Штам соматичних структур макроміцету ніrsсніороrus laricinus (karst.) ryv. a-032 — продуцент молокозсідального ферменту

Винахід відноситься до ферментативної галузі мікробіологічної промисловості і становить новий штам соматичних структур макроміцета (вищого базидіального гриба) Hirschioporus laricinus (Karst.) Riv. A-032, який може використовуватись для отримання молокозсідального фермента як замінника сичужного фермента при виробництві сирів. Відомі штами вищих базидіальних грибів Amyloporia lenis (Karst.) Bond, et Sing., Mycena pura (Fr.) Kumm., що продукують молокозсідальні ферменти [6]. Однак активність цих штамів поступається активності запропонованого штама H.laricinus A-032. Розвиток біотехнології ферментів пов'язаний з подальшим пошуком нових штамів - продуцентів, що мають високі виробничі якості [2,4]. Найбільш близьким за технічною суттю та досяжному результату до об'єкта, що заявляється, є штам M-81 Hirschioporus laricinus (Karst.) Riv., який відноситься до сапротрофних дереворуйнівних грибів [1]. Молокозгортаюча активність (МЗА) культурального фільтрату (КФ) цього продуцента має найвище значення у віці культури 12 - 15 діб і становить 2,5хв (1600од/мл). В основі винаходу поставлено завдання використання штаму соматичних структур A-032 макроміцета Hirschioporus laricinus (Karst.) Riv., який виділено у чисту культуру на кафедрі фізіології рослин Донецького державного університету як такого, що виявляє високу молокозгортаючу активність у культурі і може бути використаний для синтезу протеїназ молокозсідальної дії і заміни сичужного фермента у виробництві сирів. Запропонований штам A-032 сапротрофного дереворуйнівного гриба H.laricinus (клас Basidiomycetes, порядок Aphillophoraies, родина Pofyporaceae) синтезує у навколишнє середовище екзофермент, що має високу молокозсідальну активність. Максимальне значення МЗА культурального фільтрату становить 100000од/мл. Молочний згусток, що утворюється, білого кольору, сторонніх запахів і присмаків не має. Штам A-032 синтезує молокозсідальний фермент на рідких поживних середовищах: мінеральному Чапека - Докса і пивне сусло-пептон. Штам A-032 H.laricinus зберігається у колекції чистих культур макроміцетів кафедри фізіології рослин Донецького державного університету і депонований у спеціальній колекції культур Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, колекційний номер 1075. Отриманий штам A-032 H.laricinus має наступні характеристики: Культурально-морфологічні ознаки. Штам A-032 плодових тіл у культурі не утворює. За мікроскопічними дослідженнями міцелій складається з розгалужених гіф із чіткими стінками і перегородками, що добре проглядаються. Досить часто зустрічаються анастомози, пряжки і утворюються хламідоспори. В природних умовах утворює поодинокі, віялоподібні, сидячі плодові тіла. І їх поверхня злегка повстяна, світло-сіра, гіменофор пластинчатий. На мінеральному живильному середовищі Чапека - Докса колонія біла, представлена, головним чином, зануреним міцелієм. Середня швидкість росту міцелій за добу при 30 - 32°C становить 8,83 + 0,17мм. Зворотня сторона колонії не пігментована. На агаризованому безхмілевому пивному суслі штам A-032 утворює пишний білий міцелій. Повітряний міцелій добре розвинутий. Середній лінійний ріст за добу при 30 - 32°C становить 11,75 + 0,12мм. Міцелій пишний, білий, достатньо щільний. Зворотня сторона колонії не пігментована. При 50°C ріст грибниці припиняється. На рідких глюкозо-пептонному і сусло-пептонному середовищах штам A-032 утворює у рівній мірі як поверхневий, так і занурений міцелій. Культуральний фільтрат не забарвлює. Фізіолого-бірхімічні ознаки. При визначенні кращих джерел вуглецевого і азотного живлення, критерієм придатності було значення МЗА КФ. Штам A-032 найліпше засвоює глюкозу і фруктозу, менше мальтозу, непридатна до культивування арабіноза. З поліцукрів краще засвоюються інулін та крохмаль. Штам A-032, що зростав на поживних середовищах з зазначеними джерелами вуглецю, синтезує молокозсідальний фермент різної активності. Вивчення придатності неорганічного азоту (нітратного, амонійного, сульфатного) і органічного (ферментативний пептон, сечовина, амінокислоти) показало, що тільки на середовищах, які містять пептон і аспарагін йде активне ферментоутворення. Завдання 1. Штам A-032 H.laricinus виділено із плодового тіла, що було зібрано зі стовбура зламаної сосни у штучному лісному масиві Краснолиманського лісгоспзагу Донецької обл., у жовтні 1992р. Культуру зберігали за методом обрідних пересівів на агаризоване пивне сусло і агаризоване глюкозо-картопляне середовище. Для виявлення молокозсідальної активності, штам A-032 культивували на глюкозо-пептонному середовищі слідуючого складу, г/л: глюкоза - 10,0; пептон - 3,0: K2HPO4 - 0,4; KH2PO4 - 0,6; MgSO4 ´ 7H2O - 0,5; ZnSO4 ´ 7H2O - 0,001; CaCl2 - 0,05; дистильована вода до 1л. Водневий показник, після стерилізації середовища, становив 3,4 - 3,5 pH. H.laricinus вирощували в колбах Ерленмейєра на 250мл, що вміщували 50мл живильного середовища; поверхневим способом при температурі 30 - 32°C, яка є оптимальною для росту даного гриба [3]. Посівним матеріалом була 10 - 15 добова культура, яку вирощували на вказаних агаризованих середовищах. МЗА визначали на 3-, 5-, 7-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30 добу вирощування гриба. Міцелій відділяли фільтруванням, а КФ використовували для визначення молокозсідальної активності за методом, запропонованим Каваї і Мукаї [7]. У 100мл цільного молока вносили 1мл 15% - го розчину CaCl2 і доводили кислотність за допомогою 10% - ної HCl до pH 6,0 - 6,1. В пробірки вливали по 10мл молока і розміщували у водяній бані при 5°C. Після нагріву, в дослідні пробірки вносили по 1мл КФ. Суміш перемішували і залишали на водяній бані. Про МЗА судили за часом зсідання молока в хвилинах. Розрахунок МЗА вели за формулою, запропонованою Тіпографом Д.Я. і Петіной ТА [5] де K - коефіцієнт розведення КФ; П - час зсідання молока, хв; 40 - середній час зсідання молока у виробництві сирів, хв. Отримані результати свідчать про те, що штам A-032 H.laricinus, починаючи з 3-добового віку, синтезує в середовище молокозсідальний фермент, активність якого становить 30хв. Потім йде поступове збільшення активності від 7хв у віці 5 - ти діб до 2,5хв у віці 7 - ми діб. Найвища активність спостерігається у віці 10 - ти діб і становить 0,5хв, потім активність зменшується до 1,25хв і залишається на такому рівні до 30 - ти діб культивування. Одержані результати свідчать про те, що активність КФ штаму A-032 залишається високою на протязі всього часу культивування та перевищує активність відомих штамів. Виявлена властивість може бути використана у промисловому культивуванні штама A-032 H.laricinus з метою отримання молокозсідального фермента. Запропонований штам продукує у середовище молокозсідальний фермент. Активність культурального фільтрату цього штама вище в 5 разів у порівнянні з прототипом H.laricinus штам M81.