів-лігноксилотрофів, який включає виготовлення посівного зернового міцелію на основі районованих штамів маточних культур грибів; інокуляцію посівним міцелієм отворів, які розташовані по периметру та на торці відпилу деревини листяних порід; інкубацію відпилів для проходження вегетативної стадії в приміщенні при температурі 12-16 °C, відносній вологості 80-90 %, перенесення відпилів в природні умови для плодоношення, причому гриби вирощують у збірних блоках, які складаються з основного та додаткових відпилів деревини з фіксацією їх один на одному, а інокуляцію міцелієм здійснюють в отвори основного відпилу та пошарово на торцях кожного додаткового відпилу [3]. Спосіб є трудомістким і довготривалим, та не передбачає створення контрольованих умов культивування протягом всього процесу ферментації, що унеможливлює його застосування в промислових умовах. Відомий спосіб культивування базидіальних грибів Pleurotus ostreatus та Laetiporus sulphureus в глибинній культурі на лабораторній установці, яка складається з магнітної мішалки та посудини об'ємом 1 л з 250 мл культуральної рідини. Процес проводять в стерильних умовах на крохмаль-амонійному середовищі (вміст крохмалю 1 і 1,5 %) при 27±2 °C і рН 5. Над середовищем при невеликому надлишковому тиску продувають стерильне повітря в об'ємі 40 л в год. на 1 л середовища. Як посівний матеріал використовують міцелій, вирощений на агаризованому живильному середовищі в чашках Петрі [6]. Недоліками способу є застосування складного лабораторного обладнання та інокуляту міцелію, вирощеного на твердому агаризованому середовищі, що потребує часу для адаптації гриба до нових умов і подовжує термін ферментації. Відомий спосіб глибинного культивування базидіоміцету Grifola frondosa. За цим способом, посівні культури вирощують в колбах об'ємом 250 мл, що містять 50 мл середовища наступного складу, г/ л: глюкоза - 30,0; дріжджовий екстракт - 6,0; поліпептон - 2,0; MgSO4  7Н2О -0,5; K2НРО4 - 0,5 і MnSO4  5Н2О - 0,2. Середовище інокулюють пластинкою агару діаметром 5мм з чашок Петрі і культивують в ротаційному інкубаторі з частотою 120 об./ хв. при 25 °C протягом 7-ми діб. Глибинне культивування проводять на експериментальному середовищі об'ємом 100 мл, що міститься в колбах на 500 мл або в 5-літрових ферментерах (з мішалкою або барботуванням). Інокулюм складає 3 % за об'ємом. Процес проводять при 25 °C протягом 13 діб [8]. За цим способом використовується неоднорідна гранульована посівна культура, яка складається з пелетів різного розміру, що при інокуляції невеликих об'ємів живильного середовища позначається на точності дозування міцелію. Окрім того, мала кількість осередків росту в середовищі негативно впливає на ріст та розвиток культури продуцента. Найбільш близьким за технічною суттю і досяжності результату є спосіб глибинного культивування базидіоміцетів роду Coriolus, який складається з наступних етапів. Глибинним 1 UA 74241 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 методом вирощують посівний матеріал. Отриманий міцелій гомогенізується до однорідної суспензії за допомогою такого обладнання, як гомогенізатор, гомоблендер, дисперсійний міксер тощо, при 3000-6000 об./хв. протягом 30 с. - 10 хв. Це зменшує необхідну кількість посівного матеріалу з 0,3-1,0 г/л до 0,01-0,2 г/л (бажано 0,05-0,15 г/л) [4]. Недоліками способу є необхідність застосування додаткового обладнання для гомогенізації інокуляту до стану суспензії, збільшується ризик деструкції клітин і контамінації посівного матеріалу. В основу корисної моделі поставлена задача розробки способу глибинного культивування вищих базидіоміцетів з метою одержання їх біомаси та культуральної рідини, що дозволяє скоротити час культивування та знизити вартість цільових продуктів. Поставлена задача вирішується тим, що в способі глибинного культивування вищих базидіоміцетів включає двостадійне культивування штамів базидіоміцетів з гомогенізацією інокулюму перед другою (основною) стадією, згідно з корисною моделлю, на першій стадії отримують чистий гомогенізований інокулюм шляхом сумісного культивування та гомогенізації на глюкозо-пептонному середовищі об'ємом 50 мл в колбах ємністю 250 мл з розташованими на стінці відбійниками спеціальної шилоподібної форми протягом 7-ми діб при оптимальній температурі для росту базидіоміцетів 24-28 °C на лабораторній качалці зі зворотнопоступальним рухом з частотою 120 коливань за хвилину та на другій стадії здійснюють основний етап культивування шляхом внесення 10 % за об'ємом інокулюму в стерильне живильне середовище в колбах без шилоподібних відбійників та інкубації за необхідних для процесу умов в глибинній культурі на лабораторній качалці протягом встановленого часу. Спосіб заснований на тому, що завдяки обтічній формі відбійників міцелій щадливо гомогенізується під час нарощування біомаси протягом першої 7-ми добової стадії культивування та складається з новоутворених фрагментів однакової маси, що знаходяться в активній фазі росту. Завдяки чому після інокуляції міцеліальні клітини не є ушкодженими та здатні до швидкого засвоєння субстрату і росту під час другої стадії ферментації. Поєднання на першій стадії в одній ємності функцій місця культивування та гомогенізатора дозволяє не використовувати додаткове обладнання і, таким чином, спростити процедуру культивування та зберегти чистоту мікологічного матеріалу. Однакова маса фрагментів міцелію в активній фазі росту забезпечують стабільні біосинтетичні показники під час другої стадії ферментації при оптимальному співвідношенні інокуляту і живильного середовища, яке складає 10 % за об'ємом. Розроблений спосіб, порівняно з прототипом, є економічно більш вигідним завдяки використанню невеликих об'ємів для культивування і як наслідок, меншу витрату компонентів середовища та енергозатрат на підтримання температури, перемішування та інших параметрів, необхідних для росту продуцента. При цих умовах на першій стадії міцелій досягає оптимальних параметрів для пересіву на 7-му добу культивування. Тривалість та умови другої стадії можуть відрізнятися від запропонованих в залежності від цілей експерименту та індивідуальних характеристик штаму-продуценту. Приклад конкретного виконання 1. В цьому прикладі описується перша стадія культивування - підготовка чистого глибинного гомогенізованого інокулюму. Попередньо відібраний біосинтетично активний штам базидіоміцету, наприклад Flammulina velutipes F-11 культивують з метою отримання інокулюму за наступною схемою. Готують ГПС наступного складу, г/л: глюкоза 10,0 пептон 3,0 KН2РО4 0,6 K2НРО4 0,4 0,5 MgSO47H2O СаСl2 0,05 0,001 ZnSO47H2O дистильована вода до 1 літра. Співвідношення C:N дорівнює 13:1. рН становить 6,74. Треба враховувати, що склад живильного середовища та рівень рН можуть мати відмінні від вказаних значення для культивування різних штамів-продуцентів. Підготовлене живильне середовище розливають по 50 мл в колби з шилоподібними відбійниками ємністю 250 мл та стерилізують в автоклаві при 126±2 °C протягом 45 хвилин. Кислотність середовища після стерилізації складає 6,62. Після охолодження середовище інокулюють у стерильних умовах шматочком міцелію розміром 5×5 мм з робочої культури. Інокулюмом є чиста культура штаму F-11, яка росла 7-10 2 UA 74241 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 діб на 4° за Баллінгом агаризованому незахміленому пивному суслі або на картопляноглюкозному агарі [5]. Культивування здійснюється глибинним методом при оптимальній температурі для росту Flammulina velutipes F-11 - 25 °C на лабораторній качалці зі зворотно-поступальним рухом з частотою 120 коливань за хвилину протягом 7-ми діб. Треба враховувати, що температура культивування може мати відмінне від вказаного значення для вирощування різних штамівпродуцентів. Оптимальний режим роботи лабораторної качалки визначено експериментально для встановлених умов і мети ферментації. Приклад конкретного виконання 2. В цьому прикладі описується визначення основних характеристик (відсутність сторонньої мікрофлори, абсолютно суха біомаса) глибинного гомогенізованого інокулюму (посівного матеріалу) штамів. Визначення проводять за наступною схемою. Проводять контроль чистоти інокулюму за допомогою світлового мікроскопа, наприклад XS5520 MICROmed. Невелику кількість культуральної рідини асептично вилучають з колби, переносять на предметне скло, висушують, фіксують та забарвлюють розчином метиленового синього, промивають, сушать та мікроскопують при збільшенні 16×100. Розглядають септований міцелій, виявляють пряжки, характерні для базидіоміцетів; констатують відсутність бактеріальних клітин. Вимірюють концентрацію сухої біомаси міцелію в інокуляту. Для цього визначений об'єм посівного матеріалу (5-10 мл) асептично поміщають на щільну капронову тканину, промивають дистильованою водою, висушують у відкаліброваних бюксах при 105 °C до постійної маси та зважують. Наприклад, абсолютно суха біомаса інокулюму Flammulina velutipes F-11 становить 2,14 г/л. Приклад конкретного виконання 3. В цьому прикладі описується основна стадія культивування штаму-продуценту БАР. Культивування проводять за наступною схемою. Для здійснення основної стадії культивування F. velutipes F-11 використовують колби без відбійників ємністю 250 мл зі стерильним ГПС об'ємом 50 мл. Готують, розливають та стерилізують ГПС за прикладом конкретного виконання 1. У культиваційні колби асептично вносять 5 мл інокулюму за допомогою стерильної піпетки з бавовняним фільтром. Термін культивування глибинним методом складає 6 діб при 25 °C на лабораторній качалці зі зворотно-поступальним рухом з частотою 120 коливань за хвилину. Наприкінці ферментації міцелій F. velutipes F-11 має вигляд пелетів сферичної форми жовтуватого кольору діаметром 2-4 мм з ледве помітними міцелiальними радіальними тяжами по краю. Термін і температура культивування глибинним методом встановлюється експериментально для кожного окремого штаму-продуценту БАР. Об'єм живильного середовища залежить від мети культивування. Міцелій відділяють від культуральної рідини, отримуючи таким чином культуральний фільтрат. Водневий показник культурального фільтрату встановлюють потенціометричним методом, наприклад на рН-метрi "рН-150МИ". Міцелій промивають дистильованою водою, визначають концентрацію біомаси ваговим методом, за прикладом конкретного виконання 2. Досліди проводять у трикратній повторності. Отримані експериментальні дані обробляють з використанням Microsoft Excel та пакета програм для проведення статистичної обробки результатів біологічних експериментів. Наприклад, абсолютно суха біомаса F. velutipes F-11 наприкінці ферментації становить 3,34±0,14 г/л; рН культурального фільтрату - 6,36±0,03 од. Таким чином, запропонований спосіб глибинного культивування базидіоміцетів є доступним та легкоздійснюваним в науково-дослідницьких та промислових мікологічних лабораторіях для вирощування штамів - активних продуцентів БАР. Джерела інформації: 1. Бабицкая В.Г. Новые биологически активные добавки на основе глубинного мицелия базидиальных грибов / В.Г. Бабицкая, В.В. Щерба, Т.С. Гвоздкова // Успехи медицинской микологии. - 2006. - Т.7.- С. 178-180. 2. Винаров А.Ю. Ферментационная аппаратура для процессов микробиологического синтеза / А.Ю. Винаров, Л.С. Гордеев, А.А. Кухаренко, В.И. Панфилов / под ред. В.А. Быкова. - М., 2005. - 278 с. 3. Патент № 11025 Україна. Спосіб вирощування грибів-лігноксилотрофів / Фролов O.K., Кириченко В.В., Копійка В.В., Федотов Є.Р. МПК A01G 1/04, № u200503817; заявл. 22.04.2005; опубл. 15.12.05. // Бюл. № 12. 3 UA 74241 U 5 10 15 4. Патент № 4288555 United States. Method for the cultivation of Basidiomycetes / Yoshikumi C., Wada Т., Makita H., Suzuki K. U.S. Class: 435/254.1; 435/256.8; 435/30; 435/803, МПК C12N 1/14, № 823110; заявл. 09.08.1977; опубл. 08.09.1981 (прототип). 5. Соломко Е.Ф. Ріст окремих видів лікарських макроміцетів на поживних середовищах різного складу / Е.Ф. Соломко, М.Л. Ломберг, Н.Ю. Митропольська, О.В. Чоловська // Укр. ботан. журн.-2000. - Т. 57, № 2. - С. 119-125. 6. Уфимцева О.В. Получение биомассы мицелия грибов вешенки обыкновенной Р 05/88 Pleurotus ostreatus и серно-желтого трутовика LS 1-06 Laetiporus sulphureus в глубинных условиях / О.В. Уфимцева, П.В. Миронов // Хвойные бореальной зоны. - 2009. - 26, № 2. - С. 294-296. 7. Феофилова Е.П. Новые биотехнологии получения биологически активных веществ из мицелиальных грибов / Е.П. Феофилова // Успехи медицинской микологии. - 2007. - Т. 9. - С. 195-196. 8. Lee B.C. Submerged culture conditions for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides by the edible basidiomycete Grifola frondosa I B.C. Lee, J.T. Baea, H.B. Pyoa, T.B. Choeb, S.W. Kimc, H.J. Hwangc, J.W. Yunc // Enzyme and Microbial Technology. - 2004. - № 35. - P. 369-376. 9. Wasser S.P. Medicinal mushrooms: past, present and future / S.P. Wasser, K.M. Sytnik, A.S. Buchalo, E.F. Solomko // Ukr. Botan. Journ. - 2002. - 59, № 5. - P. 499-524. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 Спосіб глибинного культивування вищих базидіоміцетів, що включає двостадійне культивування штамів базидіоміцетів з гомогенізацією інокулюму перед другою (основною) стадією, який відрізняється тим, що на першій стадії отримують чистий гомогенізований iнокулюм шляхом сумісного культивування та гомогенізації на глюкозо-пептонному середовищі об'ємом 50 мл в колбах ємністю 250 мл з розташованими на стінці відбійниками спеціальної шилоподібної форми протягом 7-ми діб при оптимальній температурі для росту базидіоміцетів 24-28 °C на лабораторній качалці зі зворотно-поступальним рухом з частотою 120 коливань за хвилину та на другій стадії здійснюють основний етап культивування шляхом внесення 10 % за об'ємом інокулюму в стерильне живильне середовище в колбах без шилоподібних відбійників та інкубації за необхідних для процесу умов в глибинній культурі на лабораторній качалці протягом встановленого часу. Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4