Спосіб діагностики вірусу епштейн-барр

Реферат: Спосіб діагностики вірусу Епштейн-Барр включає відбір проби периферійної крові та пробопідготовку. При пробопідготовці кров змішують з антикоагулянтом, виділяють плазму шляхом центрифугування суміші, екстрагують ДНК вірусу Епштейн-Барр, яку піддають ампліфікації в умовах двоетапної полімеразної ланцюгової реакції. Реєструють кількість загальної ДНК за допомогою засобів гібридно-флуорисцентної детекції, в режимі реального часу, де на першому етапі детектують олігонуклеотиди, як зовнішні праймери матриці, які відбивають ділянку вірусної ДНК до отримання ампліфікату, а на другому - два внутрішні праймери матриці отриманого ампліфікату. Визначать число копій вірусу Епштейн-Барр, розраховують його концентрацію, відносно калібраторів, і діагностують реактивацію вірусу Епштейн-Барр. Якщо число копій концентрації вірусу Епштейн-Барр становить 200 копій ВЕБ/мл, концентрацію вірусу Епштейн-Барр розраховують за формулою: КВЕб=NкВЕб·КСЛ, копій ВЕБ/мл, де: КВЕб - концентрація ВЕБ відносно калібраторів, копій ВЕБ/мл; NкВЕб - число копій вірусу Епштейн-Барр, копій ВЕБ/мл; КСЛ - коефіцієнт за специфічність лотів. UA 83751 U (12) UA 83751 U UA 83751 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до досліджень або аналізу біологічних матеріалів особливими методами, до способів виділення, одержання ДНК і може бути використаною в інфекційній практиці, переважно в діагностиці ВІЛ-інфікованих. З досліджуваного рівня техніки відоме діагностування вірусу Епштейн-Барр (ВЕБ), що включає відбір периферійної крові, імуноферментний аналіз (ІФА) сироватки та визначення наявності інфекційного мононуклеозу за рівнями AT і АГ. Спосіб характеризується оперативністю [1]. Однак серологічний шлях дослідження проби є не досить точним і об’єктивним, оскільки наявність виявлених ВЕБ-антитіл часто не відповідає активності інфекційного процесу, а антитілогенез може порушуватись навіть з-поза пригнічення імунної відповіді. Приріст точності діагностування спостерігається у способі діагностики ВЕБ, де поряд з ІФА сироватки периферійної крові, Ig(A,M,G) додатково піддають непрямій імунофлюоресценції до вірусного капсидного і раннього АГ ВЕБ [2]. В іншій методиці, поряд з ІФА периферійної крові, на відбитках тканинних зрізів додатково досліджують показники гібридизації білків EBER1, EBER2, BHLFI шляхом "in situ" [3]. У способі діагностики захворювань, асоційованих з ВЕБ, у сироватці периферійної крові визначають рівні антитіл IgG і IgM до дифузних (EA-D) і обмежених (EA-R) компонентів раннього антигену ВЕБ [4]. Але, усі наведені тести є теж малоточними при оцінці активності запального процесу, а від того непридатні до встановлення реактивації ВЕБ. Це зумовлене кореляцією патологічної системи лише з AT і АГ, де AT може утворюватися відстроченим чином, без слідів початку інфекційного ґенезу. Інших об'єктів аналогічного призначення з досліджуваного рівня техніки не встановлено. В основу даної корисної моделі поставлена задача винайти спосіб діагностики вірусу Епштейн-Барр, застосування котрого сприяло б підвищенню точності дослідження шляхом виділення ДНК в умовах ампліфікації проби. Поставлена задача вирішується тим, що у способі діагностики вірусу Епштейн-Барр, що включає відбір проби периферійної крові та пробопідготовку, відповідно до корисної моделі, додатково при пробопідготовці кров змішують з антикоагулянтом, виділяють плазму шляхом центрифугування суміші, екстрагують ДНК вірусу Епштейн-Барр, яку піддають ампліфікації в умовах двоетапної полімеразної ланцюгової реакції, реєструють кількість загальної ДНК за допомогою засобів гібридно-флуорисцентної детекції, в режимі реального часу, де на першому етапі детектують олігонуклеотиди, як зовнішні праймери матриці, які відбивають ділянку вірусної ДНК до отримання ампліфікату, а на другому - два внутрішні праймери матриці отриманого ампліфікату, визначають число копій вірусу Епштейн-Барр, розраховують його концентрацію, відносно калібраторів, і діагностують реактивацію вірусу Епштейн-Барр, якщо число копій концентрації вірусу Епштейн-Барр становить 200 копій ВЕБ/мл, а концентрацію вірусу Епштейн-Барр розраховують за формулою: КВЕб=NкВЕб·КСЛ, копій ВЕБ/мл, де: КВЕб - концентрація ВЕБ відносно калібраторів, копій ВЕБ/мл; NкВЕб - число копій вірусу Епштейн-Барр, копій ВЕБ/мл; КСЛ - коефіцієнт за специфічність лотів. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються та технічним результатом полягає в наступному. Змішування крові з антикоагулянтом націлене на усунення можливості коагуляції досліджуваних зразків крові, а відтак посилює точність кінцевого результату. Виділення плазми шляхом центрифугування суміші здійснюють для екстрагування ДНК, як збудника ВЕБ. Ампліфікація виділеної ДНК передбачає утворення додаткових копій ділянок хромосомної ДНК, що містять певні гени або сегменти структурного гетеро-хроматину, з метою реєстрації відповіді кліток аналізату на полімеразноланцюгову реакцію (ПЛР), внаслідок посилення, збільшення нагромаджень копій певних нуклеотидної послідовності під час реакції, що пособляє істотно збільшити точність. ПЛР дозволяє визначити наявність збудника захворювання, навіть якщо у пробі присутня лише декілька молекул його ДНК. Чутливість ПЛР значно вища, ніж за імунохімічними та мікробіологічними методиками, а принцип дозволяє діагностувати наявність інфекцій зі значною антигенною мінливістю. Її специфічність для всіх вірусних, хламідійних, мікроплазмених, уреаплазмених і решти бактеріальних інфекцій сягає 100 %. Застосування ПЛР виявляє реактивацію навіть одиничних клітин ВЕБ, у т. ч. коли інші методи (серологічні, імунологічні, бактеріологічні, мікроскопічні тощо) залишаються до неї індиферентними. Реєструючи кількість загальної ДНК вірусу Епштейн-Барр за допомогою засобів гібриднофлуорисцентної детекції в режимі реального часу, перевершують точність кінцевого результату. 1 UA 83751 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Двоетапний характер детекції спрямований на визначення прицільно-кількісного навантаження, саме ВЕБ, що забезпечує високоточне діагностування його реактивації. Детектування олігонуклеотидів (на першому етапі), як зовнішніх праймерів матриці, що відбивають ділянку вірусної ДНК до отримання ампліфікату, сприяє виділенню нуклеїнові кислоти вірусної ДНК, що також збільшує точність дослідження. Синтетичні олігонуклеотиди є потужним інструментом в арсеналі молекулярної біології. Їх використовують як ДНК/РНКзонди, праймери ПЛР, у синтезі генів, секвенуванні нуклеїнових кислот (НК) у білково-нуклеїновій взаємодії тощо. Розвиток біотехнології та медицини викликав особливий інтерес до модифікованих олігонуклеотидів. Останні умовно поділяються на аналоги й кон'югати олігонуклеотидів. Кон'югати є продуктами ковалентного зв'язування олігонуклеотидів з іншими молекулами зі специфічними флуоресцентними, афінними та спіновими мітками, ліпофільними і транспортними групами, білками й пептидами, хімічними нуклеазами тощо. Аналогами ж називають олігонуклеотиди, що містять модифіковані елементи власної структури - гетероциклічні основи, вуглеводні залишки чи фосфодіефірні зв'язки. У контексті з антисенстехнологіями, кон'югація з певними молекулами здійснюється для покращення гібридизаційних і транспортних властивостей олігонуклеотидів. Модифіковані олігонуклеотиди цінні як для вивчення біологічних та фізико-хімічних властивостей нуклеїнових кислот, так і можливостями діагностичного і терапевтичного застосування в медицині (антисенсі антигентехнології тощо). Детектування двох внутрішніх праймерів матриці отриманого ампліфікату (на другому етапі) визначає число копій вірусу Епштейн-Барр, необхідних для обчислення математичної моделі та інтерпретації шуканих даних. Коефіцієнт (КСЛ) компенсує специфічність лотів, що збільшує точність інтерпретації вихідних значень КВеб. Застосування внутрішнього екзогенного контролю дозволяє контролювати основні етапи ПЛР-аналізу (виділення і проведення ампліфікації ДНК), з можливістю інтерпретації значень наявності/відсутності за перехрестом "кривої" флуоресценції з певною "поріговою лінією" розрахункової концентрації відносно калібраторів. Розвиток ВЕБ-інфекції розцінюється як клінічний прояв реактивації латентної інфекції і пов'язується зі стійким або транзиторним пригніченням клітинного імунітету. У осіб з вираженою імунною недостатністю можливо виникнення генералізованих форм ВЕБ-інфекції з ураженням центральної та периферичної нервової систем (розвиток менінгіту, енцефаліту, мозочкової атаксії, полірадикулоневритів), а також з ураженням інших внутрішніх органів (розвиток міокардиту, гломерулонефриту, лімфоцитарного інтерстиціального пневмоніту, важких форм гепатиту). Епідеміологічні та експериментальні дані припускають взаємопідсилюючу етіопатогенетичну роль вірусів ВІЛ і ВЕБ у розвитку В-клітинної неходжкінської лімфоми, Тклітинної лімфоми, ендемічної лімфоми Беркіта. Тому, сукупність відмінних ознак заявленої корисної моделі, щодо вирішення поставленої задачі, є суттєвою, оскільки перебуває у причинно-наслідковому зв'язку з перевершенням вищезазначеного технічного результату, характеризує обсяг правових прагнень заявника у повному обсязі, як невідомий з досліджуваного рівня техніки, визначається новою і поширюється на усі випадки його багаторазової реалізації. Для здійснення способу діагностики вірусу Епштейн-Барр застосовують ПЛР [5] і метод кількісного визначення ДНК ВЕБ з гібридно-флуорисцентною детекцією [6]. До ПЛР залучають набори реагентів "АмпліСеннс" (виробництва "EBV-Монітор", FL), з ® аналітичною чутливістю реагентів 200 копій/мл, автоматичну станцію "Nucli-SENS easy MAG" ("BioMerieux", FR), для екстрагування ДНК з плазми, і вакуумну систему "Vacuett" (з бузковою 6 % кришкою "EDTA"). Для діагностики вірусу Епштейн-Барр відбирають проби периферійної крові та проводять пробопідготоку. Для підвищення точності, шляхом виділення ДНК в умовах ампліфікації проби, за умов пропонованої корисної моделі, при пробопідготовці кров змішують з антикоагулянтом і виділяють плазму шляхом центрифугування суміші. З отриманої плазми виділяють ДНК ВЕБ і піддають її ампліфікації в умовах двоетапної ПЛР. Надалі, в режимі реального часу, реєструють кількість загальної ДНК ВЕБ за допомогою засобів гібридно-флуорисцентної детекції. На першому етапі детектують олігонуклеотиди, як зовнішні праймери матриці, які відбивають ділянку вірусної ДНК, до отримання ампліфікату, на другому - два внутрішні праймери матриці отриманого ампліфікату. Ампліфікацію ДНК ВЕБ реєструють у каналі флуоресценції JOE/Yellow, а ампліфікацію внутрішнього контролю в каналі FAM/Green. Визначають число копій вірусу Епштейн-Барр, розраховують його концентрацію, відносно калібраторів. Діагностують реактивацію вірусу Епштейн-Барр, якщо число копій концентрації вірусу Епштейн-Барр 2 UA 83751 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 становить 200 копій ВЕБ/мл. При цьому концентрацію вірусу Епштейн-Барр розраховують за формулою: КВЕб=NкВЕб·КСЛ, копій ВЕБ/мл, де: КВЕб - концентрація ВЕБ відносно калібраторів, копій ВЕБ/мл; NкВЕб - число копій вірусу Епштейн-Барр, копій ВЕБ/мл; КСЛ - коефіцієнт за специфічність лотів. За цих умов підвищують точність діагностики у 1,2-1,9 рази. Додатковими перевагами даного технічного рішення над об'єктами аналогічного призначення є високі оперативність, чутливість і специфічність. Для перевірки можливості використання даного способу у клінічній практиці були обстежені 100 ВІЛ-інфікованих хворих. Виділяли групу (60 хворих), у яких по клінічним показникам передбачали реактивацію ВЕБ-інфекції. При використані даного способу реактивація ВЕБінфекції була підтверджена у 56 хворих. Приклад. Хворий X., 36 років, звернувся до медичної установи КЗ МКЛ № 21 м. Дніпропетровська зі скаргами на загальну слабкість, головний біль, припухлість і біль у правій верхній повіці, кашель. Запідозрений абсцес означеної ділянки. Асиметрія обличчя, з-поза підшкірного запалення та ущільнення ділянки правої верхньої повіки. Проводили пункцію, наявність гнійних утворень відсутня. За серологічним обстеженням були виявлені ВІЛ-антитіла, ВЕБ, антитіла ЕА, Ig(G). Натще відбирали периферійну кров з ліктьової вени у пробірку, використовуючи одноразову 1 мм голку, та розміщували її у вакуумній системі "Vacuett®". У пробірку з пробою крові додавали антикоагулянт, які змішували плавним перевертанням пробірки. Плазму отримували шляхом центрифугування пробірки впродовж 20 хв., при кімнатній Т°С, 800-1600 g і 3000 об./хв. З отриманої плазми екстрагували ДНК ВЕБ шляхом її ампліфікації на основі ПЛР. До отримання ампліфікату в режимі реального часу визначали кількість загальної ДНК ВЕБ і детектували олігонуклеотиди, як зовнішні праймери матриці ділянки вірусної ДНК, з використанням гібриднофлуорисцентних засобів. Для екзогенного внутрішнього контролю, щодо виділення ДНК ВЕБ з плазми, проводили одночасно реакцію ампліфікації (мультиплекс-ПЛР) ділянки ДНК LMP-гену ВЕБ і штучно сконструйованого фрагменту ДНК, клонованого у фаг- з використанням гібриднофлуорисцентних засобів. Внутрішні праймери матриці ампліфікату досліджували на другому етапі, де визначали число копій ВЕБ. Розраховували концентрацію останнього відносно калібраторів. Через 6 год. діагностували реактивацію ВЕБ-інфекції, насамперед, асоційовану лімфому преорбітальних м'яких тканин правої очниці, оскільки значення шуканої концентрації становило 200 копій ВЕБ/мл: КВЕб=NкВЕб·КСЛ=850·1,2=1020 копій ВЕБ/мл, де КВЕб - концентрація ВЕБ відносно калібраторів, копій ВЕБ/мл; NкВЕб - число копій ВЕБ, копій ВЕБ/мл; КСЛ - коефіцієнт за специфічність лотів. Підвищення точності дослідження у 1,2-1,9 разів за умов пропонованого способу досягають шляхом виділення ДНК ВЕБ в умовах ампліфікації проби. На відміну від попередніх методик, що засновані на кореляції патологічної системи з АГ і AT, який утворюється відстроченим чином, без залишення слідів початку інфекційного ґенезу, заявлене технічне рішення є на порядок вищим, бо ґрунтується на реалізації прямої залежності концентрації ВЕБ від числа його копій у плазмі крові. Таким чином, запропоноване рішення задачі відповідає умові "промислова придатність", як таке, що може бути використаним в "інфекційній практиці", з перевершенням вищенаведеного технічного результату за допомогою засобів, які були відомі й поєднані з рішенням поставленої задачі за подією пріоритету. Характеристика заявленого способу, що зазначена у формулі корисної моделі, визначає відмінність його від об'єктів аналогічного призначення й допускає можливість набуття ним правового статусу як корисної моделі процесу. Використані джерела: 1. Hadar Т., Margalith M, et al. The significance of serum Ig M, Ig A and Ig G antibodies specific for EBV as determined by immunoperoxidase assay in the rapid diagnosis of infectious mononucleosis. Isr-J-Med-Sci. - 1995 (May). - 31 (5). - P. 280-283. 2. Shedd D., Angeloni A., et al. Detection of human serum antibodies to the BFRF3 EBV capsid component by means of a DNA-binding assay. J-Infect-Dis. - 1995 (Nov). - 172 (5). - P. 1367-1370. 3. Anagnostopoulos I, Hummel M, et al. Morphology, immunophenotype, and distribution of latently and/or productively EBV-infected cell in acute infectious mononucleosis: implications for the interindividual infection route of EBV.Blood. - 1995 (Feb). - 1. - 85 (3). - P. 744-750. 3 UA 83751 U 5 4. Method for diagnosis of Epstein Barr virus associated disease: Пат. № 030547WO / Smith Richard S., Parks Ellio D. (США). - № PCT/US1996/004377; заявл. 29. 03.96; опубл. 03.10.96. 5. Спосіб прогнозування ускладнених форм Епштейна-Барр вірусної інфекції: Пат. № 52447 А України, МПК G01N 33/68, А61В 10/00 / Мирошникова М.І., Казмірчук В.Є. (Україна); Національний медичний університет ім. Богомольця (Україна); заяв. 13.02.01; опубл. 21.05.02. 6. New peptide(s) derived from Epstein-Barr Virus receptor of В lymphocytes and related antibodies, useful for treatment and diagnosis of e.g. lymphoma and EBV-related autoimmune disease: Пат. № 2697845 Франції, МПК С07К 14/705 / Raymond Frade (Франція); Inst Nat Sante Rech Med (Франція). - № 013628; заяв. 20.03.98; опубл. 13.05.99. 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 Спосіб діагностики вірусу Епштейн-Барр, що включає відбір проби периферійної крові та пробопідготовку, який відрізняється тим, що додатково при пробопідготовці кров змішують з антикоагулянтом, виділяють плазму шляхом центрифугування суміші, екстрагують ДНК вірусу Епштейн-Барр, яку піддають ампліфікації в умовах двоетапної полімеразної ланцюгової реакції, реєструють кількість загальної ДНК за допомогою засобів гібридно-флуорисцентної детекції, в режимі реального часу, де на першому етапі детектують олігонуклеотиди, як зовнішні праймери матриці, які відбивають ділянку вірусної ДНК до отримання ампліфікату, а на другому - два внутрішні праймери матриці отриманого ампліфікату, визначать число копій вірусу ЕпштейнБарр, розраховують його концентрацію, відносно калібраторів, і діагностують реактивацію вірусу Епштейн-Барр, якщо число копій концентрації вірусу Епштейн-Барр становить 200 копій ВЕБ/мл, при цьому концентрацію вірусу Епштейн-Барр розраховують за формулою: КВЕб=NкВЕб·КСЛ, копій ВЕБ/мл, де: КВЕб - концентрація ВЕБ відносно калібраторів, копій ВЕБ/мл; NкВЕб - число копій вірусу Епштейн-Барр, копій ВЕБ/мл; КСЛ - коефіцієнт за специфічність лотів. Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4