Живильне середовище для виділення м. paratuberculosis з патологічного матеріалу

Реферат: Живильне середовище для виділення М. paratuberculosis з патологічного матеріалу містить калій фосфорнокислий однозаміщений, магній сірчанокислий, гліцерин, зелений малахітовий водний розчин, яєчну масу, натрій піровіноградний, кислоту амінооцтову, спиртовий екстракт маси M.scrofulaceum, воду дистильовану. UA 76004 U (54) ЖИВИЛЬНЕ СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ ВИДІЛЕННЯ М. PARATUBERCULOSIS З ПАТОЛОГІЧНОГО МАТЕРІАЛУ UA 76004 U UA 76004 U 5 10 15 20 25 30 35 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології для виготовлення живильних середовищ з метою виділення збудника паратуберкульозу з біологічного матеріалу та його ідентифікації і може використовуватися у ветеринарній медицині при встановленні діагнозу на паратуберкульоз, диференціальній діагностиці від інших видів мікобактерій. На сучасному етапі виділення М. paratuberculosis засновано на мікобактинзалежності, яка використовується як таксономічна характеристика цього виду мікобактерій. Для виділення збудника з патологічного матеріалу і культивування субкультур готують середовища, у склад яких додають похідну M.phlei-mycobactin J, або використовують готові стандартизовані поживні середовища імпортного виробництва з вмістом mycobactin J. Для ізоляції збудника паратуберкульозу з патологічного матеріалу існує стандартизоване живильне середовище Herrolds's, яке містить пептон; хлорид натрію; м'ясний екстракт; гліцерин; піруват натрію; агар; mycobactin J; яєчні жовтки; малахітовий зелений. У склад цього середовища входять дорогі антибіотики: хлорамфенікол, пеніцилін, амфотерицин В (ОІЕ Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals.-2004;ch.2. 2. 6. PARATUBERCULOSIS). Недоліком цього середовища є те, що воно не достатньо контрастне з кольором колоній збудника паратуберкульозу. У ветеринарній практиці також використовують модифіковане середовище Dubos's, в склад якого входять: касаміно кислоти (Difco), аспарагін, натрій фосфорнокислий 2-заміщений, натрій лимоннокислий, калій дигідрофосфат, магній сірчанокислий, гліцерин, Твін-80, агар, хлорамфенікол, пеніцилін, амфотерицин В, сироватка крові, mycobactin J (Smith H.W. Modification of Dubos's media for the cultivation of Mycobacterium johnei. J. Pathol. Bacteriol., 1953. № 66. -P. 375-381). Проте, відсутність яєць у цьому середовищі не дозволяє нейтралізувати залишки деконтамінуючих речовин, що використовуються при передпосівній обробці. Це негативно позначається на первинному виділенні мікобактерій з патологічного матеріалу. Крім того, основна проблема використання цих середовищ є їх висока вартість і складність придбання. Найбільш близьким до об'єкта, що заявляється, є середовище Левенштейна-Ієнсена, до складу якого входить L-аспарагін, калій фосфорнокислий 1-заміщений, магній лимоннокислий, магній сірчанокислий, гліцерин, яєчна маса, малахітовий зелений, mycobactin J (Jorgensen J.B. An improved medium for the culture of Mycobacterium paratuberculosis from faeces. Acta Vet. Scand., 1982. - № 23, P. 325-335). Це середовище може бути прототипом. Недоліком середовища є висока вартість імпортних складових: L-аспарагіна та mycobactin J. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити живильне середовище для виділення М. paratuberculosis з патологічного матеріалу, що містить калій фосфорнокислий однозаміщений, магній сірчанокислий, гліцерин, зелений малахітовий, яєчну масу, воду дистильовану шляхом додавання натрію піровіноградного, кислоти амінооцтової, спиртового екстракту маси M.scrofulaceum, при наступному співвідношенні компонентів: калій фосфорнокислий 1,0-2,0 г/л однозаміщений магній сірчанокислий, 0,1-0,2 г/л натрій піровіноградний 3,0-5,0 г/л кислота амінооцтова 4,0-6,0 г/л 3 гліцерин 20,0 - 40,0 см зелений малахітовий, 3 14,0 - 17 см 2 % водний розчин 3 яєчна маса 660,0 - 680,0 см спиртовий екстракт 3 4,0 - 6,0 см M.scrofulaceum 3 до 1000,0 см, щоб забезпечити ефективвода дистильована ність живильного середовища. 40 Живильне середовище для виділення M.paratuberculosis з патологічного матеріалу додатково містить спиртовий екстракт бактеріальної маси M.scrofulaceum - як фактор росту, натрій піровіноградний - як стимулятор росту, кислоту амінооцтову - як джерело азоту і вуглеводню. 1 UA 76004 U 5 10 15 20 25 30 Порівняльний аналіз запропонованого живильного середовища з прототипом дозволяє зробити висновок, що заявлений склад живильного середовища відрізняється заміною mycobactin J на спиртовий екстракт M.scrofulaceum, який має такі ж властивості та заміну імпортного L-аспарагіну на вітчизняну амінооцтову кислоту, заміну натрію лимоннокислого на натрій піровіноградний, що не відображається на якості середовища і дозволяє виділяти збудника паратуберкульозу, що відповідає критерію "новизна". Середовище з запропонованим складом характеризується більш ростовими властивостями та збільшує кількість бактеріальної маси. Живильне середовище готують таким чином: Солі, гліцерин, амінооцтову кислоту розчиняють у дистильованій воді, автоклавують за режимом 1 атм. (121 °C-15 хвилин), охолоджують до кімнатної температури, додають гомогенізовану яєчну масу, вносять стерильний 2 % водний розчин малахітового зеленого, спиртовий екстракт M.scrofulaceum, ретельно перемішують, доводять рН до 5,8-6,0 лимонною 3 кислотою. Середовище розливають у пробірки по 4 см і коагулюють у вертикальному положенні за температури (89,5+0,5)°С протягом 60 хвилин. Для отримання спиртового екстракту культуру M.scrofulaceum вирощують в бутлях на рідкому середовищі Сотона протягом 30-40 діб у похилому положенні за температури (37,5+0,5)°С. Через 40 діб культивування бутлі з пишною, товстою плівкою інактивують за режимом 120 °C-60 хв. Інактивовану бактеріальну масу відділяють від культуральної рідини через паперовий фільтр, промивають стерильною дистильованою водою від залишків середовища Сотона і висушують на пергаментному папері у термостаті за температури 45 °C. Після того, як бактеріальна маса висохне, її зіскрібають стерильним скальпелем з паперу в стерильну ступку і розтирають в порошок. Спиртовий екстракт з M.scrofulaceum готують таким 3 чином: 20,0 г сухої бактеріальної маси 3 рази екстрагують у 100 см етилового спирту у флаконі (колбі) за температури (97+1)°С у сушильній шафі до зменшення об'єму спирту до 1-2 см над рівнем бактеріальної маси. Отримані порції екстракту збирають піпеткою і випаровують до 4,03 6,0 см , додають до 1000,0 см яєчного середовища. Перед висівом середовище перевіряють на стерильність шляхом витримування у термостаті за температури (37,5+0,5)°С впродовж 3 діб. Приклад № 1. Живильне середовище готують як вказано вище, при наступному співвідношенні компонентів: калій фосфорнокислий однозаміщений магній сірчанокислий натрій піровіноградний кислота амінооцтова гліцерин зелений малахітовий, 2 % водний розчин яєчна маса спиртовий екстракт M.scrofulaceum вода дистильована 1,0 г/л 0,10 г/л 3,0 г/л 4,0 г/л 3 20,0 см 14,0 см 3 660,0 см 3 3 4,0 см до 1000,0 см. 3 Приклад № 2. Теж, що і в прикладі № 1 при наступному співвідношенні компонентів: калій фосфорнокислий однозаміщений магній сірчанокислий натрій піровіноградний кислота амінооцтова гліцерин зелений малахітовий, 2 % водний розчин яйця курячі спиртовий екстракт M.scrofulaceum вода дистильована 1,50 г/л 0,15 г/л 4,0 г/л 5,0 г/л 3 30,0 см 15,0 см 3 3 670,0 см 3 5,0 см 3 до 1000,0 см. 35 Приклад № 3. Теж, що і в прикладі № 2 при наступному співвідношенні компонентів: 2 UA 76004 U калій фосфорнокислий однозаміщений магній сірчанокислий натрій піровіноградний кислота амінооцтова гліцерин, зелений малахітовий, 2 % водний розчин яєчна маса спиртовий екстракт M.scrofulaceum вода дистильована 5 10 15 20 25 1,54 г/л 0,15 г/л 5,0 г/л 6,0 г/л 3 40,0 см 16,0 см 3 680,0 см 3 3 6,0 см до 1000,0 см. 3 Елективні властивості живильного середовища визначають шляхом висіву контамінованого біологічного матеріалу (фекальні маси) референтним штамом M.Johnei після передпосівної обробки, за часом появи перших колоній та інтенсивності росту. Швидкість (діб.) та інтенсивність (+) росту M.Johnei на середовищі, що заявляється, і середовищі ЛевенштейнаІєнсена (Л-І) з mycobactin J наведені в таблиці. З матеріалів таблиці видно, що на запропонованому середовищі з оптимальним (приклад № 2), максимальним (приклад № 3) вмістом компонентів ріст перших колоній M.Johnei (від 1 до 3) спостерігали на 25 добу у вигляді дрібних (до 1,0 мм), білого кольору колоній. Первинний ріст колоній на середовищах з мінімальним складом компонентів (приклад № 1) і ЛевенштейнаІєнсена виявляли на п'ять діб пізніше. Ріст M.Johnei на середовищі (приклад № 1) був найменш інтенсивний, після 50 діб культивування кількість колоній не перевищувала 10-20, на цьому їх ріст призупинився. Інтенсивність росту колоній на середовищах (приклад № 3) і ЛевенштейнаІєнсена була однаковою, і на 50 добу спостереження кількість колоній становила від 20 до 50 і більше не зростала. Розмір колоній на середовищах з мінімальним, максимальним складом компонентів і Левенштейна-Ієнсена не перевищував 2 мм. Середовище з оптимальним вмістом компонентів (приклад № 2) забезпечувало найбільше накопичення бактеріальної маси, так на 50 добу культивування ріст колоній спостерігали по всій поверхні середовища, розмір колоній становив від 1 до 3 мм. На 90 добу окремі колонії зливались, розростались по горизонталі і вгору, набували складчастість. Таким чином, запропоноване живильне середовище (приклад № 2) є оптимальним для первинної ізоляції збудника паратуберкульозу з патологічного матеріалу, має високі елективні ростові властивості, його виготовлення не потребує імпортного mycobactin J та інших дорогих компонентів. Таблиця Живильне середовище для виділення М. paratuberculosis Запропоноване середовище Швидкість (діб,) росту 25 39 40 50 60 90 Примітка Середовище Л-І з mycobactin J Інтенсивність росту (+) Інтенсивність росту Приклад № 2 (+) Приклад № 1 (min) Приклад № 3 (min) (optim) + + + ++ + + + +++ ++ ++ ++ ++++ +++ +++ ++ ++++ +++ +++ ++ ++++ +++ +++ (-) - росту немає; (+) - від 1 до 10 колоній; (++) - від 10 до 20 колоній; (+++) - від 20 до 50 колоній; (++++) - ріст по всій поверхні середовища ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Живильне середовище для виділення М. paratuberculosis з патологічного матеріалу, що містить калій фосфорнокислий однозаміщений, магній сірчанокислий, гліцерин, зелений малахітовий 3 UA 76004 U 2 % водний розчин, яєчну масу, воду дистильовану, який відрізняється тим, що додатково містить натрій піровіноградний, кислоту амінооцтову, спиртовий екстракт маси M.scrofulaceum, при наступному співвідношенні компонентів: калій фосфорнокислий однозаміщений магній сірчанокислий натрій піровіноградний кислота амінооцтова гліцерин зелений малахітовий, 2 % водний розчин яєчна маса спиртовий екстракт M.scrofulaceum вода дистильована 1,0-2,0 г/л 0,1-0,2 г/л 3,0-5,0 г/л 4,0-6,0 г/л 3 20,0-40,0 см 3 14,0-17 см 3 660,0-680,0 см 3 4,0-6,0 см 3 до 1000,0 см . 5 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4