Штам соматичних структур макроміцету irpex lacteus fr. b-02 – продуцент ферменту тромболітичної дії

Штам соматичних структур макроміцету Irpex lacteus Fr. B-02 (зберігається в колекції кафедри фізіології рослин Донецького національного університету) - продуцент ферменту тромболітичної дії. (19) (21) u200903687 (22) 15.04.2009 (24) 26.10.2009 (46) 26.10.2009, Бюл.№ 20, 2009 р. (72) ЗАГНІТКО ЮЛІЯ ПЕТРІВНА, БОЙКО МИХАЙЛО ІВАНОВИЧ, КУЛІШ АЛІНА ДМИТРІВНА, ПЕТРАКОВА ОЛЕНА ОЛЕКСАНДРІВНА 3 44964 ру, міцелій щільний, пухнастий. На агаризованому середовищі Чапека-Докса ріст міцелію не зафіксований. Швидкість росту міцелію на глюкозокартопляному агарі при температурі 30±1°С складає 10,99±0,38мм за добу, на сусло-агарі 10,76±0,31мм за добу. Плодоношення на застосованих середовищах культивування не спостерігається. Мікроскопічні дослідження показали, що міцелій складається з гіллястих, щільно переплетених гіф з перегородками. Пряжки не виявлено. Ріст міцелію можливий в інтервалі температур 5–50 °С. Температурний оптимум росту гриба знаходиться в межах 30-35°С, біосинтетичний - 2832°С. В інших умовах (температура культивування 5-25°С та 40-50°С) ріст гриба різко знижується, а при температурі 5 та 50°С ріст гриба припиняється. На рідких вихідному та модифікованому глюкозо-пептонному середовищах утворює як поверхневий, так і занурений міцелій. Повітряних гіф мало. Культуральний фільтрат при рості протягом 30 діб не забарвлює. Фізіолого-біохімічні ознаки. При визначенні оптимальних джерел вуглецевого та азотного живлення головним критерієм було значення ТА культуральної рідини, скорочення терміну росту гриба для подальшого одержання ферментного препарату тромболітичної дії. Штам В-02 l. lacteus утилізує моно- (глюкоза, галактоза, ксилоза) та дисахариди (лактоза, сахароза) і спирти (маніт) з різною швидкістю. Найбільше накопичення біомаси спостерігалося на середовищі з глюкозою та сахарозою, а найменше на середовищі з манітом. Штам В-02 l. lacteus при культивуванні на рідкому живильному середовищі з зазначеними джерелами вуглецю виявляє різну тромболітичну та біосинтетичну активність в культурі. Вірогідно найвищі показники ТА спостерігаються на середовищі з глюкозою на 10 добу культивування. Вивчення впливу джерела азоту на ТА та біосинтетичну активність штаму показує, що лише на середовищі з пептоном відбувається активний синтез ферментів тромболітичної дії та високий рівень накопичення біомаси. Вивчення придатності для ферментоутворення неорганічного (амонійний, нітратний) та органічного (ферментативний пептон, сечовина, аспарагінова кислота) азоту показує, що рівень 4 тромболітичної та біосинтетичної активності на даних середовищах набагато нижче (в 2,5 - 20 разів), ніж на середовищі з пептоном. Приклад. Штам В-02 l. lacteus одержаний методом первинного відбору. Плодові тіла зібрані з засохлої деревини черешні. Чисту культуру штаму підтримують шляхом пересівів через кожні 3-5 місяців на агаризованому глюкозо-картопляному середовищі. Для виявлення ТА культуральної рідини штам В-02 l. lacteus культивують на рідкому глюкозопептонному середовищі наступного складу (г/л): глюкоза - 10; пептон - 3; СаСl2 - 0,05; КН2РО4 - 0,6; К2НРО4 - 0,4; MgSO4*7H2O - 0,5; ZnSO4*7H2O 0,001; дистильована вода - до 1 літра. Кислотність середовища після стерилізації становить 4 + 0,05 рН. Культуру вирощують у колбах Ерленмейера на 250мл з об'ємом середовища 50мл, поверхневим способом у термостатах при температурі 30±1°С. Посівним матеріалом служить 7-добова культура з глюкозо-картопляного агаризованого середовища. ТА культуральної рідини визначають на 5, 10, 15, 20, 25, 30 добу культивування. Визначення тромболітичної активності культуральної рідини проводили за методом Імшенецького та Броцької, який заснований на врахуванні часу лізису експериментально отриманих тромбів людини [2]. Субстратом була цитратна донорська кров однієї й тієї ж групи (II група, резуспозитивний), а реактивом - тромбін з активністю 100 од. в ампулі, який розводять у фізіологічному розчині з розрахунком, щоб в 1мл розчину знаходилось 25 одиниць. Тромби отримують при змішуванні 0,1мл крові та 0,1мл розчину тромбіну в пробірках Відаля. До утворених щільних тромбів додають по 2мл культуральної рідини, обережно струшують і розміщують в термостаті при температурі 37°С. ТА виражають у годинах розчинення згустку та в умовних одиницях. Перерахування ТА в умовні одиниці проводять за прописом Псурцевої та Денисової [5]: 24 - t ТА = ´ 50, t де t - час лізису тромбу, в г; 50 - нормований множник, отриманий з вибору граничних умов Результати наведено у таблиці: Таблиця Вік культури, діб ТА, умовних одиниць 5 94,4±6,8 10 114,3±8,7 Одержані результати свідчать про те, що штам В-02 l. lacteus активно синтезує у середовище фермент тромболітичної дії, найбільша кількість якого зафіксована на 10 добу культивування, коли ТА складає 114,3 у.о. Отже, штам В-02 l. lacteus у порівнянні з прототипом (штам С-11 І. lacteus) синтезує у живильне середовище набагато більшу кількість протеїназ тромболітичної дії, що є більш вигідним для подальшого дослідження його з метою одержання ферментного препарату тромболітичної дії. 15 88,9±6,8 20 56,1±3,7 25 47,4±3,1 30 23,5±1,8 Штам Irpex lacteus Fr. В-02 відправлений на реєстрацію до Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України. Джерела інформації, використані при складанні заявки. 1. Балабан Н.ІХ, Марданова A.M.. Маликова Л.А., Ильинская О.Н., Шарипова М.Р. Биосинтез субтилизиноподобной протеиназы Bacillus amyloliquefaciens H2 и биологические свойства фермента // Ученые записки Казанского государс 5 44964 твенного университета. Серия: Естественные науки. - 2008. - Т. 150, кн. 2. - С.81-90. 2. Имшенецкий А.А., Броцкая С.З. Селекция микроорганизмов, обладающих тромболитической активностью // Микробиология. - 1969. - Т. 38. №6. - С. 1403-1409. 3. Ицкович Е.Л., Лютова Л.И., Балабан Н.П., Марданова A.M., Шакиров Е.В., Шарипова М.Р., Лещинская И.Б., Руденская Г.Н. Тромболитические и антикоагулянтные свойства тиолзависимой сериновой протеиназы Bacillus intermedius 3-19 // Комп’ютерна верстка Л. Купенко 6 Вопросы медицинской химии. - №5. 1999. - С. 6873. 4. Пат. 33371 А України, МКВ С 12 N 9/58, С 12 N 1/14. Штам соматичних структур макроміцету Irpex lacteus Fr. C-l 1 - продуцент ферменту тромболітичної дії / В.М. Стадничук, М.І. Бойко, О.В. Пітькіна. Заявл. 16.02.1999.; Опубл. 15.02.2001., Бюл. №1. - 2с. (прототип). 5. Псурцева Н.В., Денисова Н.П Тромболитическая активность культур Flammulina velutipes (Fr.) Каrst. //Микология и фитопатология. - 1982. Т. 16. - №6.-С.518-521. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601