Спосіб культивування базидіоміцетів

Способ культивирования базидиомицетов, предусматривающий выращивание грибного мицелия в аэробных условиях на питательной среде, содержащей сахарид в качестве источника углерода, минеральные соли и воду, о т л и ч а ю щийся тем, что осуществляют культивирование базидиомицета Pleurotus ostreatus (Fr.) Kummer до концентрации биомассы 12-22 г сухого вещества/л, в качестве сахарида используют крахмалсодержащее сырье, а в питательную среду дополнительно вводят ионы меди (Cu2f) в концентрации 1 10 4 - 1 10 3 г/л. Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам культивирования базидиальных грибов на жидких питательных средах, и может быть использовано для комплексной переработки сырья с получением из культуральной среды пищевой грибной биомассы и комплекса внеклеточных ферментов, включающего фермент монофенола-монооксигеназу (МФМО). Известны способы культивирования на разных питательных средах различных штаммов базидиального гриба Pleurotus ostreatus (Fr.) Kummer как продуцента грибной биомассы или фермента МФМО, выделяемых из культуральной среды (культуральной жидкости), в частности способ получения комплекса внеклеточных ферментов по ах. СССР №1084299, МКИ C12N9/02, 1984. По способу получения комплекса внеклеточных ферментов предусматривается культивирование базидиального гриба на питательной среде, включающей лигнинсодержащие отходы в качестве источника углерода, а именно агримус - отход производства фурфурола, минеральные питательные соли и воду. При культивировании мицелия гриба PI. ostreatus штамм HMBF 1300 активность внек неточного фермента МФМО изменялась от 17,5 до 56,0 ед. в 1 л культуральной жидкости в зависимости от состава среды. При культивировании того же гриба с целью получения пищевой биомассы на питательной среде, содержащей (г/л): кукурузную муку 20-40, кукурузный экстракт 15-30, (NH4)2SO4 1-2 и воду, накопление биомассы составляло 12,1-20,7 г сухого вещества (СВ) в 1 л. /""Ч I 26705 Известен способ культивирования базидиомицетов (Патент США № 42337233, МКИ C12N1/14), предусматривающий выращивание грибного мицелия в условиях аэрации в жидкой питательной среде, со- 5 держащей сахарид в качестве источника углерода, дрожжевой экстракт, пептон, казаминивую кислоту и/или мясной экстракт в качестве источника азота и неорганические соли. Способ обеспечивает 10 быстрый рост Basidiomycetes. Задачей изобретения является усовершенствование известного способа путем повышения активности фермента МФМО в культуральной жидкости без снижения на- 15 копления грибной биомассы. Причиной, препятствующей решению этой задачи в известном способе, является отсутствие в среде компонентов, способствующих повышению активности фер- 20 мента МФМО. Технический результат предлагаемого изобретения заключается в достижении большей активности синтезируемого внеклеточного фермента МФМО в культураль- 25 ной среде. Технический результат достигается тем, что по заявленному способу осуществляют- выращивание мицелия Pleurotus ostreatus (Fr.) Kummer до кон- 30 центрации биомассы 12-22 г сухого вещества/л в аэробных условиях в жидкой питательной среде, содержащей минеральные соли, воду, крахмал содержащее сырье в качестве источника углеро- 35 да, а также ионы меди (Си2+) в концентрации 1 10'4 - 1 10 3 г/л в качестве стимулятора активности фермента. Ввод в питательную среду ионов меди (Си++) способствует увеличению активнос- 40 ти фермента, так как ион меди входит в состав его активного центра. При недостатке в среде ионов меди активность фермента существенно не увеличивается. Оптимальным содержанием ионов меди в 45 питательной среде является 1 Ю-4 - 110 3 г/л. Источником меди служит соль CuSO45H2O. Концентрация меди выше 10010 5 г/л не обеспечивает значительного увеличения активности фермента в куль- 50 туральной среде. Активность фермента в среде возрастает по мере накопления активно растущей биомассы гриба. Поэтому накопление в среде биомассы менее 10-12 г/л 55 (по сухому веществу) практически нецелесообразно. Экспериментально установлено также, что для достижения накопления биомассы более 25-30 г/л требуется большая продолжительность процесса культивирования, а активность фермента в среде существенно не повышается изза снижения скорости роста биомассы вследствие лимитирования ее по кислороду. Оптимальной концентрацией биомассы для получения высокой активности фермента в среде является 12-22 г/л (по сухому веществу). При этом в качестве источника углерода в питательной среде используют крахмалсодержащее сырье, что упрощает осуществление способа благодаря 'доступности этого сырья и удешевляет его. Предлагаемый способ культивирования базидиального гриба Pleurotus ostreatus поясняется конкретными примерами при выращивании штамма 1300 в колбах на качалке. П р%и м е р 1. Посевной мицелий гриба Pleurotus ostreatus 1300 выращивают поверхностным методом в колбах на жидком пивном сусле (4% СВ) в течение 7 суток при температуре 26°С. Готовят питательную среду следующего состава, г/л: кукурузный крахмал 20,0; кукурузный экстракт 15,0; аммоний сернокислый 1,0; однозамещенный фосфат калия 0,6; двузамещенный фосфат калия 0,6; сульфат магния 0,26; ионы меди (Си+>) в виде сернокислой меди в количестве: 0 (контроль), 5 10 5 ; 10 Ю-5; 25 10 5 ; 50 10 5 , 100105 ; рН среды доводят 30%-ным раствором гидроокиси натрия до 6,3. Среду разливают по 100 мл в колбы вместимостью 0,75 л, автоклавируют при температуре 126°С в течение 1,5 ч, охлаждают. Значение рН после стерилизации 6,0. Измельченный встряхиванием в колбе поверхностный мицелий гриба стерильно вносят в колбы с питательной средой в количестве 10 мл. Начальная концентрация биомассы составляет 0,8 г/л по абсолютно сухому веществу (АСВ). Культивирование осуществляют глубинным способом в условиях круговой качалки (220 об/мин) при температуре 26°С. Через 72 ч биомассу отфильтровывают и тщательно промывают водой на капроновом сите. Выращенный мицелий имеет вид мелких пушистых шариков диаметром 1 -3 мм светло-коричневого цвета с выраженным грибным ароматом. Полученную культуральную жидкость (фильтрат) центрифугируют при 3000 об /мин в течение 10 мин и используют для получения фермента. В культуральной жидкости определяют активность монофенол-монооксигеназы по методу Бояркина с бензидином в модификации Института ботаники АН Украины. 26705 Данные, характеризующие зависимость активности монофенол-монооксигеназы от концентрации иона меди в среде с кукурузным крахмалом (20 г/л ) и накопление биомассы, приведены в табл.1. П р и м е р 2. выращивают мицелий гриба аналогично примеру 1. Готовят питательную среду следующего состава, г/л: кукурузная мука 20,0; кукурузный экстракт 15,0; аммоний сернокислый 1,0; медь в виде сернокислой соли, г.Ю'Ул: 0 (контроль), 10,50,100,500; рН среды доводят 30%-ным раствором гидроокиси натрия до 6,7. После автоклавирования рН среды 6,5. Данные, характеризующие зависимость активности монофенол-монооксигеназы от концентрирования меди в среде с кукурузной мукой (20 г/л) и накопление биомассы приведены в табл. 2. П р и м е р 3. Выращивание мицелия гриба осуществляют аналогично примеру 1 в течение 96 ч. Готовят питательную среду следующего состава, г/л: кукурузный крахмал 40,0; 6 кукурузный экстракт 30,0; аммоний сернокислый 2,0; однозамещенный фосфат калия 0,6; двузамещенный фосфат калия 0,6; сульфат магния 0,5; медь в виде сер5 5 нокислой соли в количестве г.Ю" : 0 (контроль), 5,10,25,50,100. Данные, характеризующие зависимость активности монофенол-монооксигеназы от концентрации меди в среде с 10 кукурузным крахмалом (40 г/л) и накопление биомассы, приведены в табл. 3. Таким образом, осуществление предлагаемого способа обеспечивает увеличение активности монофенол-монооксиге15 назы в 10-25 раз без снижения накопления биомассы при использовании различных крахмалсодержащих сред. Выращивание грибной пищевой био20 массы при высокой активности фермента монофенол-монооксигеназы в культуральной жидкости позволяет осуществить комплексную переработку сырья с получением двух продуктов, что снизит их себестои25 мость. Т а б л и ц а 0 10 25 50 100 370 890 920 1080 1090 10,4 Активность монофенолмонооксигеназы, ед/л Биомасса, абсолютно сухое вещество (АСВ), г/л 5 260 Си", г. 10 7л 10,9 10,9 10,9 11.1 11,1 т а б лица ++ 5 Си , г.10- /л 0 10 50 100 892 13,2 965 13,4 1018 12,0 1167 12,7 Т а 6 л и ц а Си , Г.10-7Л Активность монофенолмонооксигеназы, ед/л Биомасса, г АСВ/л 2 500 190 13,4 Активность монофенолмонооксигеназы, ед/л Биомасса, г АСВ/л ++ 1 0 5 10 25 50 100 510 18,7 720 22,3 1117 22,3 2330 21,6 2540 20,2 2540 20,5 Упорядник Техред М. Келемеш Замовлення 525 Тираж Коректор А.Маковська Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 3